細(xì)菌培養(yǎng)法與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)對妊娠晚期B族鏈球菌篩查的應(yīng)用價值比較

金嫻，樊春卉，譚萍，劉璇，陳芳

深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院(深圳, 518081)

0 引言

B族鏈球菌（GBS）通常會定植在女性陰道內(nèi)及腸道中，是誘發(fā)羊膜腔感染、早產(chǎn)及胎膜早破的高危因素[1]。另外，GBS能夠經(jīng)產(chǎn)道進(jìn)行垂直傳播，從而導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)GBS感染，并存在誘發(fā)新生兒敗血癥、肺炎及腦膜炎的風(fēng)險[2]。相關(guān)統(tǒng)計資料顯示[3]，孕婦感染GBS的發(fā)生率約為11%～32%，并且其中的39%～68%又會傳播給新生兒，圍生期的GBS感染會嚴(yán)重威脅母嬰生命安全。因此，對孕產(chǎn)期孕婦開展GBS感染篩查對于保證母嬰健康意義重大。以往多通過直接檢測孕婦陰道及肛門內(nèi)分泌物完成GBS感染的篩查，但檢出率相對較低，與發(fā)達(dá)國家20%～30%的檢出率相比還有一定差距[4]。因此，亟待尋求一種更加高效、準(zhǔn)確的檢測方案應(yīng)用于此，本次研究旨在明確實施傳統(tǒng)常規(guī)檢測前進(jìn)行標(biāo)本增菌培養(yǎng)對GBS感染檢出率的影響，報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本次研究對象均為接受GBS感染篩查的妊娠晚期孕婦，共計300例，納入時間介于2019年3月—2019年9月，產(chǎn)婦孕期介于35周～37周之間；年齡介于22歲～41歲之間，平均年齡為（29.72±1.30）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：孕周經(jīng)B超核實相符；一周內(nèi)無性生活；兩周內(nèi)無抗生素藥物治療史；不存在陰道流血癥狀；單活胎；孕婦對本研究知情同意；經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：取樣部位曾用藥、灌洗或使用過栓劑者；合并生殖道感染者；合并免疫系統(tǒng)疾病者；并發(fā)內(nèi)外科疾病者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

分別采集所有納入對象陰道、直腸分泌物作為檢測標(biāo)本，取材過程中首先擦去外陰分泌物，將2支拭子插入陰道下1/3部位，旋轉(zhuǎn)1周后完成陰道分泌物的采集。隨后將2支拭子于肛門插入，在肛門括約肌上2.5 cm處旋轉(zhuǎn)1周完成直腸分泌物的采集。最后將2支拭子放進(jìn)無菌管送檢。

1.2.2 增菌培養(yǎng)

將其中采集的一份標(biāo)本按照無菌操作方法置于選擇性肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，接種羊血脂平板培養(yǎng)基，分區(qū)劃線，于5%～10%CO2恒溫培養(yǎng)箱（35 ℃）中培養(yǎng)18 h留存，再另取一部分增菌培養(yǎng)18 h后的標(biāo)本以同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)18 h留存，共獲得三份不同時間段（增菌前、增菌18 h及增菌36 h）標(biāo)本。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)法檢測

取原始標(biāo)本及增殖培養(yǎng)18 h、36 h增殖液分別接種血平板，于5%～10%CO2恒溫培養(yǎng)箱（35 ℃）中培養(yǎng)，挑取可疑菌落做涂片實施革蘭染色鏡檢，革蘭染色陽性，觸酶試驗陰性，CAMP試驗陽性為GBS，GBS菌落特征表現(xiàn)為透光、灰白色、光滑、濕潤、凸起，化膿鏈球菌、無乳鏈球菌分別作為陰性、陽性對照，而后經(jīng)VITEK2全自動微生物鑒定系統(tǒng)檢測確認(rèn)。

1.2.4 PCR法檢測

取原始標(biāo)本加入1 mL生理鹽水振蕩混勻離心后去上清及及增殖培養(yǎng)18 h、36 h增殖液各1 mL離心后去上清，加入DNA提取液，100 ℃裂解10 min，12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，取上清5 μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系中加入內(nèi)參照系統(tǒng)將可能存在的假陰性結(jié)果排除，F(xiàn)Q-PCR法檢測陽性評價標(biāo)準(zhǔn)為CT指標(biāo)＜38 Hu且熒光信號曲線呈S形。

1.3 觀察指標(biāo)

對比細(xì)菌培養(yǎng)法與FQ-PCR法直接篩查及增菌培養(yǎng)18 h、36 h篩查GBS感染的檢出率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

以SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析整理研究數(shù)據(jù)，通過百分?jǐn)?shù)（%）的形式呈現(xiàn)GBS感染檢出率并行卡方檢驗，P＜0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩種檢測方法在增菌18 h、36 h后的檢出率均顯著高于直接檢測（P＜0.05）；FQ-PCR法直接檢測的檢出率顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)法（P＜0.05）；FQ-PCR法增菌18 h及36 h后的檢出率均高于細(xì)菌培養(yǎng)法，但組間差異無差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 細(xì)菌培養(yǎng)法與PCR法檢測GBS感染的陽性率對比[n(%)]Tab. 1 Comparison of positive rates of GBS infection by bacterial culture and PCR

3 討論

妊娠期孕婦受陰道pH值變化、機(jī)體免疫能力降低、體內(nèi)雌激素及孕激素水平升高等因素影響，往往會致使其陰道菌群出現(xiàn)失調(diào)情況，并最終為GBS感染及細(xì)菌增殖提供了便利條件［5-6］。相關(guān)研究指出［7］，分娩前4 h予以孕婦抗生素治療可大為降低新生兒感染GBS風(fēng)險，因此，如何對孕產(chǎn)婦GBS感染情況加以快速確診具有異常重要的臨床意義。

本次研究結(jié)果顯示，細(xì)菌培養(yǎng)法直接檢測、增菌18 h及36 h后檢測GBS感染的檢出率分別為2.33%、9.33%、10.67%，F(xiàn)Q-PCR法各時段檢出率分別為9.00%、12.67%、14.00%，兩種檢測方法增菌后的檢出率均顯著提升（P＜0.05）；FQ-PCR法直接檢測的檢出率顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)法（P＜0.05）；FQ-PCR法增菌18h及36h后的檢出率均高于細(xì)菌培養(yǎng)法，但組間差異無差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示PCR法各時段篩查GBS感染的陽性檢出率較之細(xì)菌培養(yǎng)法更高，且檢出率隨著增菌時間的延長明顯增加。通過分析可知，檢測過程中有多方面因素可能會對細(xì)菌培養(yǎng)法的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響［8］。其一，其他種類的細(xì)菌生長有可能會對GBS繁殖產(chǎn)生抑制作用，致使GBS有效細(xì)菌量不足，而增加培養(yǎng)難度，并導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性［9］；其二，標(biāo)本受環(huán)境溫度、保存條件等客觀因素的影響，存在GBS死亡情況，進(jìn)而造成漏診［10］。而FQ-PCR法檢出率高于細(xì)菌培養(yǎng)法的原因在于熒光PCR技術(shù)可通過擴(kuò)增獲取并增加特定的DNA片段，從而保證檢出率能夠有所提高［11］。同時擴(kuò)增后還能夠?qū)⑽⒘坎≡八劳鯣BS檢測出來，因此其敏感度相對更高，從而提高檢出率，因此篩查效率會更高［12］。此外，本研究中應(yīng)用先增菌再實施GBS篩查的方案，進(jìn)一步優(yōu)化常規(guī)檢測程序，將不同方案的積極作用充分優(yōu)化組合，促使總體檢出率得到了提升。

綜上所述，在增菌基礎(chǔ)上應(yīng)用細(xì)菌培養(yǎng)法或FQ-PCR法篩查GBS感染的陽性檢出率較之直接檢測均有所提高，且操作簡便，同時FQ-PCR法各時段的檢出率均高于細(xì)菌培養(yǎng)法，使感染孕婦可早期用藥治療，進(jìn)一步保證母嬰安全，優(yōu)化妊娠結(jié)局，值得推廣。