不同預處理方法對檢測食醋中丁酸含量的影響

劉青，田慧敏，邱一秀 ，朱立磊，宋元達

(1.山東理工大學 農業(yè)工程與食品科學學院，山東 淄博 255049；2.山東玉兔食品股份有限公司，山東 淄博 255300)

丁酸(butyric acid)又名酪酸，是一種揮發(fā)性短鏈脂肪酸，天然丁酸主要由丁酸梭菌屬(Clostridium)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、酪酸桿菌屬(Butyribacterium)、八聯(lián)球菌屬(Sarcina)和梭桿菌屬(Fusobacterium)等合成[1-2]。丁酸是人體大腸中產丁酸細菌的主要代謝產物，同時也是人腸道上皮細胞的主要營養(yǎng)物質[3]。據(jù)報道，丁酸及其鹽類具有預防和治療結腸癌、腸道菌群紊亂、急慢性腹瀉、潰瘍性結腸炎以及血紅蛋白病等功能[3-5]，并可以間接輔助治療肝損傷[6]。近年來，丁酸及其衍生物在食品、藥品、飼料等方面的應用逐漸被重視，具有良好的應用前景[7-8]。

建立精確度高、重復性好的丁酸定量分析方法是富丁酸功能性食品研發(fā)的前提條件。食醋是人們生活中必不可少的調味品，食醋發(fā)酵過程中各種微生物的代謝活動會產生種類豐富的有機酸，所以對人體有抗菌、抗癌、減肥、降壓、控制血糖等作用[9]，作為功能性食品已經(jīng)開發(fā)出蘋果醋、葡萄醋、苦蕎醋、柿子醋、紅棗醋、玫瑰醋等[10-17]多種產品。然而，由于普通食醋中丁酸含量極低，常常不被作為有機酸主要成分來測定，因此鮮有報道。目前高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)是食醋中有機酸檢測最常用的方法[18-24]。丁酸作為小分子有機酸，只有4個碳原子，極性較大，利用高效液相分析時，在常用的C18反相柱上保留效果較差，樣品中雜峰較多時，需要提高相對保留值才能獲得較好分離度，然而這往往對色譜柱和泵的使用壽命有影響。此外，液相具有維護費用高、流動相配制復雜、有機試劑消耗量大的特點，分析成本較高。本研究利用氣相色譜對食醋中的丁酸含量進行定量分析，對比3種不同預處理方法對食醋中丁酸提取效率的影響，旨在尋找一種最佳的預處理方法，為富丁酸食醋或其他功能性食品中丁酸的提取、分析及應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米醋、陳醋、香醋、小米醋和白醋從淄博當?shù)爻匈徺I；富丁酸醋由本實驗室制備。丁酸標準品(純度≥99.5%)， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙醚均為色譜純，德國Meker公司；乙酸鋅、氯化鈉、高氯酸、氫氧化鈉、磷酸、硫酸、無水硫酸鈉、亞鐵氰化鉀等均為分析純，國藥集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6890N氣相色譜儀(配有FID檢測器) ，美國安捷倫科技公司；DM-FFAP色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)， 迪馬科技；5810R型離心機，Eppendorf(艾本德)公司；LE3002E/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；QL-861型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；實驗室通風櫥，淄博豪邁實驗室裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜條件

色譜柱：DM-FFAP色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度100 ℃保持1 min，以3 ℃/min的速度升至160 ℃，再以10 ℃/min的速度升至240 ℃保持5 min。進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度260 ℃；載氣為氮氣，氮氣流速為40 mL/min，氫氣流速為60 mL/min，空氣流速為400 mL/min；進樣量為1 μL。

1.3.2 乙醚萃取法

丁酸屬于揮發(fā)性小分子有機酸，極易溶于水，但在水中的絕對濃度相對較低，不易被檢測，因此本實驗選用極性較強的乙醚作為提取溶劑。準確量取5 mL醋樣于50 mL離心管中，加入5 mL純水、1 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液和1 mL 30%乙酸鋅溶液，充分渦旋振蕩后靜置5 min，4 000 r/min離心5 min；然后將上清液轉移至100 mL分液漏斗，加入20 mL乙醚，充分振蕩后靜置，收集乙醚層，剩余水層用20 mL乙醚分別提取兩次，合并乙醚相于200 mL旋蒸瓶中，30 ℃減壓旋蒸至剩余1 mL左右，轉移濃縮液，加少量純乙醚清洗旋蒸瓶壁，將清洗液與濃縮液合并，用乙醚定容至2 mL。待測液用0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣。

1.3.3 甲酯化-正己烷法

甲酯化是廣泛應用于有機酸的衍生化方法，因為有機酸的極性很強且熱穩(wěn)定性又較低，所以通常要將這些酸轉化為弱極性的酯類衍生物，以增大揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性，便于進行氣相色譜分析。本方法在林楊[25]方法的基礎上有所改進，分別取2 mL醋樣于10 mL的離心管中，再加入1 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液和1 mL 30%乙酸鋅溶液，搖勻后靜置5 min，4 000 r/min離心5 min。收集上清液并定容至5 mL，取1 mL于具塞試管中，加入250 μL 5 mol/L的磷酸溶液，混勻2 min，加入1.5 mL 1%的硫酸-甲醇溶液，充分混勻后70 ℃水浴6 h，取出冷卻至室溫，加1 mL正己烷混勻后靜置分層，取0.6 mL正己烷層過0.22 μm微孔濾膜后進樣。

1.3.4 甲酯化-二氯甲烷法

本方法在謝文明等[26]方法的基礎上有所改進，分別取2 mL醋樣于10 mL的離心管中，再加入1 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液和1 mL 30%乙酸鋅溶液，搖勻后靜置5 min，4 000 r/min離心5 min。將上清液全部轉移至離心管中，加1 mL 12.5%硫酸-甲醇溶液，充分混勻后60 ℃水浴4 h，取出冷卻至室溫，加入2 mL二氯甲烷，渦旋混勻3 min，4 000 r/min離心5 min；收集二氯甲烷層，重復萃取2次，合并二氯甲烷提取液并定容至6 mL，加入1.5 mL飽和NaCl，充分混勻后靜置分層，取1 mL二氯甲烷層，用0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣。

1.3.5 富丁酸醋的制備

將加入了500 g大米和2 000 mL蒸餾水的發(fā)酵罐置于72 ℃恒溫水浴中，加入7 g α-淀粉酶，水解2 h，自然冷卻至室溫。將丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的種子培養(yǎng)液按3%的接種量轉接到大米水解液中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內發(fā)酵24 h；丁酸發(fā)酵結束后，將浸泡好的烏衣紅曲加入到發(fā)酵罐內，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵15 d后，將酒醅離心，取每100 mL上清液分裝在三角瓶成為醋酸發(fā)酵液。將醋酸菌種(滬釀 1.01)按照 3%的接種量接入三角瓶，進行搖床培養(yǎng)(28 ℃，180 r/min)。發(fā)酵6 d后取出，將富丁酸醋置于高溫滅菌鍋進行121 ℃、30 min滅菌，得到富丁酸醋。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究利用外標法定量，利用 Microsoft Excel 2017軟件對數(shù)據(jù)進行處理，利用 SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，利用Origin 8.5軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 保留時間和峰形的測定結果

將丁酸標準品按照3種預處理方法進行提取，經(jīng)過氣相色譜測定，得到標準品的色譜圖如圖1所示。3種預處理方法處理后的目標物保留時間分別為9.20、9.25、9.50 min，保留時間附近均沒有其他雜峰干擾。圖1(a)為用乙醚萃取處理后得到的丁酸峰，其響應值較高，峰型也較好；圖1(b)為利用1%硫酸-甲醇溶液甲酯化后，用正己烷萃取得到的色譜圖，其丁酸的響應值明顯低于其他兩種方法；圖1(c)為12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化后，用二氯甲烷萃取得到的色譜圖，其丁酸的響應值最高，保留時間最長。甲酯化后的丁酸保留時間與乙醚萃取的丁酸保留時間有所不同，比較兩種甲酯化方法發(fā)現(xiàn)，利用12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化后，用二氯甲烷萃取得到的丁酸甲酯保留效果較好，可能因為丁酸作為低碳鏈有機酸極性相對較大、二氯甲烷較之正己烷極性也較大，因此甲酯化后利用二氯甲烷萃取在FFAP色譜柱上也有較好的峰形和保留。

(a)經(jīng)乙醚萃取法處理

2.2 標準曲線、線性范圍、檢出限和檢測限的測定結果

將丁酸標準品按照不同濃度梯度稀釋后，分別按照3種不同方法進行預處理，經(jīng)氣相色譜分析，根據(jù)結果繪制得到3條標準曲線，根據(jù)信噪比(S/N)確定檢測限(RSN = 10)和檢出限(RSN = 3)。如表1所示，不同方法處理后的標準品均呈現(xiàn)良好的線性關系，其相關系數(shù)范圍為0.999 2～0.999 8，檢測限范圍為0.016～0.177 mg/mL，檢出限為0.005～0.072 mg/mL。其中，乙醚萃取法的檢出限和檢測限最低，而甲酯化-正己烷法的最高。這是由于乙醚萃取法是直接用乙醚進行提取，步驟簡單，過程中損失較少；而甲酯化的方法都相對復雜，過程中轉移步驟較多，會造成一定的損失。但是，乙醚揮發(fā)性強，在提取過程中不易控制，結果穩(wěn)定性較差。

表1 不同方法處理后丁酸的標準曲線、相關系數(shù)、線性范圍、檢測限和檢出限

2.3 回收率和精確度的測定結果

向已知丁酸濃度的食醋樣品中分別加入質量濃度為0.46、0.87、2.25 mg/mL的丁酸標準品，將加標后的樣品分別按照3 種不同提取方法進行預處理。每個加標平行6次，回收率和相對標準偏差結果見表2。由表2可知，乙醚萃取法的回收率范圍為58.69%～112.45%，平均回收率為85.57%，其中白醋回收率最高，可能是由于白醋的成分與其他醋相比較簡單，提取時干擾物相對較少。甲酯化-正己烷法和甲酯化-二氯甲烷法的回收率范圍分別為71.26%～111.49%和87.36%～106.52%，平均回收率分別為91.38%和96.94%。乙醚萃取法的回收率不穩(wěn)定，這與不同樣品屬性有關；同時，因為乙醚容易揮發(fā)，重復性難以控制，所以相對標準偏差在0.54%～4.87%之間。兩種甲酯化方法與乙醚萃取法相比回收率高且相對穩(wěn)定，標準偏差范圍分別為0.23%～3.49%和0.24%～4.31%。而且，食醋的發(fā)酵過程復雜，產生的丁酸可能與其他代謝產物反應，而不是以游離的丁酸存在；因此，即使乙醚萃取法的檢測限最低，但在實際測定中，可能還會遺漏部分丁酸含量，使準確度相對較低。從兩種甲酯化方法得到的結果來看，甲酯化-二氯甲烷法的回收率范圍更接近100%，平均回收率也更高，這可能與硫酸-甲醇溶液中硫酸的含量有關。王韋崗等[27]利用硫酸-甲醇溶液對食品中常見的12種有機酸進行衍生，并通過氣相色譜法對衍生物進行測定，考察了不同體積分數(shù)的硫酸-甲醇溶液對衍生效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)包括丁酸在內的12種有機酸衍生物的峰面積與硫酸-甲醇溶液的體積分數(shù)成正比，此結果與本實驗的結論一致。

表2 不同方法處理后5種食醋樣品中的丁酸回收率和精確度 (n=6)

2.4 樣品分析

食醋發(fā)酵分為多個階段，其中丁酸發(fā)酵階段是本實驗室釀制富丁酸醋的特殊環(huán)節(jié)，因此考察此過程中丁酸含量的變化對發(fā)酵工藝的控制和優(yōu)化有著至關重要的作用。本研究采用甲酯化-二氯甲烷法對發(fā)酵醪中的丁酸進行萃取，利用氣相色譜儀進行測定，結果如圖2所示。由圖2可知，在10 d的發(fā)酵期間，富丁酸醋中丁酸含量整體呈上升趨勢，在第8 d后趨于平緩。丁酸含量變化范圍為1.31～2.36 mg/mL，對照組(并未接種丁酸菌)為0.051～0.109 mg/mL。王貴雙等[28]通過對釀造、配制食醋和固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵食醋各有機酸的百分含量進行分析得出：釀造食醋中有機酸含量從高到低分別為乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、甲酸、丙酮酸、草酸和丙酸；配制食醋中有機酸含量從高到低分別為乙酸、乳酸、檸檬酸、甲酸、丙酸、琥珀酸、丙酮酸和草酸；固、液態(tài)發(fā)酵食醋中有機酸含量從高到低的順序與釀造食醋的順序相同。可見在大多數(shù)食醋中自然產生的丁酸含量極其少，因此富丁酸食醋的開發(fā)對于豐富功能性保健食醋的種類具有重要意義。

圖2 富丁酸醋發(fā)酵醪中丁酸的含量變化

3 結束語

本實驗采用3種不同的方法處理5種食醋，利用氣相色譜法檢測食醋中的丁酸，通過對實驗數(shù)據(jù)及實驗現(xiàn)象的分析發(fā)現(xiàn)，不同的預處理方法對檢測食醋中丁酸的含量會產生不同的影響，12.5%硫酸甲醇溶液甲酯化與二氯甲烷萃取結合的方法是最適合檢測丁酸的預處理方法。

乙醚萃取法操作簡單，氣相色譜圖中有機酸的分離度高、峰型較好且響應度較高，但由于乙醚的揮發(fā)性，導致氣相分析的結果不穩(wěn)定，加標回收率在58.69%～112.45%之間，相對標準偏差的范圍為0.54%～4.87%，準確度較低；1%硫酸-甲醇甲酯化與正己烷萃取結合法，結果比較穩(wěn)定，加標回收率在71.26%～111.49%之間，相對標準偏差較小，在0.23%～ 3.49%之間，但色譜圖的峰型差、有拖尾現(xiàn)象且響應值很低，對色譜柱會造成損害，其操作繁瑣、耗時長；12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化與二氯甲烷萃取結合法，操作雖然稍微復雜且耗時較長，但氣相分析的結果最理想，有機酸的分離度較高，丁酸峰型最好，無拖尾現(xiàn)象，響應值也最高，而且回收率最穩(wěn)定，在87.36%～106.52%之間，相對標準偏差在0.24%～4.31%之間。綜合以上分析，用12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化后再用二氯甲烷萃取的方法是最適合氣相檢測食醋中丁酸含量的方法。