RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用及分子機制*

何洋， 王黎洲， 李成， 安天志， 周石， 段慶紅*

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 介入科， 貴州 貴陽 550004)

在我國腦血管疾病的患者越來越多，已成為心臟病之后的第2大死因[1]。我國每年腦血管疾病新發(fā)患者約270萬，約130萬患者死于腦血管疾病[2]。卒中為常見的腦血管疾病，其中缺血性卒中所占比例高達85%[3]，目前腦缺血再灌注損傷是引發(fā)缺血性腦卒中致殘及致死的重要原因，患者后遺癥往往比較嚴重[4-5]，但其涉及的相關通路及干預靶點仍不十分明確。腦缺血再灌注損傷受多條信號通路的影響，目前相關報道主要為Toll樣受體、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶及Notch信號通路等[6]，其中重組信號序列結(jié)合蛋白J(recombination signal sequence binding protein J，RBPJ)為Notch信號通路的關鍵蛋白，不僅與腦梗死的程度密切相關，同時與腦缺血再灌注后神經(jīng)功能的修復密切相關，而腦缺血再灌注損傷患者血清中的微小核糖核酸(microRNA，miR)含量往往發(fā)生變化[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR155可通過Notch信號通路調(diào)節(jié)一氧化氮(nitric oxide，NO)和內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達[8]；腦缺血再灌注后會導致炎癥因子含量明顯升高，引起炎癥反應，進而引發(fā)一系列的并發(fā)癥[9]。缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是1992年首次發(fā)現(xiàn)的一種能與促紅細胞生成素基因相結(jié)合的核轉(zhuǎn)錄因子[10]。有報道發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注時，HIF-1α含量會迅速升高，引起炎癥反應[11]；miR155通過影響HIF-1α促進血管損傷再生[8]。本研究擬通過建立大鼠腦缺血-再灌注模型，探討RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應分子之間的關聯(lián)性，并通過基因過表達和沉默技術進一步驗證通路效應分子相關作用位點及其與炎癥因子的作用，進而為腦缺血再灌注損傷的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性8周齡健康Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～300 g，飼養(yǎng)于無菌、恒溫及暗明交替的清潔級環(huán)境中，適應性飼養(yǎng)7 d，避免外界刺激，術前12 h禁食；新生24 h以內(nèi)的雄性SD乳鼠10只，體質(zhì)量6～8 g。實驗動物均由學校動物實驗中心提供，本研究獲得學校動物倫理委員會批準(1800823)。

1.1.2主要試劑和儀器 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)染色液(天津灝洋)，免疫組織化學和TRIzol試劑盒(美國Miltenyi Biotec)，75%乙醇和三氯甲烷(天津大茂)，Neurobasal-A培養(yǎng)基、B-27及GlutaMAX添加劑(美國Life Technologies)，無菌乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic，EDT)抗凝采血管和96孔培養(yǎng)板(美國BD)，磷酸鹽緩沖液(美國SAB)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(中國碧云天)，HIF-1α酶聯(lián)免疫試劑盒(上海BG)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)及IL-1β的酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國R&D Systems)。

1.2 方法

1.2.1大鼠腦缺血再灌注模型的建立及分組 60只雄性大鼠采用隨機數(shù)字表法完全隨機化均分為假手術(sham)組和實驗組。實驗組大鼠采用10%水合氯醛300 mg/kg劑量腹腔注射，運用頸內(nèi)動脈線栓法建立大鼠腦缺血模型[12]，即暴露大鼠頸外動脈(external carotid arteries，ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)及左頸總動脈后，微動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA；在距 CCA 分叉部 4mm 處剪一小口，將拴線插入到 ICA，用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當插入深度約18 mm 時停止推送，此時線栓頭端至大腦中動脈內(nèi)并阻斷其相應區(qū)域的血液供應，并即刻開始計時，90 min后從ICA中輕輕取出線栓進行再灌注[8]。Sham組大鼠麻醉后接受和實驗組進行相同的手術操作，但不置入線栓(即無大腦中動脈血流阻斷)，手術全程及結(jié)束后均于37 ℃恒溫電熱板上維持大鼠體溫。術后采用Longa評分評估神經(jīng)功能損傷[13]。后0.3 mL/100 g水合氯醛腹腔麻醉2組大鼠后斷頭取腦。

1.2.2TTC染色及梗死體積測量 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，-20 ℃冰箱速凍15 min，作2 mm厚度的連續(xù)切片。將切片置于2%TTC避光，37 ℃溫箱20 min，均勻染色，4%多聚甲醛固定，染成紅色的為正常腦組織，白色為梗死腦組織，將染色的腦片按切片順序排列，標號、設定標尺并拍照(圖1)，取梗死灶相對最大的切片，計算梗死灶所在層面的面積百分比。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 檢測腦組織miR-155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表達 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，提取RNA，加離子水50 μL溶解RNA，15 ℃水浴10 min，使用紫外分光光度計測定提取RNA的純度，儲存于-80 ℃冰箱中。進一步將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后采用qRT-PCR檢測miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表達。RTQ-PCR反應條件如下：95 ℃預反應2 min，95 ℃變性，擴增40個循環(huán)，60 ℃退火、延伸。miR155(正向5′-GCTTCGGTAATGCTAATCGTG-3′，反向5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA3′,)；Notchl (正向5′-TCAATGTTCGAGGACCAGATG-3′，反向5′-TCACTGTFGCCTGTCTCAAG-3′)；Hesl (正向5′-AGCCAACTGAAAACACCTGATY-3′，反向5′-GGACTrrATGATTAGCAGTGG-3′)；GAPDH(正向5′-GGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，反向5′-ACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′)，比較循環(huán)閾值(Ct)法計算基因相對表達量。

1.2.4ELISA檢測腦組織中HIF-1α、TNF-α、IL-1β及IL-6 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，1 200 r/min離心10 min，收集上清液，采用ELISA法檢測腦組織中HIF-1α水平，嚴格按照檢測試劑說明書操作。實驗組和sham組大鼠及轉(zhuǎn)染慢病毒抑制RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后實驗組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平同樣采用ELISA法檢進行，所有操作均按照試劑盒完成。

1.2.5組織病理染色顯微鏡鏡下觀察腦組織學 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，固定于10%福爾馬林溶液中，后行石蠟包埋、切片、抗原修復等，再血清封閉，最后行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色；或行免疫組織化學 (immunohistochemistry, IHC)染色，檢測對應加NF-κB一抗，加生物素標記二抗，DAB顯色，復染細胞核，脫水封片，顯微鏡鏡下觀察染色。

1.2.6蛋白印跡法(Western blot)檢測HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表達 取“1.2.1”項下2組大鼠腦組織，RIPA裂解，轉(zhuǎn)移至4 ℃離心機12 000 r/min離心15 min，取上清液，保存至-80 ℃冰箱，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS- PAGE)分離蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜 (polyvinylidene fluoride，PVDF)上，加相應抗體后4 ℃ PBST沖洗3次，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)結(jié)合二次抗體孵育30 min，使用增強化學發(fā)光試劑盒處理PVDF膜，使用QualityOne 軟件進行分析。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測及染色質(zhì)免疫共沉淀測序檢測miR155與HIF-1α、RBPJ及NF-κB的相互作用位點 使用Promega 的雙熒光素酶基因報告分析系統(tǒng)進行樣品熒光素酶活性的測定，將HIF-1α基因相關結(jié)合位點the hypoxia-responsive element (HRE)及E-box: CANNTG至pSICHECK-2雙熒光素報告載體中，使用miR155片段分別與HRE質(zhì)粒載體及CANNTG載體共同轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)細胞，使用雙熒光素試劑盒檢測HRE及E-box:CANNTG的調(diào)控；分別將RBPJ、NF-κB基因相關序列3′UTR及突變位點克隆至pSICHECK-2雙熒光素報告載體中，使用miR155片段分別與3′UTR質(zhì)粒載體及突變載體共同轉(zhuǎn)染VEC細胞，使用雙熒光素試劑盒分別檢測RBPJ、NF-κB基因相關序列3′UTR及突變序列的調(diào)控作用；采用染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(chromatin immunoprecipitation followed by sequencing，ChIP-Seq)進行大鼠腦組織細胞的裂解，使用提取總脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)，使用抗體進行免疫沉淀，通過洗滌、解交聯(lián)等得到純化的ChIP-DNA片段。

1.2.8神經(jīng)元細胞培養(yǎng) 取SD乳鼠麻醉狀態(tài)下處死，整只浸泡于75%乙醇中約5 min，無菌取頭、取大腦，取出的雙側(cè)大腦海馬置于預冷的D-Hank＇s平衡鹽溶液中；將海馬組織剪成1 mm3大小的組織塊，0.25%胰蛋白酶消化15 min，置特殊培養(yǎng)基(谷氨酰胺500 μL、雙抗500 μL、B27 1 mL及neurobasal-A 48 mL)于37 ℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)[14]，最終獲取原代神經(jīng)元細胞以進行后續(xù)實驗。

1.2.9慢病毒轉(zhuǎn)染 乳鼠神經(jīng)元細胞接種于6孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。待細胞生長覆蓋度達50%時進行慢病毒感染，對照組加10 μL培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染組分別加miR155-shRNA 10 μL +Polybrene 2 μL、HIF-1α-shRNA 10 μL+Polybrene 2 μL、RBPJ- shRNA 10 μL+Polybrene 2 μL、NF-κB- shRNA 10 μL+Polybrene 2 μL干擾病毒，轉(zhuǎn)染過夜，每日更換培養(yǎng)基，5 d后使用Western blot鑒定進行病毒轉(zhuǎn)染效果檢查，轉(zhuǎn)染成功的細胞進行后續(xù)實驗。 收集對照組和轉(zhuǎn)染組上清液，采用ELISA法檢測RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α中沉默其中1個分子后其它3個分子的表達水平；實驗操作流程具體按照檢測試劑說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注損傷大鼠模型

sham組大鼠Longa評分為(0.00±0.00)分，實驗組為(2.59±0.39)分，實驗組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=14.92，P<0. 001)；經(jīng)TTC染色后，梗死區(qū)域為白色，非梗死區(qū)域為紅色，實驗組大鼠腦梗死面積明顯大于sham組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為TTC染色(白色為梗死區(qū)域，紅色為非梗死區(qū)域),B為梗死面積百分比；(1)與sham組比較，P<0. 05。

2.2 RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應分子的含量

HE染色結(jié)果表明，sham組大鼠大腦皮層組織完整、神經(jīng)元完整、細胞結(jié)構清晰且NF-κB存在于細胞漿、內(nèi)無明顯移位，實驗組大鼠神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯減少、NF-κB明顯從細胞漿移位于細胞核；免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠腦組織中miR-155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB的表達水平均高于Sham組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。見圖2和圖3。

圖2 sham組和實驗組大鼠神經(jīng)元細胞和NF-κB的表達(400×)

注：A為條帶灰度圖；B為qRT-PCR定量結(jié)果；(1)與sham組比較，P<0. 05。

2.3 RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路軸效應分子的關系

使用基因沉默技術，分別沉默miR155、HIF-1α、RBPJ、NF-κB其中的一種對RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應分子的關聯(lián)性進行驗證，結(jié)果表明沉默RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路中單個效應分子，剩余的3個效應分子的表達均較sham組升高(P<0. 05)。見表1。

表1 RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應分子的關系

2.4 miR155與HIF-1α、RBPJ及NF-κβ的相互作用位點

利用雙熒光素酶報告基因檢測、ChIP-Seq檢測miR155與HIF-1α、RBPJ及NF-κB相互作用位點，對miR155與HIF-1α的結(jié)合情況進行研究分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間的結(jié)合位點為E-box: CANNTG，雙熒光素酶報告提示miR-155與E-box:CANNTG進行結(jié)合；對miR-155與NF-κB的結(jié)合情況進行研究分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間的結(jié)合位點為AC-CAAAG，雙熒光素酶報告提示miR-155與NF-κB3′UTR進行結(jié)合；對miR-155與RBJP的結(jié)合情況進行研究分析，雙熒光素酶報告提示miR-155與RBJP3′UTR進行結(jié)合。見圖4。

注：黑色標注圈為ACTA1的3′UTR種子區(qū)。

2.5 RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路與炎癥因子的聯(lián)系

ELISA法檢測結(jié)果顯示，實驗組大鼠阻斷前血清炎癥相關因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達均較sham組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)；通過慢病毒轉(zhuǎn)染抑制RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路后，TNF-α、IL-1β和IL-6的表達較實驗組轉(zhuǎn)染前均下降(P<0. 05)。見表2。

表2 sham組和實驗組大鼠血清炎癥因子水平

3 討論

缺血性腦卒中的治療已取得了很大進展，但仍有許多問題需要解決。溶栓時間窗的擴展和溶栓藥物的選擇均是亟待解決的問題[15-16]。臨床上常用的溶栓藥物如纖溶酶等，雖然可恢復缺血半暗帶的血流供應，挽救缺血組織，然而治療方式受時間影響較大，有效時間窗較短；且在恢復供血的過程中，可能會造成腦缺血再灌注損傷[17]。腦缺血再灌注的過程中，受損腦組織由于血流量的減少，存在缺氧問題，炎癥反應在缺氧狀態(tài)下不斷增強，炎癥介質(zhì)快速增多，介導不同的信號通路[18]。本研究在動物水平通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，通過熒光定量PCR及免疫組化等方法對RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路效應分子之間的關聯(lián)性進行合理推測，并通過基因過表達、沉默技術進一步驗證該通路miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB效應分子之間是互相連通的，也進一步驗證RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路的存在。

腦缺血再灌注模型中腦損傷機制較為復雜，受多種細胞通路、多種調(diào)控分子的作用，在病情的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用[19]。已有研究證實miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB等與腦缺血再灌注損傷密切相關，對腦組織的損傷呈上升趨勢，且能激活炎癥相關因子來促進局部炎癥反應的發(fā)生及發(fā)展[20-21]，但各通路相關蛋白間是否存在相互作用，以及各通路相關蛋白間是否相互作用尚不明確。本研究結(jié)果表明，RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路相關蛋白miR155、HIF-1α、RBPJ、NF-κB在腦缺血損傷再灌注模型大鼠中的表達均高于sham組，提示該通路與大鼠腦缺血損傷再灌注損傷密切相關，與既往的文獻報道一致[22]。

雙熒光素酶報告基因技術和ChIP-Seq為近年來新興的生物測定技術是在染色質(zhì)免疫沉淀技術及基因測序技術基礎上發(fā)展起來的綜合性檢驗技術，能夠?qū)崿F(xiàn)獲得與DNA結(jié)合蛋白相互作用的DNA片段信息，是與深度基因相結(jié)合的方法，據(jù)報道兩種檢測方法具有一定的可行性[23]，故本次研究的方法是準確合理的。本研究主要使用上述方法進行了通路中miR155與其他信號分子間相互作用位點的測定，證實了miR155與HIF-1α、RBPJ以及NF-κB均存在相互作用的結(jié)合位點。

腦缺血再灌注時，在缺血灶局部存在大量炎癥因子，并且炎癥細胞的激活、浸潤及黏附分子的合成分泌呈一種相互增強相互促進的級聯(lián)反應，并通過一定的炎癥信號通路使腦組織由缺血性損傷轉(zhuǎn)向炎癥性損傷[24]。本次研究表明RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路與炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展密切相關,通路的相關蛋白miR155與HIF-1α、RBPJ以及NF-κB相互影響，共同作用，通過阻斷上述通路能夠降低相關炎癥因子的表達，說明腦缺血再灌注損傷模型中炎癥因子表達增多與RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路激活密切相關，將來可通過改善RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α信號通路的響應，會在一定程度上減輕腦缺血再灌注的炎癥反應。

綜上所述，RBPJ-miR155-NF-κB-HIF-1α通路在大鼠腦缺血再灌注損傷中起著重要的調(diào)控作用，機制可能與該通路相關蛋白miR155、HIF-1α、RBPJ及NF-κB之間相互影響，并和炎癥因子的表達相關。