基于分子對接技術(shù)的飛龍掌血抗炎活性生物堿篩選及其作用機制*

羅才榮, 劉杰, 梁妍, 盛鈺, 何芋岐, 周威*

(1.貴州醫(yī)科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550025; 2.遵義醫(yī)科大學 藥學院, 貴州 遵義 563099)

飛龍掌血[Toddaliaasiatica(L.) Lam.]為蕓香科、飛龍掌屬植物，傳統(tǒng)中醫(yī)認為該藥具有止血、散瘀、止痛和祛風的功效[1-2]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)飛龍掌血總生物堿具有顯著抗炎鎮(zhèn)痛作用[3]。鑒于炎癥與癌癥、糖尿病及哮喘等諸多疾病密切相關(guān)[4-7]，開展抗炎藥物研究就顯得尤為重要。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa beta,NF-κB)可以介導炎癥發(fā)生的各個階段，它通過調(diào)控炎癥基因表達來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；IκB激酶β(IκB kinase β, IKK-β)是抑制NF-κB通路的關(guān)鍵激酶，當IKK-β被激活產(chǎn)生聯(lián)級反應(yīng)導致NF-κB被異常激活，可產(chǎn)生大量的炎癥因子；絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)具有與IKK-β相似的作用；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、誘導型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase, iNOS)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2, COX-2)都是NF-κB調(diào)節(jié)的基因[8-10]。TNF-α可以反向的作用于NF-κB形成正反饋調(diào)節(jié)，當TNF-α 被抑制后可以減輕炎癥條件下產(chǎn)生的疼痛[8]；iNOS是一種細胞間信使，通過NF-κB刺激上調(diào)COX-2和iNOS增加細胞因子的表達，激活中樞和外周疼痛[10]；巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibition factor, MIF)是炎癥反應(yīng)中上游的介質(zhì)，參與調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)產(chǎn)生[11]；這些抗炎因子受體是炎癥研究中重要的研究對象[12-15]。分子對接技術(shù)屬于計算機輔助藥物設(shè)計(computer-aided drug design, CADD)的重要組成部分，分子對接是將配體小分子放到受體活性口袋中，通過變化配體小分子的空間構(gòu)象，按照幾何、能量及化學環(huán)境互補的原則來評價配體小分子與受體互相作用的強弱, 預(yù)測其結(jié)合模式、親和力的方法[16]。結(jié)合課題組前期研究基礎(chǔ)[3]，本研究通過計算機虛擬篩選手段進一步豐富飛龍掌血抗炎活性生物堿，并分析其可能的抗炎作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1平臺和軟件 本研究所有的操作均在Windows操作系統(tǒng)中完成的，化學結(jié)構(gòu)繪圖軟件，分子對接軟件。軟件中參數(shù)設(shè)置未說明，均為默認值。

1.1.2靶點、上市藥物和候選化合物 選取7個與炎癥相關(guān)的靶點蛋白，即NF-κB1、IKK-β、p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)、TNF-α、MIF、iNOS及COX-2。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)搜索并下載對應(yīng)的晶體蛋白結(jié)構(gòu)，蛋白數(shù)據(jù)庫(protein data bank, PDB)編號及原配體與靶點殘基作用情況(表1)。在DrugBank數(shù)據(jù)庫(www.drugbank.ca)檢索到12個對上述靶點有抑制作用并己批準上市的小分子藥物(表 2)，下載其化合物結(jié)構(gòu)。從本課題組對飛龍掌血的綜述[17]及現(xiàn)有報道中得到65個生物堿化合物，通過PubChem化合物數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載其3D構(gòu)象。

表1 原配體與靶點殘基作用情況

表2 與靶點有抑制作用的已上市小分子藥物

1.2 方法

1.2.1靶點蛋白的處理 在分子對接軟件中對所有的蛋白進行前處理，即刪除水分子、原配體分子及其非相關(guān)的蛋白質(zhì)構(gòu)象，經(jīng)Clean Protein、Preare Protein工具等處理。定義蛋白為受體，并將其定義sphere球，最后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2類藥五規(guī)則(Lipinski)[18]篩選候選化合物 使用Lipinski對候選的65個飛龍掌血生物堿類化合物進行篩選，包括：(1)分子量<500;(2)氫鍵給體數(shù)目<5;(3)氫鍵受體數(shù)目<10;(4)脂水分配系數(shù)<5;(5)可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量<10。

1.2.3候選化合物和上市藥物的處理 將符合類藥性原則的化合物構(gòu)建出其3D構(gòu)象并導入分子對接軟件中進行加氫、Prepare ligands處理，最后進行能量優(yōu)化，保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜行》肿铀幬锱c候選的生物堿類小分子同法處理，保存作為參照配體庫。

1.2.4對接方法可行性驗證 將蛋白晶體中的原配體抽離，然后按設(shè)定的參數(shù)對接回原口袋，計算對接后的構(gòu)象與原配體的均方根偏差(root-mean-square deviation，RMSD)，通過RMSD值測定該對接方法和參數(shù)的可行性。

1.2.5候選化合物與靶點蛋白對接 將備用的靶點和配體分子導入分子對接軟件中，使用分子對接軟件中的Libdock組件，設(shè)置參數(shù)Conformation Method為FAST，Docking Preferences為High Quality，運行。同法操作，將已上市的藥物小分子與靶點對接。靶點1A9U的空間坐標位置為8.429 6、12.819 7及31.194 7，靶點1LJT的空間坐標位置為-33.160 0、33.626 7及-4.868 9，靶點2AZ5的空間坐標位置為-17.423 3、73.104 4及36.976 9，靶點3RZF的空間坐標位置為96.425 7、-28.150 7及55.284 6，靶點3HR4的空間坐標位置為-0.278 4、12.720 3及-70.238 8，靶點1AM4的空間坐標位置為45.669 8、-50.205 1及8.194 6，靶點3KRK的空間坐標位置為31.666 1、35.605 0及65.043 3。對接完成后，以各靶點對應(yīng)上市藥物最低評分做第1次篩選，然后把篩選出的小分子配體與原配體的最低評分做2次篩選，保留高于雙閾值配體，并刪除重復項。

2 結(jié)果

2.1 符合Lipinski的化合物

使用Lipinski篩選后得到19個符合條件的生物堿類小分子化合物。

2.2 對接方法的可行性

在7個靶點的可行性驗證結(jié)果中，得到對接后構(gòu)象與原配體結(jié)構(gòu)的RMSD值均小于2×10-10m，且對接構(gòu)象與原配體疊合圖大致重合，說明該方法的對接參數(shù)設(shè)定具有可行性(表3)。

表3 靶點蛋白與其原配體對接結(jié)果

2.3 候選化合物-靶點對接分析

將19生物堿類候選化合物進行分子對接，最終篩選出對接評分高于對各靶點有抑制作用藥物及其原配體最低得分值的化合物共28個，刪除重復項后最終得到14個小分子化合物見表4，表中列出19個候選化合物與不同靶點的對接打分情況。高于閾值的化合物與靶點作用情況如下：Demethylnitidine (Cp.15)作用于MIF、NF-κB1和COX-2靶點，以該化合物為例展示其與靶點的作用模式圖(圖 1)；1, 3-二環(huán)己基(Cp.06)作用于IKK-β、MAPK和COX-2靶點；N-反式-阿魏酰酪胺(Cp.10)作用于IKK-β、MAPK和COX-2靶點；(7Z)-N-(4′-methoxyphenethyl)-3-methoxy-4-hydrox ycinnamamide (Cp.12)作用于IKK-β、MAPK和MIF靶點；5-甲氧基白蘚堿(Cp.08)作用于IKK-β、COX-2靶點；光葉花椒堿(Cp.13)作用于MIF、iNOS和NF-κB1靶點；飛龍掌血喹啉(Cp.19)作用于TNF-α和MIF靶點，木蘭花堿(Cp.16)作用于IKK-β和COX-2靶點；白屈菜紅堿(Cp.03)作用于TNF-α靶點，N,N′-二環(huán)己基草酰胺(Cp.11)作用于MAPK靶點；γ-崖椒堿(Cp.05)、4-甲氧基-1-甲基-2-喹諾酮(Cp.09)、弗林德堿(Cp.01)和花椒喹諾酮(Cp.14)作用于IKK-β。

表4 原配體和19個生物堿類候選化合物得分

注：A為配體分子與受體蛋白對接空腔氫鍵作用，紫、綠色分別表示氫鍵供體和受體；B為配體分子與氨基酸殘基作用模式，綠色表示氫鍵連接的氨基酸殘基，淺綠色表示范德華力連接的氨基酸殘基，淺紫色表示π-烷基鍵連接的氨基酸殘基。

2.4 候選化合物與上市藥物，原配體的氨基酸殘基對接分析

分析上市藥物分子與各靶點間氫鍵和π相互作用(表5)及14個生物堿類小分子-靶點之間的氫鍵與π相互作用、對接方式和模式(表6)，該表展示了候選化合物-靶點-上市藥物之間氨基酸殘基的作用模式和作用數(shù)目，用以揭示藥物分子發(fā)揮抗炎的效果時可能結(jié)合的氨基酸位點。通過化合物與上市藥物對靶點共同作用的氫鍵、π相互作用的多寡及方式，進一步推斷其可能的抗炎作用機制。

表5 已上市藥物與各靶點殘基作用情況

表6 篩選出的化合物與各靶點殘基作用情況

3 討論

分子對接技術(shù)在藥效成分-藥理靶點作用方面具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢，能夠較準確的闡明待篩藥物可能的藥效與藥理作用機制，已經(jīng)逐漸被廣泛運用于藥物分子設(shè)計、蛋白質(zhì)模型構(gòu)建、中藥藥效成分的發(fā)現(xiàn)與新藥研究開發(fā)、復雜藥物藥理作用機制研究中[19-22]。Lipinski是基于化學結(jié)構(gòu)模擬其在體內(nèi)的吸收效率及藥用性能的法則，能較為快速地篩選出天然產(chǎn)物中具有良好成藥性的藥物分子[18]。

本次研究基于Lipinski，采用高通量篩選方法LibDock對接模式對飛龍掌血生物堿類化合物進行抗炎活性篩選，從65個飛龍掌血生物堿類化合物中，篩選到19個符合類藥性原則的候選化合物，提示它們具有良好的成藥性。但Lipinski有其自身的局限性，限定了分子量不符合該規(guī)則但可能具有良好藥理活性小分子。本研究旨在通過計算機虛擬篩選手段發(fā)現(xiàn)飛龍掌血生物堿中抗炎活性與吸收均良好的天然化合物，對飛龍掌血生物堿類化合物進行類藥性篩選。整理原配體、上市藥物和候選化合物與靶點的氨基酸作用情況，分析靶點中關(guān)鍵氨基酸與配體之間相互作用的相似性。

可行性驗證中的RMSD值是衡量靶點蛋白能否進行分子對接的重要指標，該值能反應(yīng)出二次對接的配體與原配體之間的重復性，一般認為當RMSD<2×10-10m時，認為該方法具有可行性[16]。本次對接的RMSD<2×10-10m，說明本次對接中設(shè)置參數(shù)具有可操作性。

Demethylnitidine (Cp.15)可與MIF、NF-κB1和COX-2靶點產(chǎn)生較強的作用，其與上市藥物-靶點的對接結(jié)果顯示在B(Tyr385)、C(Arg85)及F(Thr558)等氨基酸殘基形成相似的氫鍵作用，在A(Phe348)殘基出形成π相互作用。

N-反式-阿魏酰酪胺 (Cp.10)可與IKK-β、MAPK和COX-2靶點發(fā)生作用，與上市藥物-靶點對接中在A(Arg31、Lys44、Asp166、Leu167、Leu75、Leu87及Asp88等)殘基上形成共同的氫鍵；其中氨基酸殘基Arg31與原配體殘基對接一致。周鵬等[23]在研究甘草素、甘草苷和甘草酸與IKK-β靶點對接中發(fā)現(xiàn)Asp166可能是該靶點的活性位點。鄭新恒等[24]將分離得到的N-反式-阿魏酰酪胺進行抑制NO生成的研究，發(fā)現(xiàn)其抑制NO生成無明顯作用，IC50值為33.15 μmol/L，大于陽性對照藥槲皮素(IC50=17.21 μmol/L)。

光葉花椒堿(Cp.13)與上市藥物和靶點MIF、iNOS及NF-κB的對接中在A(Lys549、Gly594及Ser628)、B(Ser60)、C(Cys59、Arg85)及F(Thr558)等氨基酸殘基有相同的氫鍵作用；與原配體形成A(Thr547、Glu661、Thr592)共同的氫鍵殘基，且與上市藥物和原配體在Tyr631產(chǎn)生相同的π相互作用，表明篩選出的化合物可能具有與上市藥物相似的抗炎活性。

白屈菜紅堿(Cp.03)與靶點TNF-α對接結(jié)果并未表現(xiàn)出與氨基酸的相互作用，但Li等[25]對白屈菜紅堿作用于腹膜炎癥介質(zhì)的研究表明其對TNF-α分泌具有極強的抑制作用。Banbury等[26]研究表明弗林德堿(Cp.01)能夠抑制鈣離子載體刺激的3T3中PGE2的合成，其中PGE2被認為是主要的促炎前列腺素，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)也是通過該途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究從飛龍掌血中篩選出14個可能具有抗炎活性的生物堿類化合物，推測這14個化合物可能是飛龍掌血生物堿發(fā)揮抗炎活性的關(guān)鍵活性成分；其中有8個化合物至少與2個以上的蛋白具有良好的對接效果，說明這8個化合物具有多靶向效應(yīng)，可能通過作用于多個靶點發(fā)揮抗炎的作用；靶點IKK-β、MAPK、MIF及COX-2與這14個化合物對接中高于閾值的化合物有13個，表明上述靶點可能是飛龍掌血生物堿發(fā)揮抗炎作用的重要靶點；弗林德堿、白屈菜紅堿被報道具有顯著抗炎作用，而N-反式-阿魏酰酪胺對抑制一氧化氮合酶的生成無明顯作用，證明了該化合物與iNOS靶點蛋白(3HR4)對接打分低的原因。本次研究初步探索了飛龍掌血生物堿類化合物可能發(fā)揮抗炎作用的機制，這對于飛龍掌血生物堿類化合物抗炎作用的進一步研究和開發(fā)提供了必要的理論依據(jù)。