黃連素對人耐紫杉醇去勢性前列腺癌細胞活力、增殖及HMGB1表達的影響*

張健， 彭煜暉， 李毅， 梁欣明， 付文莉， 張婷， 柏華, 禹文峰, 吳昌學* ， 張啟芳*

(1.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學中心實驗室， 貴州 都勻 558000)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤，已成為全世界男性癌癥相關死亡率的第2大原因[1]， 因其早期癥狀與前列腺炎相似，常被人忽視，致使多數前列腺癌患者在被診斷時已為轉移性前列腺癌(metastatic prostate cancer， mPCa)[2]。mPCa通常接受雄激素剝奪治療[3]，該療法在早期階段有效，然而許多mPCa患者慢慢發(fā)展雄激素不敏感，即去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)[3]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)通常為CRPC 患者標準治療選藥，PTX是一種生物堿，可通過作用于細胞微管發(fā)揮其抗腫瘤作用，但是CRPC對PTX的耐藥性限制了其治療效果[4]。小檗堿(berberine，BBR)是一種天然生物堿化合物，存在于幾種藥用植物中，如刺檗；因它可從中藥黃連中分離，又稱黃連素，是黃連抗菌的有效成分[5]。近幾年研究表明，BBR能通過不同靶基因有效地抑制幾種腫瘤細胞生長，也可通過上調miR-203增強胃癌細胞對順鉑的敏感性，亦可通過抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路阻礙黑色素瘤細胞A375.S2遷移[6-7]；BBR可以誘導膠質母細胞瘤細胞U251和U87進入衰老狀態(tài)，不再生長[8]；BBR通過誘導肝癌細胞自噬介導的死亡和凋亡介導的死亡[9]。但是，BBR對DU145R細胞的影響機制尚不清楚。此外，高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)在多種癌組織的表達也顯著高于相應的正常組織[10-11]；HMGB1和RAGE共表達與前列腺癌不良預后密切相關[12]；小鼠結腸癌細胞CT26中，HMGB1的釋放促進了細胞的轉移[13]；HMGB1可通過激活蛋白激酶B信號通路從而促進前列腺癌的轉移[14]。重要的是，在人耐PTX去勢性前列腺癌細胞中抑制HMGB1的表達后，細胞增殖受到顯著抑制[15]，但在人耐PTX去勢性前列腺癌細胞中BBR是否與HMGB1作用尚不清楚。因此，本研究擬探討B(tài)BR是否可通過HMGB1表達影響DU145R的細胞活力和增殖，現將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 人前列腺癌細胞株DU145細胞購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)，人耐PTX去勢性前列腺癌細胞株DU145R為本實驗室構建。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基及澳洲胎牛血清(美國Gibco)，黃連素(中國 大連美侖生物), 兔抗單克隆抗體HMGB1與HRP標記的抗兔的二抗(美國CST)，超敏化學發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescence，ECL)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Millipore)，二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和蛋白Marker(美國Thermo)，抗體稀釋液、封閉液、十二烷基苯硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒(中國碧云天)，PTX和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國Sigma)，GeneGnome XRO NPC 化學發(fā)光成像儀(英國SYNGENE)，Varioskan LUX多通道酶標儀(美國 Thermo Fisher Scientific)，Bio-Rda MiniⅡ/Ⅲ垂直電泳儀和Bio-Rda powerpacHC高流電源(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及處理 人前列腺癌細胞株DU145及PTX耐藥前列腺癌細胞株DU145R放于含有10%胎牛血清和1×Antibiotic-Antimycotic的RPMI 1640培養(yǎng)基，5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞活力檢測 取對數生長期DU145R細胞，調整細胞懸液濃度為1×104個/孔，接種于96孔板中。使用0、5、10、20、30及50 μmol/L BBR(即0、5、10、20、30及50 μmol/L BBR組)處理48和72 h，使用細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8，CCK8)檢測450 nm波長處的光密度(optical density，OD)值，并計算抑制率[抑制率=(OD對照組-OD處理組)/OD對照組×100%]評估細胞活力。

1.2.3細胞克隆形成實驗 取對數生長期DU145R細胞，消化重懸制備為單細胞懸液，調整細胞濃度為3×103接種于6孔板中，DMSO、10及 20 μmol/L BBR處理細胞(即DMSO組、10 μmol/L BBR組及20 μmol/L BBR組)，每3天更換1次含藥物的培養(yǎng)基，14 d后甲醇固定，結晶紫染色并計算克隆形成數量。

1.2.4HMGB1基因表達分析及預后分析 利用Oncomine數據庫分析HMGB1mRNA在人前列腺癌及正常組織中的差異表達，然后利用人蛋白質圖譜(human protein atlas , HPA)數據庫分析HMGB1在正常組織和前列腺癌中的蛋白表達差異；使用TIMER2.0在線分析工具分析HMGB1基因表達于前列腺癌患者預后的關系，根據HMGB1基因表達中位值將前列腺癌患者分為HMGB1高表達組與HMGB1低表達組。

1.2.5蛋白印跡(Western blot)法檢測HMGB1蛋白表達 取對數生長期細胞DU145作為DU145組，0、10及20 μmol/L BBR處理對數生長期DU145R細胞分別作為0、10及20 μmol/L DU145R組，收集各組細胞，提取總蛋白，蛋白上樣30 μg，80 V恒壓電泳并將目的蛋白轉移到PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，室溫下孵育HMGB1一抗(1 ∶1 000)2 h，然后孵育抗兔二抗(1 ∶1 000)1 h，ECL超敏化學發(fā)光液檢測蛋白的表達，利用Image J分析圖像強度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 細胞活力

使用0、5、10、20、30及50 μmol/L BBR處理DU145R48和72 h后，CCK8試劑盒檢測BBR對細胞活力的影響。結果表明，與0 μmol/L BBR組相比，各濃度組中DU145R細胞的抑制率降低(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

注： 0 μmol/L BBR組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

2.2 細胞增殖

克隆形成實驗結果表明，與DMSO組相比，5 與10 μmol/L BBR組DU145R細胞的克隆形成數量減少(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

注： 與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

2.3 HMGB1在耐藥細胞高表達和與前列腺癌的臨床相關性

采用Western blot法檢測了HMGB1在DU145R中的表達，結果顯示HMGB1在DU145R中的表達明顯高于DU145細胞(P<0.001)；使用Oncomine數據庫及HPA分別分析HMGB1在前列腺正常組織與前列腺癌中的mRNA及蛋白表達水平，結果顯示，前列腺癌中的HMGB1 mRNA及蛋白表達水平均高于前列腺正常組織；利用TIMER2.0數據庫獲取前列腺癌患者生存數據，生存分析結果表明，HMGB1高表達與前列腺癌患者不良預后相關(P=0.019 3)。見圖3。

注：A、B分別為HMGB1在DU145R中的表達和定量結果，C為HMGB1 mRNA 的表達，D、E分別為正常組織和前列腺癌組織中HMGB1蛋白表達(200×)，F為HMGB1表達與患者生存時間分析； (1)與DU145細胞或正常組比較，P<0.001。

2.4 HMGB1的表達

為了檢測在DU145R細胞中BBR是否影響了HMGB1的表達，利用10和20 μmol/L BBR處理細胞12 h后，Western blot法檢測HMGB1表達水平，結果顯示，10和20 μmol/L BBR組DU145R細胞中HMGB1的表達水平分別低于0 μmol/L BBR組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示BBR能抑制DU145R細胞中HMGB1的表達。見圖4。

注：(1)與0 μmol/L BBR組比較，P<0.05。

3 討論

克服CRPC耐藥性是臨床治療CRPC的一大難題[16]。本課題組前期結果表明PTX誘導的HMGB1的表達促進CRPC細胞的PTX耐藥[15]。本研究結果顯示，與對照組相比，BBR處理DU145R細胞后，細胞活力及增殖能力分別隨著濃度的增加而降低 (P<0.05)，說明BBR能夠抑制DU145R細胞活力及細胞增殖；在前列腺癌組織中HMGB1 mRNA水平和蛋白水平明顯高于正常組織(P<0.001)，HMGB1高表達與前列腺癌患者不良預后相關(P=0.019 3)，這說明HMGB1與前列腺癌具有臨床相關性；在蛋白水平上，BBR處理下調了HMGB1的表達，進一步揭示了BBR抑制DU145R細胞活力和增殖的機制。

腫瘤細胞以多種方式對化療作出反應，包括誘導和釋放損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns， DAMP)[17]。 DAMP可誘導免疫原性細胞死亡，從而促進宿主抗癌免疫力[12]。HMGB1是DAMP家族成員之一[18]。最近研究報道，由于前列腺素E2 (prostaglandin，PGE2)的作用，致使HMGB1并沒有激活免疫活力的能力[17,19]。研究報道，HMGB1的敲低會增加細胞死亡，并在體內和體外恢復癌細胞的化學敏感性[20]，這表明此敲低可能導致誘導癌癥進展和耐藥性。釋放到細胞外HMGB1可增強化療后幸存的殘余癌細胞的再生、轉移和化學耐藥性，例如釋放的HMGB1能夠促進骨髓瘤、乳腺癌、 肺腺癌、 前列腺癌、甲狀腺癌及鼻咽癌等細胞的耐藥性[21-26]。從本研究的結果可看出，BBR抑制了HMGB1的表達，提示BBR抑制DU145R細胞活力和增殖與HMGB1相關。此外，HMGB1在前列腺癌組織中表達明顯增加，HMGB1高表達與前列腺患者不良預后相關。HMGB1作為檢測對前列腺癌診斷指標之一[27-28]，說明HMGB1與前列腺癌具有臨床相關性。綜上所述，HMGB1是耐藥前列腺癌細胞細胞的理想靶標。

有研究發(fā)現，BBR能夠抑制順鉑耐藥的胃癌細胞BGC-823及SGC-7901的活力[29]，抑制阿霉素耐藥的乳腺癌細胞MCF-7活力及增殖[30]。與本研究結果相似，BBR能夠有效地抑制DU145R細胞的活力及增殖。本課題組前期研究結果表明HMGB1表達促進CRPC細胞PTX耐藥[11]。本研究結果顯示BBR可明顯抑制HMGB1在DU145R細胞的表達。

綜上所述，BBR可以通過下調HMGB1表達抑制DU145R細胞活力和增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤增殖活性，說明BBR有望成為克服PTX耐藥的候選化藥物。本研究未在動物體內進行體內實驗驗證，未來的工作中將在PTX抗性的CRPC小鼠模型中驗證BBR是否可抑制PTX耐藥。雖然本研究存在一定的局限性，但發(fā)現BBR能靶向HMGB1，從而為臨床上研究新藥物提供了新靶點。