ACE2、TMPRSS2表達與小鼠COVID-19易感年齡及潛在靶器官關(guān)系的探討

喻博識，陳文娟，陳小慧，王星云，余章斌，韓樹萍

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)對全球人類健康構(gòu)成重大威脅。COVID-19潛伏期平均5～7 d，因年齡及免疫狀況差異，患者從癥狀出現(xiàn)到死亡時間為6～41 d，70歲以上患者重癥率明顯高于70歲以下；輕、中癥患者癥狀輕微，以發(fā)熱、乏力和干咳為主，部分患者可出現(xiàn)呼吸困難、低氧血癥和急性呼吸窘迫綜合癥，發(fā)展為重癥肺炎而危及生命；住院患者中因感染導(dǎo)致的心肌損傷(心肌炎、心肌缺血等)發(fā)生率很高，此外惡心、嘔吐和腹瀉等胃腸道癥狀也較常見；COVID-19由新型冠狀肺炎病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起，SARS-CoV-2利用冠狀病毒刺突糖蛋白(S蛋白)與宿主血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受體結(jié)合進入細胞，而S蛋白則需要跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2, TMPRSS2)的啟動激活，TMPRSS2-SARS-CoV-2 S蛋白-ACE2感染軸被認為是SARS-CoV-2感染宿主細胞的潛在入侵通路；SARS-CoV-2與SARS-CoV有88%的同源性，但SARS-CoV-2 S蛋白與細胞表面ACE2受體的結(jié)合能力是SARS-CoV S蛋白的10～20倍，表明SARS-CoV-2具有更強傳染能力，這也是目前COVID-19全球大流行的原因之一。該研究擬檢測ACE2與TMPRSS2在小鼠不同年齡、不同組織中基因和蛋白的表達，揭示COVID-19的易感年齡與潛在靶器官。

1 材料與方法

1.1 材料

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實驗動物及分組 根據(jù)文獻所述小鼠年齡分段標(biāo)準(zhǔn)，于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物中心購買不同年齡雄性C57BL/6小鼠共12只，均分為四組：新生組，1～3日齡；幼齡組，1月齡；成年組，3月齡；老齡組，18月齡。

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主要試劑與儀器 TRIzol 購自美國Invitrogen 公司；動物組織總RNA 提取試劑盒購自北京天根公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購自日本TAKARA公司；ACE2、TMPRSS2和GAPDH引物序列由查詢基因序列網(wǎng)站(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)所得，并委托南京銳真生物科技公司合成；Real-time PCR儀(美國UVP公司產(chǎn)品)；BCA蛋白定量試劑盒(北京碧云天生物有限公司)；ACE2兔源抗體( 稀釋濃度為1 ∶1 000)、TMPRSS2兔源抗體(稀釋濃度為1 ∶1 000)、GAPDH兔源抗體稀釋濃度為1 ∶5 000)(美國Affinity公司)。

1.2 方法

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小鼠和人的ACE

2

、TMPRSS

2

蛋白氨基酸序列保守性分析 通過氨基酸序列查詢網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/)對小鼠和人的ACE2、TMPRSS2蛋白進行Protein BLAST蛋白氨基酸序列保守性分析。

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組織樣品制備 將12只不同年齡小鼠麻醉(10%水合氯醛腹腔注射，0.05 ml/10 g)后，分別取肺、小腸和心臟組織，每份不同組織來源樣品又分為3份：1份組織為50 mg用于總RNA提取及后續(xù)的RT-qPCR實驗；1份組織為200 mg用于組織蛋白提取；剩余組織置于EP管-80 ℃凍存?zhèn)浞荨?p>1

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RT-qPCR檢測小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA表達量 小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA表達量采用RT-qPCR檢測。① 總RNA提取：用TRIzol試劑從組織中分離總RNA；② 逆轉(zhuǎn)錄：利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;③ 擴增：用PCR的方法擴增cDNA;④檢測:實時檢測和定量擴增的產(chǎn)物。擴增結(jié)束后所得Ct 值采用相對定量法以GAPDH 為內(nèi)參基因計算目的基因表達量，讀取目的基因及內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(Ct值)，并計算目的基因與內(nèi)參基因Ct值差值(ΔCt)，以2值代表目的基因mRNA表達水平，所用引物序列見表1。

表1 小鼠ACE2、TMPRSS2 和GAPDH引物序列

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2

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Western blot檢測ACE2和TMPRSS2蛋白表達量 應(yīng)用RIPA 裂解液及蛋白酶抑制劑(100 ∶1)提取組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度并調(diào)節(jié)蛋白濃度一致，加入蛋白上樣緩沖液水浴煮沸，分裝后-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離后常規(guī)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉溶液中封閉后與一抗孵育過夜。次日復(fù)溫后TBST洗膜、二抗孵育、TBST再次洗滌后加入化學(xué)發(fā)光液，凝膠電泳成像系統(tǒng)進行圖像采集。

2 結(jié)果

2.1 小鼠與人ACE2、TMPRSS2氨基酸序列保守性比較

保守性分析結(jié)果顯示，小鼠與人ACE2序列一致性達82.1%，TMPRSS2序列一致性達78.4%，結(jié)果提示小鼠和人ACE2與TMPRSS2高度同源。見圖1。

圖1 人和小鼠來源ACE2、TMPRSS2氨基酸序列同源性分析

2.2 不同年齡小鼠同組織間ACE2、TMPRSS2 mRNA表達水平

ACE2、TMPRSS2 mRNA在肺組織中的表達結(jié)果顯示：老齡組>成年組>幼齡組>新生組(

F

=81.455、42.144，

P

<0.001、

P

<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；ACE2、TMPRSS2 mRNA在腸道組織中的表達結(jié)果顯示：老齡組>成年組>幼齡組>新生組(

F

=113.187、169.555，

P

<0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；ACE2、TMPRSS2 mRNA在心臟組織中的表達結(jié)果提示：成年組>幼齡組>新生組>老齡組(

F

=11.218、159.535，

P

<0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 不同年齡組小鼠相同組織間ACE2、TMPRSS2 mRNA表達水平差異

2.3 同齡小鼠肺、小腸和心臟組織ACE2和TMPRSS2 mRNA表達水平

新生組小鼠肺組織ACE2、TMPRSS2 mRNA表達高于小腸和心臟組織(

F

=172.185、90.314，

P

<0.001)；幼齡組小鼠肺組織ACE2、TMPRSS2 mRNA表達高于小腸和心臟組織(

F

=211.336、224.434，

P

<0.001)；成年組小鼠肺組織ACE2、TMPRSS2 mRNA表達高于小腸和心臟組織(

F

=377.493、73.239，

P

<0.001)；老齡組小鼠肺組織ACE2和TMPRSS2 mRNA表達高于小腸和心臟組織(

F

=136.343、778.623，

P

<0.05)。見圖3。

圖3 同齡小鼠肺、小腸和心臟組織ACE2和TMPRSS2 mRNA表達水平

2.4 不同年齡小鼠不同組織間ACE2、TMPRSS2蛋白表達水平

不同年齡組同組織水平，小鼠肺組織和小腸組織ACE2、TMPRSS2蛋白表達隨年齡增長而逐漸增高，心臟組織幼年組和成年組表達水平逐漸升高，老齡組則表達下降；同年齡維度下，肺組織表達量較高，小腸次之，心臟最低，趨勢與基因水平一致。見圖4。

圖4 不同年齡小鼠同組織間ACE2和TMPRSS2蛋白表達水平以及同齡小鼠肺、小腸和心臟組織ACE2和TMPRSS2 蛋白表達水平

3 討論

ACE2、TMPRSS2在特定組織的同時高表達，構(gòu)成了TMPRSS2-SARS-CoV-2 S蛋白-ACE2感染軸，這是SARS-CoV-2的潛在感染途徑。ACE2是一種附著在肺、心臟、腎臟和腸道等細胞外表面(細胞膜)的酶，屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶家族；ACE2在器官的特異性表達提示其可能在調(diào)節(jié)心血管和腎臟功能以及生育方面發(fā)揮作用。此外，ACE2作為一種跨膜蛋白，是某些冠狀病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV(引起SARS的病毒)和SARS-CoV-2(導(dǎo)致COVID-19的病毒)進入細胞的主要結(jié)合受體。具體而言，SARS-CoV-2的S蛋白與細胞表面ACE2酶促結(jié)構(gòu)域的結(jié)合會導(dǎo)致病毒被內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運進入細胞，這種進入過程還需要宿主TMPRSS2引發(fā)S蛋白的啟動，TMPRSS2屬于絲氨酸蛋白酶家族，已有研究顯示，S2位點的第2個精氨酸可能是TMPRSS2激活中東呼吸綜合征冠狀病毒S蛋白所必需的，TMPRSS2激活SARS-CoV-2 S蛋白的具體機制，則有待進一步研究。有研究顯示，雄激素受體拮抗藥物可抑制ACE2和TMPRSS2的表達，并抑制男性COVID-19患者過度的炎癥反應(yīng)，此類抑制ACE2或TMPRSS2表達的藥物或可治療COVID-19。

臨床研究表明，患者年齡與臨床表現(xiàn)乃至預(yù)后存在確切相關(guān)性，且肺、小腸和心臟均可能是SARS-CoV-2靶器官。相對成人而言，大多數(shù)SARS-CoV-2感染患兒有更輕微的臨床表現(xiàn)，無癥狀感染患兒也不少見。已有研究表明，COVID-19主要影響呼吸功能，絕大多數(shù)患者因呼吸衰竭死亡；此外，心臟損傷是COVID-19的一個顯著特征，通常意味著更差的預(yù)后。患者還出現(xiàn)惡心、嘔吐和腹瀉等胃腸道癥狀，腹瀉是兒童和成人最常見的胃腸道癥狀，嘔吐在兒童中更為突出。

小鼠、人ACE2和TMPRSS2氨基酸序列保守性分析結(jié)果顯示，小鼠源ACE2和TMPRSS2與人源ACE2和TMPRSS2具有高度相似性。有研究顯示，ACE2 的18個氨基酸殘基通過氫鍵、鹽橋或多個范德華力與SARS-CoV-2S蛋白受體結(jié)合區(qū)域 的14 個氨基酸殘基相互作用，故檢測小鼠水平ACE2與TMPRSS2表達對揭示人類SARS-CoV-2易感性的年齡差異與潛在靶標(biāo)具有一定參考價值。

本研究檢測不同年齡小鼠同組織間ACE2和TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平。實驗結(jié)果表明：ACE2和TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平在肺和小腸組織中，隨著年齡增長逐漸升高，這與已有臨床證據(jù)，即相對成人而言，大多數(shù)SARS-CoV-2感染患兒有更輕微的臨床表現(xiàn)，較小年齡與較低病死率存在相關(guān)性這一現(xiàn)象基本符合。同樣，檢測同齡大鼠肺、小腸和心臟組織ACE2和TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平，實驗結(jié)果表明：肺組織表達量較高，小腸次之，心臟最低；驗證了肺是SARS-CoV-2最主要的靶器官，COVID-19主要損害患者呼吸功能。

小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平的年齡差異一定程度解釋了目前不同年齡人群對COVID-19的易感性差異及不同年齡患者的臨床表現(xiàn)差異,但尚有其它干擾因素需要考慮，如一項前瞻性研究顯示，男性高齡患者，伴有基礎(chǔ)疾病等與COVID-19重癥和死亡風(fēng)險增加有關(guān)。小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平的組織差異解釋了肺作為SARS-CoV-2入侵首要靶器官的原因。但ACE2、TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平高低與組織病變程度并不是絕對正相關(guān)，如心臟相對肺部和小腸低表達，而住院患者中SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的心肌損傷(心肌炎/心肌缺血等)發(fā)生率很高。一項回顧性隊列研究表明，老年、炎癥反應(yīng)和潛在的心血管并發(fā)癥和SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的心肌損傷有關(guān)，具體機制可能涉及感染后期的直接病毒損傷、炎性細胞因子/趨化因子介導(dǎo)的免疫損傷和細胞毒性免疫細胞反應(yīng)，這種機體過度免疫引起的炎癥風(fēng)暴不僅損傷心肌，更可能導(dǎo)致重癥患者出現(xiàn)多器官功能衰竭，危及生命。最新研究顯示，這種多系統(tǒng)炎癥綜合征若發(fā)生在兒童COVID-19患者，會嚴(yán)重威脅兒童生命。

綜上所述，隨著C57BL/6小鼠年齡的增長，肺、小腸組織的ACE2和 TMPRSS2基因及蛋白表達隨之增加，提示高齡可能是SARS-CoV-2感染的獨立危險因素之一；肺組織ACE2、TMPRSS2基因和蛋白相對于小腸和心臟等組織的高表達，驗證了肺是SARS-CoV-2入侵機體的首要靶器官。以上研究結(jié)果，為COVID-19預(yù)防和治療相關(guān)研究提供了新思路，ACE2和 TMPRSS2基因及蛋白在不同組織的表達差異，有助提高臨床醫(yī)生診斷鑒別COVID-19相關(guān)并發(fā)癥的敏感度，也提醒臨床醫(yī)生注意出院患者的隨訪，觀察遠期預(yù)后。同時住院患者中SARS-CoV-2感染導(dǎo)致心肌損傷的較高發(fā)生率以及兒童多系統(tǒng)炎癥綜合征等新情況的出現(xiàn)，凸顯了COVID-19及其病原體SARS-CoV-2的復(fù)雜性，亟待進一步深入研究。