針刺對高血壓大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)氧化應(yīng)激水平影響的研究

王雪蕊 郭玉紅 徐霄龍 白云靜 劉清泉

摘要 目的：從自由基來源和清除的角度探討針刺對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（RVLM）中氧化應(yīng)激水平影響的潛在機(jī)制。方法：15只Wistar（WKY）大鼠為正常組，45只SHR大鼠隨機(jī)分為高血壓組、針刺組和非穴組。針刺組取“太沖穴”直刺，非穴組取非穴位淺刺，治療1次/d，共14 d。采用遙測技術(shù)檢測針刺對血壓的影響;采用DHE染色檢測針刺對RVLM中活性氧族（ROS）變化的影響;采用化學(xué)發(fā)光法檢測針刺對RVLM中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮合酶（NOS），和NADPH氧化酶活性的影響;采用Western Blot檢測針刺對RVLM中NADPH氧化酶、SOD、NOS各亞基或亞型蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：與正常組比較，高血壓組大鼠收縮壓顯著增高（P<0.05），RVLM中ROS產(chǎn)生增多（P<0.05），NADPH氧化酶活性增高（P<0.05），其亞基gp91phox、p22phox和nNOS蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與高血壓組和非穴組比較，針刺干預(yù)可顯著下調(diào)SHR大鼠的收縮壓（P<0.05），降低RVLM中ROS的水平（P<0.05），下調(diào)NADPH氧化酶活性（P<0.05）。各組中SOD和NOS活性，SOD1、SOD2和iNOS蛋白表達(dá)水平無顯著改變。結(jié)論：針刺可顯著改善SHR大鼠血壓，降低RVLM中ROS的水平，其機(jī)制可能與下調(diào)NADPH氧化酶亞基gp91phox、p22phox、及NOS亞型nNOS的表達(dá)水平相關(guān)。

關(guān)鍵詞 高血壓;針刺;氧化應(yīng)激;延髓頭端腹外側(cè)區(qū);大鼠

Effects of Acupuncture on Oxidative Stress in the Rostral Ventrolateral Medulla of Spontaneously Hypertensive Rats

WANG Xuerui，GUO Yuhong ，XU Xiaolong，BAI Yunjing，LIU Qingquan

（Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To explore the potential mechanism of acupuncture on oxidative stress level in the rostral ventrolateral medulla （RVLM） of spontaneously hypertensive rats （SHR） from the perspective of free radical source and elimination.Methods：A total of 15 Wistar （WKY） rats were in the normal group，and 45 SHR rats were randomly divided into a model group，an acupuncture group and a non-acupoint group.In the acupuncture group，“Taichong” acupoints were used for treatment once a day for 14 days.In the non-acupoint group received superficial needling was used.The effects of acupuncture on blood pressure were measured by telemetry; the effects of acupuncture on the changes of reactive oxygen species （ROS） in RVLM were detected by DHE staining; the effects of acupuncture on the activities of superoxide dismutase （SOD），nitrogen synthase （NOS） and NADPH oxidase activity in RVLM were detected by chemiluminescence; and the effects of acupuncture on the subunits or subunits expression of NADPH oxidase，SOD and NOS in RVLM were detected by Western Blot.Results：Compared with the normal group，the systolic blood pressure of the model group was significantly increased （P<0.05），ROS production in RVLM increased （P<0.05），the NADPH oxidase activity increased （P<0.05），and the protein expression levels of gp91phox，p22phox and nNOS were significantly increased （P<0.05）.com

pared with the model group and non-acupoint group，acupuncture intervention could significantly down-regulate the systolic blood pressure of SHR rats （P<0.05），the level of ROS in RVLM （P<0.05），and the activity of NADPH oxidase （P<0.05）.There was no significant change in the SOD and NOS activities，the protein expression of SOD1，SOD2 and iNOS among each groups.Conclusion：Acupuncture could significantly reduce high blood pressure and ROS levels in the RVLM of SHR rats.The mechanism may be related to the down-regulation of the expression of NADPH oxidase subunits gp91phox，p22phox and NOS subtype nNOS.

Keywords Hypertension; Acupuncture; Oxidative stress; Rostral ventrolateral medulla; Rats

中圖分類號(hào)：R245文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.012

高血壓病是最為常見的心血管疾病之一，目前我國約有患者2億人，其造成的靶器官損害嚴(yán)重影響了人民群眾的健康[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是影響高血壓發(fā)生發(fā)展和導(dǎo)致靶器官損傷的關(guān)鍵因素[2-3]。生理狀態(tài)下，體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)維持動(dòng)態(tài)平衡，防止活性氧族（ROS）對機(jī)體的損害。在高血壓的病理狀態(tài)下，機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和消除失衡導(dǎo)致ROS在過量蓄積，從而引起氧化應(yīng)激。ROS的主要來源包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，其他來源包括一氧化氮合成酶脫偶聯(lián)（NOS）等。機(jī)體各組織包括血清中也包含有一定活性的抗氧化酶系，可及時(shí)有效地清除ROS。其中，超氧化物歧化酶（SOD）是體內(nèi)含量最為廣泛的抗氧化劑，可以通過清除自由基防止靶器官的氧化損傷。在高血壓的病理狀態(tài)下，中樞內(nèi)增多的ROS引起的氧化應(yīng)激通過刺激延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（RVLM）交感神經(jīng)元，引起交感神經(jīng)興奮性傳出增加，導(dǎo)致血壓升高[4-5]。研究表明，通過腦定位在RVLM中注射SOD模擬物Tempol、特異性基因敲低神經(jīng)性一氧化氮合酶等方法來降低RVLM中的氧化應(yīng)激水平，均可顯著降低交感神經(jīng)興奮性，改善血壓[6-7]。針灸是中醫(yī)藥中非常有代表性的一類治療方法，已有大量研究發(fā)現(xiàn)針灸療法可以下降高血壓患者的血壓或改善其相關(guān)癥狀[8-11]。在機(jī)制研究中同樣發(fā)現(xiàn)者針刺治療可改善自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓[12-14]。本研究旨在從ROS產(chǎn)生來源和清除能力兩方面，研究針刺對機(jī)體內(nèi)NADPH氧化酶、NOS活性和SOD活性的調(diào)節(jié)作用，探討針刺對中樞系統(tǒng)氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的機(jī)制，為擴(kuò)大針灸的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性SHR和WKY大鼠，體質(zhì)量均為180～220 g，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證編號(hào)：SCXK（京）2006-009），由北京市中醫(yī)研究所專人飼養(yǎng)。45只SHR采用隨機(jī)數(shù)字表法分為高血壓組、針刺組、非穴組，每組15只。15只WKY大鼠作為正常組。實(shí)驗(yàn)過程符合北京市中醫(yī)研究所動(dòng)物倫理。

1.2 試劑和儀器

無線生理信號(hào)遙測系統(tǒng)（型號(hào)：植入式DSCF-08）和心電植入子（型號(hào)：ECG-DSCF-FS01）均購買于北京軟隆生物技術(shù)有限公司;

SOD測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，型號(hào)：A001-3-2），總NOS測試盒（南京建成生物工程研究所，型號(hào)：A014-2-2），NADPH氧化酶活性測試盒（南京建成生物工程研究所，型號(hào)：A127-1-1），BCA蛋白定量試劑盒（abcam，英國，型號(hào)：ab102536），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國賽默飛，美國，型號(hào)：Q1010）。

1.3 方法

1.3.1 針刺操作

根據(jù)華興邦動(dòng)物穴位圖譜選取穴位，針刺組選取雙側(cè)太沖穴。太沖穴定位為大鼠后肢足背側(cè)第1、2跖骨間凹陷處;非穴點(diǎn)定位為大鼠后肢足背側(cè)第3、4跖骨間凹陷處。大鼠非麻醉狀態(tài)下進(jìn)行針刺操作，穴位組直刺法30 s，留針10 min。非穴組淺刺不行手法，留針10 min。針刺組及非穴組1次/d，連續(xù)14 d。其他組與針刺組和非穴組進(jìn)行相同時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。

1.3.2 DHE染色

收取各組大鼠大腦組織OCT冰凍包埋劑包埋，冠狀位厚度為10 μm連續(xù)冰凍切片。將所有包含RVLM的切片按順序放置于裝有凍存液的24孔反應(yīng)板內(nèi)，Triton破膜后進(jìn)行DHE染色。在熒光顯微鏡下觀察并拍片，并用Image-Proò Plus（IPP）6.0圖像分析軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，結(jié)果以相對ROS熒光強(qiáng)度單位表示。

1.3.3 SOD活性、NOS活性和NADPH氧化酶檢測? 化學(xué)法檢測SOD、NOS和NADPH氧化酶活性。在冰上快速分離各組RVLM組織，在低溫下勻漿后采用BCA法測定蛋白濃度。10 μL蛋白上清液混合10 μL Lucigenin和980 μL Krebs液，測量個(gè)樣本在340 nm波長的吸光度，反應(yīng)期后每30 s記錄一次數(shù)值，并計(jì)算其平均值，為其活性：平均值×2/蛋白濃度。單位為RLU/min/mg protein，RLU=Relative Light Unit。

1.3.4 Western Blot法檢測

別收取不同組RVLM組織勻漿后，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法檢測總蛋白的濃度。采用10%濃度凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入NADPH氧化酶亞基gp91phox、p22phox，SOD亞型SOD1、SOD2，NOS亞型誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible Nitric oxide Synthase，iNOS）、神經(jīng)型一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，nNOS）一抗（1∶1 000），4 ℃搖床過夜。加入對應(yīng)熒光二抗對硝酸纖維膜上的蛋白進(jìn)行測定，GAPDH作為參比蛋白，檢測信號(hào)經(jīng)Odssey遠(yuǎn)紅外成像儀進(jìn)行分析蛋白表達(dá)量變化。Image J對灰度進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并用Turkey法作組間多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 針刺不同時(shí)間點(diǎn)對自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓的影響

針刺治療后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠收縮壓見圖1。與正常組比較，高血壓組大鼠收縮壓隨著時(shí)間推移逐漸增高，在第14天達(dá)到高峰（P<0.05）。與高血壓組比較，針刺治療顯著下降了SHR的收縮壓，于第8天開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與非穴組比較，針刺顯著下調(diào)SHR大鼠的收縮壓（P<0.05）。

2.2 針刺下調(diào)延髓頭端腹外側(cè)區(qū)ROS水平

針刺治療14 d后各組大鼠RVLM中ROS水平見圖2。與正常組比較，高血壓組大鼠RVLM中ROS熒光強(qiáng)度顯著升高（P<0.05）。與高血壓組和非穴組比較，針刺治療顯著降低了SHR RVLM中ROS的產(chǎn)生水平（P<0.05）。

2.3 針刺對自發(fā)性高血壓大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)SOD活性、NOS活性和NADPH氧化酶活性的影響? 針刺治療14 d后各組大鼠RVLM中SOD活性、NOS活性和NADPH氧化酶活性見圖3。與正常組比較，高血壓組RVLM中NADPH氧化酶活性上調(diào)顯著（P<0.05）。與高血壓組和非穴組比較，針刺治療顯著降低NADPH氧化酶活性（P<0.05）。而SOD活性和NOS活性在各組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 針刺對自發(fā)性高血壓大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)NADPH氧化酶、SOD、NOS各亞基或亞型蛋白表達(dá)的影響

針刺治療14 d后取各組大鼠RVLM組織，采用Western Blot法檢測各組大鼠組織中NADPH氧化酶亞基gp91phox、p22phox，SOD亞型SOD1、SOD2和NOS亞型iNOS、nNOS的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果見圖4和表1，與正常組比較，高血壓組大鼠NADPH氧化酶亞基gp91phox和p22phox，以及NOS亞型nNOS蛋白表達(dá)水平升高顯著（P<0.05）。與高血壓組比較，針刺治療顯著降低了gp91phox、p22phox、nNOS蛋白表達(dá)水平（P<0.05）。與針刺組比較，非穴組gp91phox蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）。SOD1、SOD2和iNOS蛋白表達(dá)水平在各組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

高血壓為當(dāng)今世界最常見的心血管疾病之一，2010年中國慢性病監(jiān)測調(diào)查顯示中國高血壓患者人數(shù)約為3.3億[15]。升高的血壓是多種急危重癥疾病如心肌梗死、心臟衰竭、腦卒中等的常見危險(xiǎn)因素[16]。針灸療法是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的代表性療法，既往研究發(fā)現(xiàn)其對高血壓具有改善作用[8-11]。高血壓在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“眩暈”“頭痛”等范疇。《素問·至真要大論篇》記載“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，指出本病的發(fā)生責(zé)之于肝。本研究選擇太沖穴作為主穴，太沖穴為足厥陰肝經(jīng)原穴，具有清瀉肝火、平肝潛陽等作用，是臨床治療高血壓的常用穴位。郝婷等利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析等方法探索針刺治療原發(fā)性高血壓腧穴配伍規(guī)律，發(fā)現(xiàn)以太沖穴、曲池穴、足三里穴等為主的臨床常用治療原發(fā)性高血壓核心腧穴組合，其中太沖穴是應(yīng)用頻次和頻率最高的主穴位[17]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，單穴刺激太沖穴對于SHR血壓的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于單穴刺激足三里穴、百會(huì)穴、或非穴[12]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺太沖穴可顯著下調(diào)SHR收縮壓，而非穴組卻無此療效。本研究旨在從氧化應(yīng)激的角度探討針刺的降壓機(jī)制。

氧化應(yīng)激機(jī)體最為常見的損傷反應(yīng)，是指機(jī)體對組織產(chǎn)生的自由基清除過少、或產(chǎn)生過多導(dǎo)致ROS蓄積造成的氧化損傷過程。高血壓的發(fā)病機(jī)制和發(fā)生發(fā)展過程與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，高血壓患者體內(nèi)氧化/抗氧化失調(diào)，引起氧化應(yīng)激，不僅可以損傷外周血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等，也會(huì)作用于中樞RVLM等多個(gè)核團(tuán)，引起交感神經(jīng)興奮性增加，血壓升高[4-5]。利用NADPH氧化酶抑制劑、SOD模擬物等抗氧化劑在RVLM中注射，可以降低RVLM中的氧化應(yīng)激水平，改善升高的血壓[6-7]。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較高血壓大鼠RVLM中ROS的水平增高，針刺能顯著下調(diào)RVLM中ROS的水平，提示針刺的降壓作用可能與調(diào)節(jié)中樞氧化應(yīng)激水平有關(guān)，但是針刺對氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)機(jī)制是否與活性氧的產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，仍有待進(jìn)一步探討。

多種因素都能影響ROS的生成與清除的動(dòng)態(tài)過程，從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。其中NADPH氧化酶及NOS是最常見的自由基來源，而SOD則體內(nèi)是清除自由基的最常見抗氧化劑。NADPH氧化酶被稱為ROS生成的“專業(yè)戶”[18]。該酶是由膜亞基 gp91phox和p22phox，胞漿亞基p47phox、p67phox、p40phox和Rac等結(jié)合組成的酶復(fù)合體，負(fù)責(zé)將電子轉(zhuǎn)移給O2形成O2-從而產(chǎn)生ROS[19]。研究發(fā)現(xiàn)在大腦核團(tuán)中NADPH氧化酶亞基均可可檢測到表達(dá)，且以gp91phox催化亞基形成的NADPH同源物NOX2功能最為顯著[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化酶活性在高血壓大鼠RVLM中顯著上調(diào)，針刺干預(yù)可降低NADPH氧化酶活性，并下調(diào)NADPH亞基gp91phox、p22phox的蛋白表達(dá)水平，說明針刺對氧化應(yīng)激動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)的機(jī)制可能主要與其對NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)有關(guān)。NOS通過特異性催化底物L(fēng)-精氨酸合成NO，是NO的主要來源。NO廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，作為細(xì)胞信使分子參與血管張力及局部血流的調(diào)節(jié)，是體內(nèi)重要的抗氧化及抗高血壓保護(hù)因子。NOS的亞型中nNOS和iNOS具有神經(jīng)毒性作用。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針刺后RVLM中NOS活性和iNOS的蛋白表達(dá)沒有顯著改變，但nNOS的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，說明針刺對NOS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能存在一定的調(diào)節(jié)作用。SOD是體內(nèi)最廣泛分布的抗氧化酶，通過調(diào)節(jié)超氧陰離子的氧化還原反應(yīng)進(jìn)行ROS的有效清除。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠RVLM中SOD活性沒有顯著變化，針刺干預(yù)對其沒有顯著的調(diào)節(jié)作用。SOD亞基SOD1和SOD2的蛋白表達(dá)水平在針刺前后沒有顯著變化，說明針刺對RVLM中氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用可能與增強(qiáng)自由基的清除效應(yīng)無關(guān)。綜上所述，我們從自由基來源和清除的角度，發(fā)現(xiàn)針刺對RVLM中ROS具有調(diào)節(jié)作用。且針刺對腦內(nèi)氧化應(yīng)激的調(diào)控作用可能具有多條途徑相關(guān)，尤其是對NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有調(diào)節(jié)作用。但針刺選擇性調(diào)節(jié)NADPH氧化酶、SOD、NOS的具體機(jī)制是什么，仍有待未來深入的研究。

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（2019-10-16收稿 責(zé)任編輯：徐穎）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（82004292）;國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81973608）;國家自然科學(xué)基金專項(xiàng)項(xiàng)目（62041701）;國家科技重大專項(xiàng)（2017XZ10305501）;科技部公共安全風(fēng)險(xiǎn)防控與應(yīng)急技術(shù)裝備專項(xiàng)（2020YFC0841600）通信作者：劉清泉（1965.11—），男，學(xué)士，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合急危重癥，Tel：（010）52176095，E-mail：liuqingquan_2003@126.com