鹽脅迫對毛竹實生苗形態(tài)生理生化特征的影響

侯思璇 李傳哲 劉國華 楊蒙 鄭毅 姚文靜

摘要：為探究鹽脅迫對毛竹生長發(fā)育的影響，分析了不同濃度NaCl溶液（0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mmol/L）脅迫條件下毛竹3個月生實生苗形態(tài)生理生化特征的變化。隨著鹽脅迫濃度的增高，毛竹實生苗的葉片卷曲程度增加，葉片黃化現(xiàn)象嚴(yán)重;葉片MDA含量呈上升趨勢，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量呈先升后降的趨勢，在50.0 mmol/L NaCl脅迫6 h時達(dá)到最高;在≤50.0 mmol/L NaCl條件下，毛竹實生苗葉片氮藍(lán)四唑（NBT）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、Evans blue染色程度與對照條件相似，在>50.0 mmol/L NaCl濃度下，毛竹實生苗葉片與對照條件相比染色程度加深、面積增大。以上結(jié)果揭示了毛竹實生苗具有一定的耐鹽性（<50.0 mmol/L），為毛竹耐鹽能力鑒定和鹽堿地區(qū)毛竹的竹林培育提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：毛竹;鹽脅迫;形態(tài);生理生化特征;生化染色

中圖分類號： Q945.78;S795.701 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0136-05

竹子屬于禾本科竹亞科，具有生長迅速、可再生性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點[1]。竹子用途非常廣泛，可作筍用、觀賞用、生活用、工藝制品用、建材用等[2]。此外，竹資源在保持生態(tài)平衡和應(yīng)對氣候變化等方面也發(fā)揮著獨特作用[3]。但竹林的分布具有明顯的地帶性和區(qū)域性，主要集中在氣候溫潤的長江以南地區(qū)，在寒冷、干旱及鹽堿地區(qū)幾乎沒有生長[4-5]。因此鑒定竹種的抗逆能力，篩選出一些耐寒、耐旱、耐鹽堿的優(yōu)良竹苗，有效地篩查、選擇、拓寬竹子在我國的種植范圍，可大大提高竹子產(chǎn)量。

目前已有不少學(xué)者對環(huán)境脅迫下竹子的生長發(fā)育、生理、生化等方面進(jìn)行了研究，為竹子抗逆能力鑒定提供了科學(xué)的理論依據(jù)[6]。例如，胡俊靖等綜述了水分脅迫對竹子膜脂過氧化、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、光合生理特性等的影響，分析了竹子在水分脅迫條件下的生理適應(yīng)與響應(yīng)規(guī)律[7];應(yīng)葉青等的試驗表明，干旱脅迫條件下毛竹幼苗的光合速率、蒸騰速率、葉綠素a和葉綠素b含量與對照條件相比均有所下降，超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量等與對照相比則明顯增加[8];易守理等研究表明，大葉慈竹主要依靠較高的SOD和CAT活性抵御低溫傷害，慈竹則憑借較高的SOD 和過氧化物酶（POD）活性來抵御低溫傷害[9]。

我國江蘇沿海灘涂面積（68.7萬hm2）較大，約占全國灘涂面積的25%，且以1 300 hm2/年的速度不斷增長[10]。植樹造林是沿海灘涂鹽堿地改良的一個重要措施，然而沿海灘涂地區(qū)土壤含鹽量較高，適生樹種少。在高鹽脅迫條件下苗木難以存活是制約沿海灘涂植樹綠化的關(guān)鍵因素[11]。作為一種生長速度快、可再生性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、用途廣泛的非木質(zhì)植物資源，竹子成為生長效益和經(jīng)濟(jì)效益較高的首選綠化栽培植物之一[1-3]。其中毛竹（Phyllostachys edulis）生長密度大，是我國分布最廣、蓄積量最大、經(jīng)濟(jì)價值最高的重要經(jīng)濟(jì)竹種，我國90%的竹材都來源于毛竹[3]，因此對其鹽脅迫適應(yīng)性的研究十分重要。但至今還未有鹽脅迫對毛竹實生苗生長發(fā)育影響的系統(tǒng)研究。本研究分析不同濃度NaCl對毛竹3個月生實生苗形態(tài)生理生化方面的影響，探究毛竹實生幼苗在鹽脅迫條件下的生長發(fā)育規(guī)律，以填補毛竹實生苗耐鹽能力研究的空白。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗時間為2019年10月至2020年6月，地點為南京林業(yè)大學(xué)（118°48′42″E，32°04′34″N）。

1.2 試驗材料處理

毛竹種子采自廣西壯族自治區(qū)桂林市靈川縣。將種子播于泥炭土 ∶ 黃棕壤 ∶ 珍珠巖=12 ∶ 12 ∶ 1（體積比）的土壤中，置于20～24 ℃、光照/黑暗周期為12 h/12 h的植物光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3個月。待毛竹幼苗長出4～6張葉片時，選擇長勢較好的健康幼苗連根帶土整體挖出，用水洗凈根部放入水中繼續(xù)培養(yǎng)1周（圖1）。

水培1周后，將毛竹幼苗分別放在0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mmol/L的NaCl溶液中進(jìn)行處理，編號為0～5號，每個處理3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)10株幼苗。分別在3、6、24 h的時間點觀察毛竹實生苗的形態(tài)變化，并進(jìn)行破壞性取樣用于各項生理指標(biāo)測定和生化染色觀察。

1.3 生理生化指標(biāo)的測定

毛竹葉片SOD活性采用抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，CAT活性采用紫外吸收法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán) G-250 染色法測定，游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定[12-14]。毛竹葉片NBT、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和Evans blue染色參考煙草葉片的染色方法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對毛竹實生苗形態(tài)的影響

毛竹實生苗的外部形態(tài)變化是植物受到鹽脅迫時最直觀的反應(yīng)。如圖2所示，處理3 h，200.0 mmol/L NaCl溶液下的小部分幼苗葉片稍有卷曲，其余濃度下的幼苗均無明顯變化（圖2-A）;處理6 h，100.0、200.0 mmol/L NaCl溶液處理的毛竹幼苗葉片已經(jīng)有明顯卷曲，50.0 mmol/L NaCl溶液處理的幼苗也開始發(fā)生葉片卷曲的現(xiàn)象（圖2-B）;處理24 h，50.0、100.0、200.0 mmol/L NaCl溶液處理的毛竹幼苗均出現(xiàn)葉片卷曲的現(xiàn)象，并且隨著濃度的升高，卷曲葉片的數(shù)量越多、程度越大（圖2-C）。其中，100.0、200.0 mmol/L濃度下的毛竹葉片已經(jīng)完全卷曲，葉片也有發(fā)黃的跡象。結(jié)果表明，低濃度的NaCl溶液（<50.0 mmol/L）對毛竹實生苗形態(tài)的影響不大，但長時間、高濃度的NaCl溶液（≥100.0 mmol/L）處理會使毛竹幼苗葉片發(fā)生明顯的卷曲、黃化。隨著時間的推移和鹽濃度的增加，毛竹幼苗被脅迫的程度增加。

2.2 NaCl脅迫對毛竹實生苗生理指標(biāo)的影響

如圖3所示，毛竹葉片SOD、POD、CAT活性隨著NaCl溶液濃度的增高呈現(xiàn)先升后降的趨勢。在低濃度NaCl溶液（<50.0 mmol/L）脅迫下，隨著NaCl濃度的增加SOD、POD、CAT活性明顯增加，隨著脅迫時間增加酶活性變化明顯，脅迫處理6 h時酶活性最大。高濃度NaCl溶液脅迫下，SOD、POD、CAT活性明顯下降，酶活性隨脅迫時間延長變化不明顯。以上結(jié)果表明，低濃度NaCl溶液（<50.0 mmol/L）脅迫下，毛竹葉片所受到的脅迫程度較低，產(chǎn)生的有害物質(zhì)較少，植物體內(nèi)抗氧化酶活性的提高足以清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的有害物質(zhì)，毛竹葉片受到的損害較小;高濃度NaCl溶液（>100.0 mmol/L）脅迫下，植物體內(nèi)的酶活性無法完全催化分解有害物質(zhì)，導(dǎo)致植物膜和組織受到不可逆的嚴(yán)重?fù)p傷。毛竹葉片MDA含量隨著NaCl溶液濃度的增高和脅迫時間的增長，呈明顯上升趨勢。

當(dāng)NaCl溶液濃度≤100.0 mmol/L時，MDA含量變化隨脅迫時間延長變化較小;當(dāng)NaCl溶液濃度達(dá)到200.0 mmol/L時，MDA含量隨脅迫時間延長變化明顯，在脅迫24 h時達(dá)到最高。以上結(jié)果表明，NaCl溶液濃度越高脅迫時間越長，毛竹葉片中MDA積累越多，質(zhì)膜受損害程度越大，低濃度的鹽脅迫對毛竹幼苗影響較小，高濃度的鹽脅迫會嚴(yán)重迫害毛竹質(zhì)膜。毛竹葉片可溶性蛋白質(zhì)含量隨著NaCl溶液濃度的升高，呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。低濃度NaCl溶液（<50.0 mmol/L）脅迫可刺激毛竹有機(jī)體合成可溶性蛋白質(zhì)，提高自身的防御功能。高濃度NaCl溶液（≥100.0 mmol/L）脅迫破壞了毛竹葉片細(xì)胞生物膜及細(xì)胞內(nèi)滲透系統(tǒng)，可溶性蛋白質(zhì)合成受阻，含量下降。毛竹葉片游離脯氨酸含量隨著NaCl溶液濃度升高也呈先升后降的趨勢。低濃度NaCl溶液（<50.0 mmol/L）脅迫條件下，毛竹葉片脯氨酸含量增高趨勢明顯，脅迫處理6 h時達(dá)到最大值;高濃度NaCl溶液（≥100.0 mmol/L）脅迫時，毛竹葉片游離脯氨酸含量明顯下降。高濃度鹽脅迫導(dǎo)致植物體合成脯氨酸的能力降低。

2.3 NaCl脅迫下毛竹實生苗葉片生化染色

逆境脅迫條件下，植物體內(nèi)的活性氧平衡遭到破壞，活性氧的積累導(dǎo)致植物膜結(jié)構(gòu)損害和細(xì)胞死亡。生化染色可區(qū)分出植物活細(xì)胞，有活性的細(xì)胞有外排功能不被染色。如圖4所示，當(dāng)NaCl溶液濃度較低時（<50.0 mmol/L），毛竹葉片染色程度與對照條件下類似。隨著NaCl溶液濃度的增高和脅迫時間的延長，毛竹葉片被染色的區(qū)域變大、顏色變深，表明毛竹葉片細(xì)胞死亡數(shù)量增多。在NaCl濃度為200.0 mmol/L時，毛竹葉片染色顏色最深。說明毛竹實生苗在高濃度NaCl溶液（≥100.0 mmol/L）處理下，體內(nèi)活性氧的積累量自身不可消除，葉片細(xì)胞大量死亡，有機(jī)體受到不可逆的傷害。

3 討論與結(jié)論

逆境脅迫會影響植物的正常生長發(fā)育，導(dǎo)致植物形態(tài)、生理、生化等多方面發(fā)生變化[15]。形態(tài)上主要表現(xiàn)為葉片萎蔫變黃、葉面積減少、葉片脫落等。生理水平上的變化可從一系列生理、生化指標(biāo)中反映出來，如抗氧化酶活性、活性氧（H2O2、O-2·、·OH等）積累、死細(xì)胞數(shù)目等[15-19]。SOD是廣泛分布于植物體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶，在有機(jī)體內(nèi)起氧化與抗氧化平衡的作用[16]。POD是普遍存在于植物體內(nèi)的一種氧化還原酶，參與植物的光呼吸作用和乙醛酸循環(huán)，其活性與植物的代謝強(qiáng)度和抗逆能力存在一定關(guān)系[17]。MDA是生物體內(nèi)自由基和脂質(zhì)氧化生成的，其產(chǎn)生會加劇膜的損傷，影響線粒體部分關(guān)鍵酶活性和呼吸復(fù)合鏈[18]。CAT普遍存在于各種生物有機(jī)體細(xì)胞中，可催化細(xì)胞中的過氧化氫轉(zhuǎn)化為無害或傷害較小的其他物質(zhì)以降低對植物機(jī)體造成的損害[19]。植物為了抵抗逆境脅迫會啟動防御系統(tǒng)，清除植物體內(nèi)的活性氧等有害物質(zhì)。當(dāng)植物受到的傷害過大，植物體內(nèi)有害物質(zhì)的產(chǎn)生與清除失去平衡，可能會導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡如脂質(zhì)過氧化、膜損傷、酶失活等，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17-19]。

本研究以毛竹3個月實生幼苗為研究對象，分析了不同濃度NaCl溶液對其形態(tài)生理生化方面的影響。低濃度鹽脅迫條件下，毛竹幼苗形態(tài)上的變化較小。但在高濃度鹽脅迫下，毛竹實生苗葉片就會發(fā)生明顯卷曲、黃化。隨著鹽脅迫濃度的增高和脅迫時間的延長，毛竹實生苗葉片MDA含量呈上升趨勢，與觀音竹、綠竹MDA含量隨鹽分脅迫的加重而提高的試驗結(jié)果[20-21]一致。毛竹實生苗葉片SOD、POD、CAT活性表現(xiàn)為先升高后降低的規(guī)律，與不同濃度鹽脅迫下白竹及其他植物如柳樹、素馨屬植物、李屬彩葉植物等的酶活性表現(xiàn)出先升后降的趨勢[22-25]一致。毛竹實生苗葉片游離脯氨酸含量隨著鹽濃度的增高也出現(xiàn)先增后減的趨勢，與綠竹、大頭典、吊絲單隨脅迫強(qiáng)度的增強(qiáng)和脅迫時間的延長而增加的結(jié)果[26]不同，但與其他植物在不同濃度鹽脅迫后游離脯氨酸含量變化的研究結(jié)果[23-25]一致。生化染色結(jié)果表明，毛竹實生苗葉片染色程度隨著鹽濃度增加而加深，間接說明在高濃度鹽脅迫下毛竹實生苗葉片會積累大量活性氧，造成細(xì)胞的大量死亡。綜上，在一定鹽濃度范圍內(nèi)，毛竹實生苗可通過調(diào)節(jié)自身內(nèi)部物質(zhì)和抗氧化酶活性降低外界脅迫對植物機(jī)體造成的傷害。毛竹實生苗所能承受的鹽濃度為50 mmol/L（約0.3%），低于綠竹、大頭典、吊絲單等所能忍受的鹽分質(zhì)量（0.4%）[26]和觀音竹所能承受的鹽分質(zhì)量（0.5%）[20]，可能原因是選取的竹子苗期不同，毛竹為3個月生實生苗，而其他研究中選取的竹子為成苗。

我國鹽堿地面積大、分布范圍廣，長江以北地區(qū)和諸多沿海地區(qū)，特別是江蘇沿海地區(qū)的土壤中往往鹽含量過高，限制了竹子的生長范圍。目前利用種子培育實生苗是篩選優(yōu)良無性系和竹類植物種質(zhì)創(chuàng)新的有效途徑[27]。確定了毛竹實生苗的耐鹽限度，能有效地篩查、選擇和拓展毛竹實生苗造林的區(qū)域，或者通過土壤改良使其適宜毛竹實生苗的生長，為拓寬毛竹在江蘇沿海灘涂鹽堿地的種植范圍、提高江蘇省毛竹產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

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