昆蟲取食和機(jī)械損傷對(duì)棉花和玉米脂氧合酶活性的誘導(dǎo)作用

呂敏 衛(wèi)甜 劉懷阿 蘇建坤

摘要：脂氧合酶（LOX）是植物防御反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，脂氧合酶途徑的產(chǎn)物包括茉莉酸、綠葉揮發(fā)物等，在植物防御反應(yīng)中起著重要作用。為了明確脂氧合酶在昆蟲取食和機(jī)械損傷誘導(dǎo)植物通信中的作用，以棉花、玉米為研究對(duì)象，分析不同處理（包括棉蚜取食和機(jī)械損傷誘導(dǎo)棉花及其相應(yīng)揮發(fā)物誘導(dǎo)鄰近玉米、玉米螟取食和機(jī)械損傷誘導(dǎo)玉米及其相應(yīng)揮發(fā)物誘導(dǎo)鄰近棉花）的誘導(dǎo)防御機(jī)制，測(cè)定不同方法處理24、48、72 h后棉花、玉米的脂氧合酶的活性。結(jié)果表明，昆蟲取食和機(jī)械損傷不僅會(huì)誘導(dǎo)棉花、玉米植株的LOX活性升高，還能誘導(dǎo)鄰近健康植株的LOX活性升高。研究結(jié)果表明，脂氧合酶在昆蟲取食和機(jī)械損傷誘導(dǎo)的棉花、玉米間通信中起作用。

關(guān)鍵詞：脂氧合酶;昆蟲取食;機(jī)械損傷;棉花;玉米;誘導(dǎo)防御機(jī)制

中圖分類號(hào)： S188+.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）10-0086-05

植物在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中形成了多種誘導(dǎo)防御機(jī)制來抵御生物因子的入侵[1]，昆蟲取食作為一種重要的生物脅迫而廣泛存在于自然界中[2]。面對(duì)昆蟲的取食危害，植物形成了直接誘導(dǎo)和間接誘導(dǎo)2種防御機(jī)制。直接誘導(dǎo)防御是指植物產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)直接殺傷昆蟲，間接誘導(dǎo)防御是指植物通過釋放一系列特定的揮發(fā)性化合物吸引昆蟲的捕食性、寄生性天敵，從而減少昆蟲的危害。脂氧合酶是昆蟲取食誘導(dǎo)的揮發(fā)性化合物形成過程中的關(guān)鍵酶。

脂氧合酶（lipoxygenase，簡(jiǎn)稱LOX）在生物體內(nèi)主要催化含有（Z，Z）-1，4戊二稀結(jié)構(gòu)單元的不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，生成過氧化物及其一系列次生產(chǎn)物。脂氧合酶是植物代謝過程中的關(guān)鍵酶，它在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老、抗蟲、抗病及抗脅迫等過程中起著重要作用[3]。脂氧合酶通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，只有當(dāng)生物體發(fā)育到一定階段或受到環(huán)境脅迫時(shí)才啟動(dòng)[4-5]。脂氧合酶的誘導(dǎo)表達(dá)作用已經(jīng)在植物受到機(jī)械損傷、昆蟲取食和病原菌侵染中得到證明[6-10]。楊毛臀螢葉甲取食能誘導(dǎo)榿木葉片中酚類物質(zhì)的含量增加，使得在防御反應(yīng)中起作用的多酚氧化酶、脂氧合酶和過氧化物酶的活性增加，蛋白酶抑制劑也增多[11-13]。大豆通過LOX途徑對(duì)昆蟲的取食作出反應(yīng)，大豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）取食大豆植物后會(huì)誘導(dǎo)脂氧合酶活性增加、蛋白酶抑制劑增多，同時(shí)，茉莉酸會(huì)激活編碼蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)錄[14]。

昆蟲取食還能誘導(dǎo)植物間的通信作用，即昆蟲取食不僅能誘導(dǎo)植物本身產(chǎn)生防御反應(yīng)，還能誘導(dǎo)鄰近健康植株產(chǎn)生防御反應(yīng)[15-16]。植物間是通過空氣進(jìn)行交流的，暴露于二斑葉螨取食誘導(dǎo)利馬豆釋放的揮發(fā)物中的健康利馬豆和黃瓜對(duì)捕食性螨的吸引力都增強(qiáng)[17-19]。Karban等通過田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，受傷艾草灌叢附近的煙草多酚氧化酶活性升高，受蝗蟲、煙草天蛾取食程度的影響較小[20]。

棉花、玉米是重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物，研究它們之間的通信作用可為棉花、玉米的間作套種提供依據(jù)。本研究分析受到機(jī)械損傷和棉蚜取食棉花誘導(dǎo)棉花及其鄰近健康玉米，以及受到機(jī)械損傷和玉米螟取食玉米誘導(dǎo)玉米及其鄰近棉花的脂氧合酶活性，以期明確昆蟲取食和機(jī)械損傷誘導(dǎo)棉花和玉米間通信作用的機(jī)制，有利于找到害蟲綜合防治的新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉花品種為中棉35，將種子催芽后種于沙土（已滅菌）中，等到子葉完全展開后，將幼苗移栽到盛有營(yíng)養(yǎng)液[21]的塑料杯（容量為250 mL）中，在溫室中培養(yǎng)1～2周后供試。玉米品種是農(nóng)大108，將玉米種子浸泡12 h后種于營(yíng)養(yǎng)土中2周，再用于試驗(yàn)。

1.2 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx為棉蚜，為室內(nèi)飼養(yǎng)的品系，飼養(yǎng)在日光溫室內(nèi)（溫度為25～35 ℃，相對(duì)濕度為60%～80%，自然光周期）;玉米螟卵購自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，室內(nèi)飼養(yǎng)至3齡。飼養(yǎng)溫度為 25～28 ℃，相對(duì)濕度為60%～80%，光—暗周期為 16 h—8 h。

1.3 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)參照呂敏等的處理方法[15]進(jìn)行處理。

1.4 酯氧合酶活性的測(cè)定方法

將棉花、玉米幼苗剪去根部后洗凈，在液氮中研磨，加入0.1 g/g聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）和 3 mL/g 濃度為0.1 mol/L、pH值為7.0、含Triton 0.1%的磷酸緩沖液（棉苗）或0.1 mol/L pH值為6.5的磷酸緩沖液（玉米），離心（4 ℃、12 000 g）20 min，上清液用于酶活性的測(cè)定。棉苗、玉米的 3 mL 反應(yīng)體系為2.875 mL反應(yīng)緩沖液、25 μL底物、100 μL酶液。棉苗的反應(yīng)緩沖液為pH值為3.5的甘氨酸-鹽酸緩沖液。

測(cè)定中用到的緩沖液：pH值為3.0～3.5的甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH值為4.0～5.5的檸檬酸緩沖液，pH值為6.0～7.5的磷酸緩沖液，pH值為 8.0～9.0的硼酸緩沖液。底物的配制和活性測(cè)定參考Axelord等的方法[22]。

1.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參照Braford的考馬斯亮蘭G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[23]，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行作圖分析，并用SPSS軟件進(jìn)行處理間的差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂氧合酶的最適pH值

棉花脂氧合酶的最適pH值為3.5，本試驗(yàn)測(cè)定了pH值為3.5～9.0的玉米脂氧合酶活性的變化。如圖1所示，玉米脂氧合酶的活性在pH值為6.5時(shí)最高。

2.2 機(jī)械損傷和棉蚜取食誘導(dǎo)棉花及鄰近玉米脂氧合酶活性的變化

從表1、表2可以看出，機(jī)械損傷和棉蚜取食誘導(dǎo)棉花及其相應(yīng)誘導(dǎo)揮發(fā)物接收玉米的脂氧合酶的活性與對(duì)照相比均有所增加。在處理后24、48、72 h，機(jī)械損傷誘導(dǎo)棉花脂氧合酶的活性分別為對(duì)照的1.12、1.42、1.23倍，棉蚜取食誘導(dǎo)棉花脂氧合酶的活性分別是對(duì)照的1.26、1.36、1.29倍，在處理后48 h達(dá)到最大值，為94.10 nmol/（mg·min）。在處理后24 h，機(jī)械損傷、棉蚜取食誘導(dǎo)揮發(fā)物接收玉米的脂氧合酶活性分別是對(duì)照的1.44、1.51倍，在處理后48 h，酶活性達(dá)到最大值，分別為281.41、105.39 nmol/（mg·min），分別是對(duì)照的4.14、2.07倍，隨后在處理后72 h下降，但是處理72 h后的LOX活性仍然與對(duì)照間差異顯著（P<0.05），分別是對(duì)照的2.53、1.71倍。

2.3 機(jī)械損傷和玉米螟取食誘導(dǎo)玉米鄰近棉苗脂氧合酶活性的變化

從表3、表4可以看出，玉米螟取食和機(jī)械損傷誘導(dǎo)玉米及其相應(yīng)誘導(dǎo)揮發(fā)物接收棉苗的脂氧合酶的活性與對(duì)照相比均有所增加。機(jī)械損傷誘導(dǎo)玉米的脂氧合酶活性隨時(shí)間增加，到48 h達(dá)到最大值，隨后下降，而玉米螟取食誘導(dǎo)玉米脂氧合酶的活性最大值在72 h，為對(duì)照組的2.64倍。在24、48、72 h，機(jī)械損傷誘導(dǎo)揮發(fā)物接收棉花的脂氧合酶活性分別是對(duì)照組的1.10、1.18、1.21倍;玉米螟取食誘導(dǎo)揮發(fā)物接收棉苗脂氧合酶的活性分別為對(duì)照組的1.45、1.54、1.33倍。

3 討論與結(jié)論

脂氧合酶是脂氧合酶途徑中的關(guān)鍵酶。脂氧合酶途徑可以生成一系列綠葉揮發(fā)性化合物，受傷植物釋放的綠葉揮發(fā)物可直接殺傷植食性昆蟲[24-25]。此外，脂氧合酶途徑還參與信號(hào)分子的合成，如合成產(chǎn)物茉莉酸，在植物防御反應(yīng)信號(hào)交流中發(fā)揮了重要的作用。昆蟲取食和機(jī)械損傷能誘導(dǎo)植物脂氧合酶活性增加。豆青葉甲和三刺苜蓿角蟬取食誘導(dǎo)了番茄、大豆和棉花的脂氧合酶活性增加[26]。Qin等研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械損傷和棉蚜取食能誘導(dǎo)棉苗體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶和脂氧合酶活性升高[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，棉花被棉蚜取食或受到機(jī)械傷害后，自身的脂氧合酶活性增加，這與秦秋菊的研究結(jié)果[28]一致，說明脂氧合酶途徑參與了由機(jī)械損傷和昆蟲取食誘導(dǎo)的棉花防御反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果還表明，機(jī)械損傷和玉米螟取食誘導(dǎo)玉米的脂氧合酶的活性顯著增加（P<0.05）。玉米螟取食誘導(dǎo)玉米的脂氧合酶的活性比機(jī)械損傷誘導(dǎo)的高，這是由于昆蟲取食和機(jī)械損傷對(duì)植物的誘導(dǎo)作用不同。因?yàn)樵S多昆蟲取食后還能在傷口部位引入特異性激發(fā)子，如甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）口腔分泌物中的脂肪酸-氨基酸軛合物（FACs）[29]。另外，機(jī)械損傷與昆蟲取食損傷的不同還表現(xiàn)在時(shí)間上，玉米螟取食誘導(dǎo)玉米脂氧合酶的活性在72 h達(dá)到最大值，而機(jī)械損傷誘導(dǎo)玉米脂氧合酶的活性在48 h達(dá)到最大值。

越來越多的研究證明了植物間通信的存在。包括同種植物間的通信[17-18，27，30]，異種植物間的通信作用也被很多試驗(yàn)證明[19-20]。秦秋菊等研究發(fā)現(xiàn)，棉蚜取食和機(jī)械損傷還能引起鄰近的健康棉花脂氧合酶活性增加[28]。Lv等的研究結(jié)果證明了昆蟲取食和機(jī)械損傷能誘導(dǎo)棉花和玉米間通信作用的存在，且苯丙氨酸解氨酶在其中起作用[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，暴露于棉蚜取食和機(jī)械損傷的揮發(fā)物中健康玉米的脂氧合酶活性增加。另外，暴露于玉米螟取食和機(jī)械損傷揮發(fā)物中的棉苗的脂氧合酶活性也增加，表明脂氧合酶在昆蟲取食和機(jī)械損傷誘導(dǎo)的棉花和玉米間通信作用中起作用。

暴露于植物衍生的揮發(fā)性化合物能激發(fā)鄰近植物的防御反應(yīng)[28，32-36]，昆蟲取食誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物揮發(fā)性化合物通過表皮吸收或激活生理反應(yīng)影響鄰近植物[37]。昆蟲取食誘導(dǎo)的植物揮發(fā)性化合物因不同的取食方式有不同的途徑。蒺藜苜蓿被毛蟲和螨取食會(huì)產(chǎn)生不同種不同量的揮發(fā)性化合物，茉莉酸、水楊酸都有積累，但是這種積累因口器不同而不同。螨類取食誘導(dǎo)的水楊酸積累量高于毛蟲取食誘導(dǎo)的，同時(shí)這2種昆蟲取食的茉莉酸積累的時(shí)間不同[38]。Turlings等對(duì)比分析了甜菜夜蛾取食后釋放的揮發(fā)性化合物并與健康植株釋放的揮發(fā)性化合物發(fā)現(xiàn)，在玉米被害后0～1 h內(nèi)，二者沒有區(qū)別，都是綠葉揮發(fā)物，5～6 h后，與對(duì)照的健康葉片相比，被害植株釋放大量萜烯等（herbivore-induced plant volatiles，簡(jiǎn)稱HIVs）[39]，這更加證明不同昆蟲取食誘導(dǎo)植物釋放的揮發(fā)性化合物量和時(shí)間上不同。本試驗(yàn)得出，玉米螟取食誘導(dǎo)揮發(fā)物接收棉花以及棉蚜取食誘導(dǎo)揮發(fā)物接收玉米的LOX的活性都在48 h達(dá)到最大。這可能與揮發(fā)物釋放的時(shí)效性有關(guān)，須要進(jìn)一步分析棉蚜取食誘導(dǎo)棉花及玉米螟取食誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的成分及其釋放時(shí)效。

參考文獻(xiàn)：

[1]Karban R，Baldwin I T. Induced response to herbivory[M]. Chicago：Chicago University Press，1997.

[2]張慶花，陳迎迎，張海龍，等. 1-戊烯-3-酮在植物防御反應(yīng)中的作用[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2019，55 （3）：225-231.

[3]吳桂玲，馮定坤. 植物脂氧合酶的研究進(jìn)展[J]. 廣州化工，2019，47（17）：37-39.

[4]Gardner W H. Biological roles and biochemistry of the lipoxygenase pathway[J]. HortScience，1995，30 （2）：197-205.

[5]李翠霞，李志忠，張 繼. 外源誘導(dǎo)物對(duì)百里香植株再生過程中脂氧合酶活性的影響[J]. 草業(yè)科學(xué)，2012，29（9）：1390-1395.

[6]Saravitz D M，Siedow J N. The differential expression of wound-inducible lipoxygenase genes in soybean leaves[J]. Plant Physiology，1996，110（1）：287-299.

[7]Wang C，Zien C A，Afitlhile M，et al. Involvement of phospholipase D inwound-induced accumulation of jasmonic acid in Arabidopsis[J]. The Plant Cell，2000，12（11）：2237-2246.

[8]Vieira A A，Oliveira M G A，José I C，et al. Biochemical evaluation of lipoxygenase pathway of soybean plant submitted to wounding[J]. Brazilian Journal of Plant Physiology，2001，13（1）：5-12.

[9]da Silva Fortunato F，de Almeida Oliveira M G，Brumano M H N，et al. Lipoxygenase-induced defense of soybean varieties to the attack of the velvetbean caterpillar （Anticarsia gemmatalis Hübner）[J]. Journal of Pest Science，2007，80：241-247.

[10]Melan M A，Dong X，Endara M E，et al. An Arabidopsis thaliana lipoxygenase gene can be induced by pathogens，abscisic acid，and methyl jasmonate[J]. Plant Physiology，1993，101（2）：441-450.

[11]Pea-Cortes H，Sanchez-Serrano J，Rocha-Sosa M，et al. Systemic induction of proteinase-inhibitor-II gene expression in potato plants by wounding[J]. Planta，1988，174（1）：84-89.

[12]Farmer E E，Ryan C A. Octadecanoid precursors of jasmonic acid activate the synthesis of wound-inducible proteinase inhibitors[J]. Plant Cell，1992，4（2）：129-134.

[13]Koiwa H，Bressan R A，Hasegawa P M. Regulation of protease inhibitors and plant defense[J]. Trends in Plant Science，1997，2（10）：379-384.

[14]Fortunato F S，Oliveira M G A，Brumano M H N，et al. Effect of the Anticarsia gemmatalis injury on the lipoxygenases activity from soybean leaves[J]. Bioscience Journal，2004，20（2）：37-46.

[15]呂 敏，孫婳婳，高希武. 昆蟲取食誘導(dǎo)棉花和玉米多酚氧化酶和過氧化物酶的活性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（6）：211-216.

[16]Rhoades D F. Responses of alder and willow to attack by tent caterpillars and webworms：evidence for pheromonal sensitivity of willows[M]//Hedin P A. Plant resistance to insects. Washington DC：American Chemical Society，1983：55-68.

[17]Bruin J，Dicke M，Sabelis M W. Plants are better protected against spider-mites after exposure to volatiles from infested conspecifics[J]. Experientia，1992，48：525-529.

[18]Dicke M. Evolution of induced indirect defence of plants[M]//Tollrian R，Harvell C D. The ecology and evolution of inducible defenses. Princeton，New Jersey，USA：Princeton University Press，1990：62-88.

[19]Oudejans A M C，Bruin J. Dose spider-mite damage induce information transfer between plants of different species ？[J]. Med Fac Landbouww Univ Gent，1995，59：733-739.

[20]Karban R，Baldwin I T，Baxter K J，et al. Communication between plants：induced resistance in wild tobacco plants following clipping of neighboring sagebrush[J]. Oecologia，2000，25：66-71.

[21]Liang R X，Li C J.Diferences in cluster-root formation and carboxylate exudation in Lupinusa albus L. and different nutrient deficiencies[J]. Plant Soil，2003，248：221-227.

[22]Axelrod B，Cheesbrough T M，Laakso S. Lipoxygenase from soybeans[J]. Methods in Enzymology，1981，71：441-451.

[23]Bradford M M A. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，25（1）：248-256.

[24]Farmer E E. Surface-to-air signal[J]. Nature，2001，411（6839）：854-856.

[25]Turlings T C J，Benrey B. Effects of plant metabolites on the behavior and development of parasitic wasps[J]. Ecoscience，1998，5：321-333.

[26]Felton G W，Summers C B，Mueller A J. Oxidative response in soybean foliage to herbivory by bean leaf beetle and three cornered alfalfa hopper[J]. Journal of Chemical Ecology，1994，20：639-650.

[27]Qin Q J，Shi X Y，Liang P，et al. Induction of phenylalanine ammonia-lyase and lipoxygenase by artificial damage and aphid infestation in cotton seedlings[J]. Progress in Natrual Science，2005，15（5）：419-423.

[28]秦秋菊. 害蟲取食和機(jī)械損傷誘導(dǎo)的棉花防御反應(yīng)[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[29]Turlings T C J，Alborn H T，Loughrin J H，et al. Volicitin，an elicitor of maize volatiles in oral secretion of Spodoptera exigua：isolation and bioactivity[J]. Journal of Chemical Ecology，2000，26：189-202.

[30]Tscharntke T，Thiessen S，Dolch R，et al. Herbivory，induced resistance，and interplant signal transfer in Alnus glutinosa[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2001，29：1025-1047.

[31]Lv M，Kong H L，Liu H A，et al. Induction of phenylalanine ammonia-lyase （PAL） in insect damaged and neighboring undamaged cotton and maize seedlings[J]. International Journal of Pest Management，2017，63（2）：166-171.

[32]Arimura G，Ozawa R，Shimoda T，et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves[J]. Nature，2000，406（6795）：512-515.

[33]Arimura G，Ozawa R，Horiuchi J，et al. Plant-plant interactions mediated by volatiles emitted from plants infested by spider mites[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2001，29（10）：1049-1061.

[34]Arimura G，Tashiro K，Kuhara S，et al. Gene responses in bean leaves induced by herbivory and by herbivore-induced volatiles[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，277（2）：305-310.

[35]Alméras E，Stolz S，Vollenweider S，et al. Reactive electrophile species activate defense gene expression in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2003，34（2）：202-216.

[36]Weber H，Chételat A，Reymond P，et al. Selective and powerful stress gene expression in Arabidopsis in response to malondialdehyde[J]. Plant Journal，2004，37（6）：877-888.

[37]Choh Y，Shimoda T，Ozawa R，et al. Exposure of lima bean leaves to volatiles from herbivore-induced conspecific plants results in emission of carnivore attractants：active or passive process？[J]. Journal of Chemical Ecology，2004，30（7）：1305-1317.

[38]Leitner M，Boland W，Mithofer A. Direct and indirect defences induced by piercing-sucking and chewing herbivores in Medicago truncatula[J]. New Phytologist，2005，167（2）：597-606.

[39]Turlings T C J，Tumlinson J H，Heath R R，et al. Isolation and identification of allelochemicals that attract the larval parasitoid Cotesi marginiventris （Gresson） to the microhabitat of one of its hosts[J]. Journal of Chemical Ecology，1991，17（11）：2235-2251.