向日葵全基因組NBS抗病基因密碼子使用偏好性分析

劉洋 路妍 景嵐

摘要：為分析了解向日葵（Helianthus annuus L.）核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding site，簡(jiǎn)稱NBS）型抗病基因編碼時(shí)各密碼子的使用情況，以向日葵全基因組NBS型抗病基因的255條基因序列為來(lái)源，利用CodonW軟件對(duì)每個(gè)基因序列進(jìn)行密碼子統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，向日葵NBS型抗病基因使用A/T（U）結(jié)尾的密碼子占比大于G/C結(jié)尾的密碼子，且有效密碼子數(shù)（effective number of codon，簡(jiǎn)稱ENC）平均值為51.40，整體偏好性較弱，但第3位堿基偏好使用以A/T（U）結(jié)尾的密碼子。從同義密碼子相對(duì)使用頻率（relative synonymous codonw usage，簡(jiǎn)稱RSCU）分析得到第3位為A、T結(jié)尾的密碼子占密碼子總數(shù)（RSCU>1）的比例最高。ENC-GC3s分布圖表明，堿基突變是影響密碼子偏好性的關(guān)鍵因素。同時(shí)相關(guān)性分析結(jié)果還表明，ENC與A3s、T3s呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，多種不同分析都印證了向日葵NBS型抗病基因序列偏好于以A/T（U）結(jié)尾的密碼子。分析向日葵NBS型抗病基因密碼子偏好性，通過(guò)優(yōu)化密碼子來(lái)提高NBS抗病基因在向日葵中的表達(dá)，可為向日葵分子改造和抗病育種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：向日葵;NBS抗病基因;密碼子偏好性;密碼子相關(guān)參數(shù);相關(guān)性分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S565.501;Q943.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）10-0043-05

向日葵（Helianthus annuus L.）別稱太陽(yáng)花、朝陽(yáng)花屬菊科（Asteraceae）向日葵屬（Helainthus L.），是世界各地均有栽培的重要的油料作物。原產(chǎn)地位于南美洲，起初用于觀賞。現(xiàn)我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江等北方地區(qū)均有栽培。據(jù)張一賓等在2015年的統(tǒng)計(jì)，全球向日葵種植面積約為2 540萬(wàn)hm2，同比上年增長(zhǎng)1.0%[1]。向日葵生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中受到許多病原物侵染是向日葵產(chǎn)量下降的主要原因，而培育和科學(xué)利用抗病品種是控制植物病害最經(jīng)濟(jì)有效的方式?？共∑贩N防御抵抗力強(qiáng)，能大大減少田間防治的成本，還能減少因使用農(nóng)藥造成的環(huán)境污染。

當(dāng)植物受到病原菌刺激后會(huì)發(fā)出一系列的信號(hào)，并分泌抗病基因編碼的抗病蛋白（R蛋白），通過(guò)識(shí)別病原菌分泌出的效應(yīng)因子（Avr）后，再將信號(hào)進(jìn)行傳導(dǎo)繼而引發(fā)一系列防御反應(yīng)，最終就可以迅速地抑制病原菌對(duì)植物的侵染[2]。核苷酸結(jié)合位點(diǎn)作為R基因所編碼的蛋白中高度保守的區(qū)域之一，在抗病過(guò)程中起重要作用[3]。核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding site，簡(jiǎn)稱NBS）型蛋白有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[4]，分別是磷酸結(jié)合環(huán)（P-loop，別稱Kinase-1a）、激酶2a（Kinase-2a）、激酶3a（Kinase-3a），它們一起構(gòu)成了抗病蛋白的（ATP/GTP）水解和抗病信號(hào)的傳遞[5]。除了這3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域外，NBS還含有其他幾個(gè)保守區(qū)域，像GLPL和MHD等[6]。有研究表明，植物NBS型抗病基因是植物抗病基因中最大的一類(lèi)，在植物自然免疫中起著重要的作用。

密碼子（codon）指mRNA或DNA中每相鄰的3個(gè)核苷酸編為一組序列，編碼某一種特定氨基酸，是生物體內(nèi)信息傳遞的基本環(huán)節(jié)。密碼子偏性是生物體中編碼同一種氨基酸的同義密碼子的非均衡使用現(xiàn)象，由于這一現(xiàn)象與DNA和蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)，所以具有重要的生物學(xué)意義。在生物體的遺傳密碼中，除了僅含有1個(gè)密碼子的色氨酸和甲硫氨酸以外，所有其他氨基酸都具有1個(gè)以上的簡(jiǎn)并密碼子。編碼相同氨基酸的密碼子是同義密碼子（synonymous codon），在不同物種或基因中具有選擇上的偏好，即為密碼子選擇偏好性（codon usage bias，簡(jiǎn)稱CUB）。對(duì)于相同的物種，不同的蛋白編碼密碼子在基因中以不同的頻率出現(xiàn)。對(duì)于相同氨基酸，編碼氨基酸的不同密碼子的概率在不同的蛋白之間也會(huì)有所不同。因此，生物體基因會(huì)對(duì)其他氨基酸上的簡(jiǎn)并密碼子的選擇具有一定的偏好性，結(jié)合密碼子偏好性改造相關(guān)基因的密碼子從而選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，從而提高抗病基因在向日葵體內(nèi)的表達(dá)，對(duì)于優(yōu)化改進(jìn)向日葵抗病體系具有重要意義。

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多物種的全基因組序列已經(jīng)公布出來(lái)。對(duì)基因片段或全基因組序列密碼子偏好性方面的研究也成為重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象，像蘭科植物（Orchidaceae Juss.）[7]、擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.][8]、水稻[9]、柑橘（Citrus reticulata Blanco）[10]、葡萄（Vitis vinifera L.）[11]、香蕉（Musa nana Lour.）[12]、菠蘿[Ananas comosus （Linn.） Merr.][13]的密碼子偏好性均有報(bào)道。

2017年英國(guó)《Nature》雜志報(bào)道了法國(guó)科研人員通過(guò)測(cè)序獲得了高質(zhì)量的向日葵參考基因組，加速了向日葵育種計(jì)劃[14]。隨著向日葵全基因組序列測(cè)序的完成，筆者分析向日葵NBS型抗病基因編碼時(shí)各密碼子的使用情況，今后可以通過(guò)優(yōu)化密碼子來(lái)提高NBS抗病基因在向日葵中的表達(dá)，為向日葵抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

在https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=txid4232[orgn]上下載向日葵全基因組蛋白質(zhì)序列，根據(jù)生物信息學(xué)分析P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a、GLPL等4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域在基因中的峰度值，以NBS的保守結(jié)構(gòu)域（P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a、GLPL）為關(guān)鍵信息在Excel中進(jìn)行檢索及篩選，共得到255個(gè)符合條件的基因序列。再通過(guò)NCBI下載相應(yīng)NBS FASTA格式的堿基序列。利用CodonW軟件計(jì)算并統(tǒng)計(jì)分析向日葵NBS抗病基因組密碼子使用情況。CodonW軟件分析的數(shù)據(jù)主要包括同義密碼子第3位上4種堿基的出現(xiàn)頻率（A3s、G3s、C3s、T3s）、全基因組的GC含量、最優(yōu)密碼子使用頻率（frequency of optimal codons，簡(jiǎn)稱FOP）、密碼子偏愛(ài)指數(shù)（codon bias index，簡(jiǎn)稱CBI）等;采用同義密碼子的相對(duì)使用度、密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaption index，簡(jiǎn)稱CAI）和有效密碼子數(shù)（effective number of codon，簡(jiǎn)稱ENC）3個(gè)指標(biāo)對(duì)密碼子偏好性進(jìn)行評(píng)價(jià)。RSCU表示編碼氨基酸同義密碼子間的相對(duì)概率[15];RSCU的計(jì)算為某一密碼子使用的頻率和使用時(shí)預(yù)期頻率的比值。若某一密碼子的RSCU>1，則表示該密碼子是相對(duì)使用頻率較高的密碼子，反之亦然;RSCU=1則代表該密碼子無(wú)明顯偏好性[7]，其計(jì)算公式如下：

RSCUij=Xij1ni∑nij=1Xij。

式中：RSCUij表示編碼第i個(gè)氨基酸第j個(gè)同義密碼子間的相對(duì)概率;Xij是編碼第i個(gè)氨基酸的第j個(gè)密碼子的出現(xiàn)次數(shù);ni是編碼第i個(gè)氨基酸的同義密碼子的數(shù)量（值為1～6）。

CAI的范圍為0～1，越靠近1即表示這個(gè)基因的表達(dá)水平越高。ENC的范圍為20～61，ENC越小，相應(yīng)的內(nèi)源基因的表達(dá)量就越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組NBS抗病基因序列的密碼子組成分析

分析結(jié)果（表1）表明，全基因組GC含量為36.50%～44.90%，平均GC含量為40.16%。對(duì)密碼子第3個(gè)位置上的堿基類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，C、G的出現(xiàn)頻率平均值分別是22.05%、25.64%，而A和T（U）的出現(xiàn)頻率分別為39.03%、40.90%。這些結(jié)果表明，向日葵NBS型基因使用A/T（U）結(jié)尾的密碼子占比為79.93%，比G/C結(jié)尾的密碼子占比高，向日葵基因組ENC平均值為51.40，說(shuō)明向日葵密碼子整體偏好性較弱。

2.2 同義密碼子使用偏好分析

用CodonW軟件計(jì)算并統(tǒng)計(jì)分析向日葵全基因組NBS抗病基因中所有氨基酸對(duì)同義密碼子的偏好性、使用頻率等數(shù)據(jù)。由表2可知，RSCU>1的密碼子共29個(gè)，為高頻密碼子，且第3位為A、T（U）、C和G的密碼子數(shù)量分別占RSCU>1密碼子總數(shù)的41.38%、51.72%、0、6.90%。其中第3位為T(mén)（U）的密碼子數(shù)量最多，第3位為C的密碼子數(shù)量最少，表明向日葵NBS抗病基因編碼時(shí)偏好使用以A/T（U）結(jié)尾的密碼子，較少使用以C結(jié)尾的密碼子。密碼子AGA的RSCU最大，為2.75，該密碼子的偏好性最強(qiáng);編碼氨基酸Trp、Met中的UGG、AUG的RSCU均等于1，表示向日葵NBS型基因中密碼子UGG、AUG使用沒(méi)有偏好性;氨基酸Arg中的密碼子CGC的RSCU最小，為0.25，密碼子偏好性最弱。

2.3 最優(yōu)密碼子的鑒定

將向日葵全基因組NBS基因序列按照ENC的大小進(jìn)行排序，選取上下限區(qū)域各5%的序列數(shù)據(jù)形成高表達(dá)庫(kù)和低表達(dá)庫(kù)，再計(jì)算2個(gè)表達(dá)庫(kù)中各個(gè)密碼子的ΔRSCU，選取高表達(dá)庫(kù)中RSCU大于1而在低表達(dá)庫(kù)中小于1，共鑒定出 5個(gè)最優(yōu)密碼子（表3），即AUA、GUG、ACC、UAA、GGG。其中UAA密碼子的ΔRSCU 為1.15，其偏好性最強(qiáng)。

2.4 ENC繪圖分析

通過(guò)繪制ENC與GC3s 的相關(guān)性散點(diǎn)圖，直觀地解釋密碼子使用偏好性，可以反映無(wú)選擇壓力條件下二者之間的關(guān)系。通過(guò)對(duì)向日葵全基因組NBS型抗病基因GC3s與ENC的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析（圖1）可知，大部分基因點(diǎn)都落在期望曲線附近，ENC與GC3s 呈極顯著相關(guān)關(guān)系（P<0.001，r2=0.465 8），這說(shuō)明堿基突變對(duì)密碼子偏好性的影響較強(qiáng)[16]。與期望曲線相距較遠(yuǎn)的受自然選擇壓力較大。處于曲線以下的基因點(diǎn)，其ENC相對(duì)較低，對(duì)應(yīng)的內(nèi)源基因表達(dá)量也相對(duì)越高，對(duì)密碼子的使用具有更顯著的偏好性;反之，處于曲線以上的基因點(diǎn)對(duì)密碼子使用的選擇性較低。

2.5 密碼子評(píng)價(jià)參數(shù)的相關(guān)性分析

密碼子各參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果（表4）表明，T3s與A3s、CAI呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.01，下同），而與C3s、G3s、CBI、ENC、GC3s和GC呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;C3s與G3s、CBI、FOP、ENC、GC3s和GC呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，而與A3s、CAI呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;A3s與G3s、CBI、FOP、ENC、GC3s和GC呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與CAI呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05）;G3s與CAI、FOP呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與ENC、GC3s呈極顯著正相關(guān)關(guān)系;CAI與CBI、FOP呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與GC3s呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;CBI與FOP、ENC、GC3s和GC呈極顯著正相關(guān)關(guān)系;FOP與GC呈極顯著正相關(guān)關(guān)系;ENC與GC3s和GC呈極顯著正相關(guān)關(guān)系;GC3s和GC呈極顯著正相關(guān)關(guān)系;上述相關(guān)性分析結(jié)果表明，密碼子上第3個(gè)堿基的不同類(lèi)型會(huì)顯著影響基因的表達(dá)水平?？傊?，基因在表達(dá)時(shí)對(duì)密碼子第3位上的堿基類(lèi)型具有不同選擇性，且偏好選用GC含量較大且A/T為第3位結(jié)尾的同義密碼子，從而影響基因表達(dá)水平。

3 討論與結(jié)論

密碼子偏好性是是翻譯過(guò)程中的重要調(diào)控參數(shù)，不同生物的密碼子使用偏性的差異非常不同。其中高表達(dá)密碼子使用偏性較大，所對(duì)應(yīng)的生物體中有非常豐富的tRNA;密碼子偏好性還與mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素相互影響[17-18]。另外，大多數(shù)密碼子的3個(gè)堿基在進(jìn)化過(guò)程中都會(huì)發(fā)生突變，不同堿基的突變所表現(xiàn)的意義也不同。前2個(gè)位置堿基的突變一般為非同義突變會(huì)改變基因的功能，第3個(gè)堿基的突變多為同義突變對(duì)基因功能無(wú)影響。因此，分析第3位堿基的影響因素可能會(huì)揭示出密碼子偏好性的原因所在。本研究做了多種不同的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均表明向日葵NBS型抗病基因序列偏好于以A/T（U）結(jié)尾的密碼子。向日葵全基因組平均GC含量為40.16%，大量研究表明雙子葉植物的GC含量通常小于50%，而單子葉植物往往具有較高的GC含量，二者的密碼子偏好性具明顯差異[19]。不同植物的ENC均有所差異，蘿卜ICE1基因密碼子的ENC為51.35[20]，菠蘿基因組密碼子的ENC為58.41[13]，蓼科大黃屬植物CHS基因密碼子的ENC為34.35[21]，紅藻rbcL基因密碼子的ENC為41.89[22]。分析所得，向日葵NBS型抗病基因密碼子的ENC為51.40，香蕉NBS型抗病基因的ENC為56.40[23]，水稻NBS-LRR基因ENC變化范圍為31.22～59.47，相較于擬南芥（45.41～59.1）更大[24]，更加表明不同物種不同基因所對(duì)應(yīng)的密碼子偏好性均有所差異（表5）。

同時(shí)相關(guān)性分析結(jié)果還表明，ENC與A3s和T3s大小呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，再次證明向日葵NBS型抗病基因序列偏好于以A/T（U）結(jié)尾的密碼子。這也與水稻[24]、甘薯與三淺裂野牽牛[25]的NBS抗病基因偏好于以A/T（U）結(jié)尾相一致。從ENC-GC3s分布圖中可以直觀看出密碼子的偏好性主要來(lái)自于堿基的突變，部分來(lái)自于自然選擇壓力。向日葵NBS型抗病基因使用A/T（U）結(jié)尾的密碼子占比為79.93%，比G/C結(jié)尾的密碼子高，且ENC平均值為51.40，說(shuō)明向日葵NBS型抗病基因密碼子整體偏好性較弱，但第3位堿基偏好使用以A/T（U）結(jié)尾的密碼子。 從同義密碼子相對(duì)使用頻率分析得到，第3位為A、T結(jié)尾的密碼子占密碼子總數(shù)（RSCU>1）的比例最高，密碼子AGA的RSCU最大，為2.75，該密碼子的偏好性最強(qiáng);通過(guò)計(jì)算RSCU高低表達(dá)庫(kù)的平均值，鑒定出AUA、GUG、ACC、UAA、GGG等5個(gè)最優(yōu)密碼子。多種不同分析都印證了向日葵NBS型抗病基因序列偏好于以A/T（U）結(jié)尾的密碼子。研究分析密碼子偏好規(guī)律并優(yōu)化密碼子來(lái)提高NBS抗病基因在向日葵中的表達(dá)，未來(lái)可以對(duì)向日葵進(jìn)行分子改造和抗病育種提供理論依據(jù)和指導(dǎo)作用。

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