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    超富硒植物壺瓶碎米薺ITS序列克隆與分析

    2021-07-01 09:12:23蔡升楊平續(xù)晨蔡小寧
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:進(jìn)化遺傳

    蔡升 楊平 續(xù)晨 蔡小寧

    摘要:用1對(duì)通用引物對(duì)采集自湖北省恩施市魚(yú)塘壩獨(dú)特富硒礦床土壤上的壺瓶碎米薺葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,獲得了長(zhǎng)度為852 bp的包含核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA序列。將獲得的多條碎米薺屬不同物種的核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA序列進(jìn)行比對(duì),拼接出“基準(zhǔn)”序列,然后再比較不同物種核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的序列與“基準(zhǔn)”序列的堿基差異。結(jié)果表明,壺瓶碎米薺與“基準(zhǔn)”序列相比,堿基差異最多,達(dá)到17處,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)同屬其他物種與“基準(zhǔn)”序列的堿基差異,是平均數(shù)的3.3倍。據(jù)此推測(cè),某種碎米薺長(zhǎng)期生長(zhǎng)于恩施市富硒地區(qū),產(chǎn)生了能夠適應(yīng)高含量硒土壤逆境的遺傳變異,形成了超強(qiáng)富硒的能力,進(jìn)化出了壺瓶碎米薺這一新物種,從而提出了壺瓶碎米薺在高含量硒土壤逆境中加速進(jìn)化假說(shuō)。

    關(guān)鍵詞:壺瓶碎米薺;硒;核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū);遺傳;進(jìn)化;假說(shuō)

    中圖分類(lèi)號(hào): Q755;S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號(hào):1002-1302(2021)10-0048-04

    壺瓶碎米薺(Cardamine hupingshanensis)是一種超富硒植物,能夠忍耐土壤中高含量的硒,并能在體內(nèi)大量積累。Yuan等測(cè)得壺瓶碎米薺葉片中硒含量可達(dá)1 965 mg/kg(干質(zhì)量)[1];Shao等測(cè)得壺瓶碎米薺葉片中硒的含量為1 427 mg/kg(干質(zhì)量)[2]。能夠積累如此高含量的硒,說(shuō)明壺瓶碎米薺具有獨(dú)特的富硒機(jī)制,對(duì)其富硒的生理生化和分子機(jī)制開(kāi)展研究,揭示富硒的科學(xué)原理,將有助于對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中硒含量進(jìn)行調(diào)控,獲得更多有益于健康的農(nóng)產(chǎn)品,以造福于人類(lèi)。

    以往通過(guò)傳統(tǒng)的分類(lèi)學(xué)方法鑒定從野外采集的壺瓶碎米薺種質(zhì)資源,對(duì)鑒定人的專(zhuān)業(yè)要求較高,經(jīng)驗(yàn)不足就可能誤采。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家已經(jīng)研究出條形碼識(shí)別技術(shù),例如通過(guò)測(cè)定植物的核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(internal transcribed spacer,ITS)來(lái)對(duì)物種進(jìn)行鑒定,為廣大科技人員提供了便利[3]。

    本試驗(yàn)中,擬對(duì)采集自湖北省恩施土家族苗族自治州(恩施州)魚(yú)塘壩獨(dú)特富硒礦床土壤中生長(zhǎng)的壺瓶碎米薺提取DNA,用通用引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增其核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列,獲得相應(yīng)的參考序列,為今后準(zhǔn)確鑒定壺瓶碎米薺種質(zhì)資源打下基礎(chǔ),同時(shí)為今后進(jìn)一步研究壺瓶碎米薺超常富硒能力的分子機(jī)制提供線索。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    于2020年8月將從湖北省恩施州新塘鄉(xiāng)雙河社區(qū)魚(yú)塘壩富硒土壤中采集的壺瓶碎米薺植株移栽于南京曉莊學(xué)院實(shí)驗(yàn)室的盆缽中,待其生長(zhǎng)3個(gè)月后,取新鮮嫩葉提取DNA。

    1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

    DNA提取采用北京艾德萊生物科技有限公司生產(chǎn)的DN14試劑盒;PCR擴(kuò)增采用北京艾德萊生物有限公司生產(chǎn)的2×F8 FastLong PCR Master Mix,復(fù)性溫度為56 ℃,72 ℃延伸時(shí)間為10 s。

    1.3 選用的引物序列

    引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,引物代號(hào)、位置和詳細(xì)序列見(jiàn)表1。

    1.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序

    PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定后,交由南京擎科生物科技有限公司測(cè)序,DNA測(cè)序峰圖用Chromas軟件顯示。

    1.4 序列分析

    將測(cè)序獲得的序列去除兩端測(cè)序質(zhì)量較差的部分,然后用Contigexpress 軟件進(jìn)行拼接;登錄NCBI網(wǎng)站獲取所需要的其他碎米薺物種的含ITS的序列;用Lasergene 7.1的子軟件SeqMan 分析各種碎米薺物種ITS序列的變異;用ClustalX 1.83和MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 壺瓶碎米薺ITS序列的獲得

    采用引物ITC-5和引物ITC-3組合(引物序列見(jiàn)表1)對(duì)壺瓶碎米薺核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到了長(zhǎng)度約900 bp的DNA產(chǎn)物,圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳的結(jié)果。

    然后以同樣的引物對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序,獲得了原始的DNA序列(圖2),對(duì)獲得的這些序列去除兩端不可靠序列,用Contigexpress軟件進(jìn)行拼接,獲得了長(zhǎng)度為852 bp的DNA序列,包含部分的18S基因、完全的ITS1(核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1)、完全的 5.8S 基因、完全的ITS2(核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2)、部分的28S基因的DNA序列,已經(jīng)提交GenBank,序列登錄號(hào)(ID)為MW282045。

    2.2 不同物種間ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

    將所獲得的壺瓶碎米薺的ITS序列和其他碎米薺物種的ITS序列用ClustalX 1.83軟件和MEGA 6軟件鄰接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),以擬南芥(Arabidopsis thaliana)的ITS序列(登錄號(hào):AJ232900)為參照,結(jié)果見(jiàn)圖3。

    從圖3可以看出,明顯可以分為3個(gè)聚類(lèi),Cardamine digitata (登錄號(hào):EU819328,下同)、Cardamine purpurea(EU819358)、Cardamine blaisdellii(EU819312)、Cardamine pedata (EU819356)、Cardamine umbellata(EU819379)、Cardamine victoris (EU819382)、Cardamine nuttallii (EU819350)、Cardamine rupicola (EU819368)、大葉碎米薺[Cardamine macrophylla(EU819344)]聚為一

    類(lèi);Cardamine amporitana (AY260598)、大碎米薺[Cardamine amara(KF988052)]、碎米薺[Cardamine hirsuta(MH808258)]、彎曲碎米薺[Cardamine flexuosa(DQ268409)]、圓齒碎米薺[Cardamine scutata(DQ268475)]、Cardamine niigatensis (DQ268493)、Cardamine clematitis(EU819318)聚為一類(lèi);壺瓶碎米薺[Cardamine hupingshanensis(MW282045)]單獨(dú)聚為一類(lèi),與其他碎米薺物種遺傳距離最遠(yuǎn)。

    2.3 不同碎米薺物種ITS序列的比較分析

    為進(jìn)一步分析比較壺瓶碎米薺和其他碎米薺物種進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的變異大小,將這些ITS序列用Lasergene的子軟件SeqMan進(jìn)行拼接,得到一個(gè)“基準(zhǔn)”的包含ITS1序列、5.8S基因序列和ITS2序列的長(zhǎng)度為617 bp的DNA序列(圖4)。然后將各個(gè)碎米薺物種的ITS1序列和ITS2序列與“基準(zhǔn)”序列進(jìn)行比較,考察在對(duì)應(yīng)位置的堿基變異情況。

    由表2可知,與“基準(zhǔn)”序列相比,每條序列的ITS1區(qū)和ITS2區(qū)平均有5.2個(gè)變異,變異最少的物種是Cardamine digitata,只有2處發(fā)生了變異;變異最多的是壺瓶碎米薺(Cardamine hupingshanensis ),有17處發(fā)生了變異,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)平均水平,是平均數(shù)的3.3倍,與變異第2多的Cardamine niigatensis相比,變異數(shù)也達(dá)到了它的2.1倍。

    3 討論與結(jié)論

    壺瓶碎米薺具有驚人的耐硒和聚集硒的能力,即使在全球唯一沉積型的獨(dú)立硒礦床——恩施市漁塘壩硒礦床的土壤中也能生長(zhǎng)良好[4-6],顯然有其獨(dú)特的遺傳特性。從前述的分析可知,壺瓶碎米薺與其同屬的其他物種相比,在核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA序列上的差異很大,表明其進(jìn)化速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)同類(lèi)物種,而其他物種的耐硒聚硒能力遠(yuǎn)低于壺瓶碎米薺。因此推測(cè),最初某種原始的碎米薺生長(zhǎng)于恩施市富硒土壤上,經(jīng)受了長(zhǎng)期的高硒環(huán)境壓力,遺傳基因產(chǎn)生了很多突變,經(jīng)過(guò)若干年的選擇,那些能夠耐受高含量硒土壤逆境的突變個(gè)體及其后代存活了下來(lái)并繁衍至今,從而進(jìn)化成新物種——壺瓶碎米薺[7]。也就是說(shuō),高含量硒土壤環(huán)境加速了壺瓶碎米薺的遺傳進(jìn)化,造成其遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于同屬其他物種的DNA序列的變異。今后進(jìn)一步的研究工作,可以找出耐受和富集硒的相關(guān)基因,研究其功能和作用機(jī)制。還可以對(duì)多種碎米薺物種的基因進(jìn)行橫向比較,研究耐受和富集硒相關(guān)基因的進(jìn)化路徑。

    此外,筆者先建立“基準(zhǔn)”序列,然后再與其比較DNA堿基的變異情況,可以很直觀地觀察到物種的進(jìn)化速度,該方法可應(yīng)用到同類(lèi)研究上。如果能編制出對(duì)應(yīng)的軟件,則可以大大提高效率。

    在本試驗(yàn)中,筆者對(duì)取自恩施市魚(yú)塘壩獨(dú)特富硒礦床土壤上生長(zhǎng)的壺瓶碎米薺DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,得到了壺瓶碎米薺核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列,為其分子鑒定提供了參考序列。本試驗(yàn)所選用的引物擴(kuò)增出來(lái)的條帶特異性好,幾個(gè)獨(dú)立的PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序獲得的序列在去除了兩端的部分序列后,重復(fù)性很好,因此建立了有效的壺瓶碎米薺分子鑒定方法。

    參考文獻(xiàn):

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    [2]Shao S X,Deng G D,Mi X B,et al. Accumulation and speciation of selenium in Cardamine sp. in Yutangba Se Mining Field,Enshi,China[J]. Chinese Journal of Geochemistry,2014,33(4):357-364.

    [3]Chen S L,Yao H,Han J P,et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS One,2010,5(1):e8613.

    [4]王玉兵,陳發(fā)菊,梁宏偉. 湖北省碎米薺屬一新記錄種——壺瓶碎米薺[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49(9):2160-2161.

    [5]戴光忠. 我國(guó)富硒農(nóng)業(yè)地質(zhì)環(huán)境調(diào)查進(jìn)展分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(30):12140-12143.

    [6]羅金玲,楊 珖,陳鴻輝,等. 壺瓶碎米薺對(duì)硒酸鈉脅迫響應(yīng)研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,59 (11):47-50.

    [7]Bai H F,Chen L B,Liu K M,et al. A new species of Cardamine (Brassicaceae) from Hunan,China[J]. Novon,2008,18(2):135-137.

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