玫煙色棒束孢NBL-Z8的培養(yǎng)及對桃蚜的侵染力

齊素敏 陳丹丹 李圓圓 冉新炎 韓廣泉 陶寧 王麗榮

摘要：通過探索玫煙色棒束孢NBL-Z8的最佳培養(yǎng)條件并測定該菌對桃蚜[Myzus persicae （Sulzer）]的侵染力，以期為篩選出對桃蚜具有高毒力的微生物殺蟲劑提供依據(jù)。采用單因素分析法測定菌株的最佳培養(yǎng)條件，并采用噴霧法測定菌株NBL-Z8對桃蚜的致病力。結(jié)果顯示，NBL-Z8菌株的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為蛋白胨，最佳培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、初始pH值7、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量6%;菌株的室內(nèi)致病力測定結(jié)果表明，當孢子濃度為1×108 CFU/mL 時，對桃蚜的致死中時間（LT50）為3.118 d，接菌7 d時致死中濃度（LC50）為1.367×104 CFU/mL。由研究結(jié)果可以看出，玫煙色棒束孢NBL-Z8對桃蚜具有較強的致病力，可作為桃蚜生防制劑開發(fā)中的潛力菌株。

關鍵詞：玫煙色棒束孢;液體培養(yǎng);桃蚜;侵染力測定;生防潛力

中圖分類號： S433.39;S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0082-04

蚜蟲類有13科、500余屬，目前世界上已知種類有4 700余種，而我國已知的蚜蟲種類就有1 000余種[1]。桃蚜（Myzus persicae）是常見的一種蚜蟲，該蟲以成蟲、若蟲群集在寄主葉片、花梗和種莢等部位吸食汁液危害寄主，常導致寄主葉片黃化、蜷縮甚至枯萎，并分泌蜜露誘發(fā)煤煙病，引起寄主植株品質(zhì)和產(chǎn)量下降[2-3]。目前，化學防治仍是控制蚜蟲危害的主要方法，而頻繁地使用高劑量化學殺蟲劑，不僅會導致蚜蟲對多種農(nóng)藥產(chǎn)生不同程度的抗性[4-7]，還會造成蔬菜中的農(nóng)藥殘留超標，給農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)帶來隱患。因此，研究和開發(fā)能夠減少化學殺蟲劑用量甚至替代化學殺蟲劑的安全、高效的生物防治方法成為桃蚜綜合防治的重要途徑。

玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）是一種重要的昆蟲病原真菌，該菌地理分布范圍廣泛，昆蟲寄主多樣，能寄生在同翅目、鱗翅目、雙翅目等8個目40多種昆蟲上[8]。大量研究結(jié)果表明，玫煙色擬青霉對蚜蟲等刺吸式口器害蟲具有很強的致病力。曹娜在大田試驗中采用1.0×107個/mL玫煙色棒束孢孢子懸浮液噴霧防治棉蚜，第10天時的校正防效可達95.9%[9]。朱麗梅等的研究結(jié)果表明，玫煙色棒束孢QH4對桃粉蚜的毒殺效果較好，施藥后120 h的死亡率可達100%[10]。鄧建華等研究發(fā)現(xiàn)，用玫煙色棒束孢孢子懸浮液處理后第10天，煙蚜的感染率為78.5%[11]。孫莉等用108個/mL玫煙色棒束孢孢子懸浮液處理蚜蟲，結(jié)果顯示，試蟲在施藥后第10天的死亡率可達86.52%[12]。邢培翔等用108個/mL玫煙色棒束孢孢子懸浮液處理梨黃粉蚜，7 d后的校正死亡率為97.24%[13]。綜合以上研究結(jié)果可知，玫煙色棒束孢對多種蚜蟲具有良好的防治效果。筆者優(yōu)化了玫煙色棒束孢 NBL-Z8 的液體培養(yǎng)條件并測定該菌對桃蚜成蟲的室內(nèi)毒力，以期篩選出對桃蚜具有高毒力的微生物殺蟲劑，為減少化學藥劑使用量、緩解昆蟲抗藥性、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)害蟲的無公害防治、提高農(nóng)產(chǎn)品的安全性提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 玫煙色棒束孢菌株NBL-Z8從山東省泰安市省莊周邊土壤中分離純化所得，該菌株目前保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCC19603。

1.1.2 供試蟲源 桃蚜采自山東省泰安市泰山區(qū)省莊周邊白菜葉片，在溫度為（25±1） ℃、相對濕度為（80±5）%、光—暗周期為12 h—12 h的條件下，采用無農(nóng)藥及害蟲污染的甘藍飼養(yǎng)，人工飼養(yǎng)多代。取大小一致的健康的無翅成蚜作為試蟲。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基配方：200 g馬鈴薯（去皮），20 g葡萄糖，20 g 瓊脂，1 000 mL蒸餾水;PDB（不加瓊脂的PDA）培養(yǎng)基配方：200 g馬鈴薯（去皮），20 g葡萄糖，1 000 mL蒸餾水。

1.2 最適培養(yǎng)條件篩選的單因素試驗

以A培養(yǎng)基（25.0 g/L葡萄糖，6.0 g/L蛋白胨，2.0 g/L K2HPO4，1.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4）作為對照，采用單因素試驗法分別研究玫煙色棒束孢在以不同碳源（葡萄糖、蔗糖、甘露醇、檸檬酸鈉和糖蜜）、氮源（蛋白胨、硝酸鉀、酵母膏、氯化銨和牛肉浸膏）為主要成分的培養(yǎng)基中及不同發(fā)酵初始pH值（3、5、7、9、11）、發(fā)酵溫度（15、20、25、28、30 ℃）、轉(zhuǎn)速（150、170、180、200、220 r/min）和接種量（3%、4%、5%、6%、7%）條件下的發(fā)酵效果。發(fā)酵條件同原始條件，即初始pH值為7.0，接種量為6%，接種液濃度為108 CFU/mL，培養(yǎng)溫度為25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)48 h后采用血細胞計數(shù)板測定菌株的孢子濃度。

1.3 孢子懸浮液的配制

將保存在4 ℃斜面上的供試菌株活化后，接種到PDA培養(yǎng)基平板上，于25 ℃培養(yǎng)10 d后，用含有0.05%吐溫-80的無菌水沖洗孢子，然后用血球計數(shù)板測定懸浮液中的孢子數(shù)，計算其孢子濃度，再用含有0.05%吐溫-80的無菌水逐步稀釋，獲得濃度為1×104～1×108 CFU/mL的孢子懸浮液。

1.4 室內(nèi)毒力測定

試驗于2020年3月在山東省泰安市植物微生態(tài)制劑重點實驗室進行。配制水瓊脂培養(yǎng)基（1.5 g瓊脂，100 mL蒸餾水），每個培養(yǎng)皿10～15 mL，待冷卻后，剪取大小一致的甘藍葉片（圓形，直徑為 4 cm），將葉背朝上緊貼在培養(yǎng)基表面使其固定，再將無翅成蚜轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中的葉片上，每個培養(yǎng)皿中放20頭。 將上述濃度為1×104～1×108 CFU/mL的孢子懸浮液用噴霧器進行噴霧，每個培養(yǎng)皿定量噴霧1次。用含有0.05%吐溫-80的無菌水作為對照（CK），每次處理用20頭蚜蟲，每個處理重復3次。自然風干后加蓋，在（25±1） ℃、相對濕度為（80±5）%、光—暗周期為12 h—12 h的條件下逐日觀察并記錄病死蟲數(shù)至蚜蟲死亡，及時挑出死亡蟲體并于滅菌培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，3～5 d后鏡檢死蟲，觀察是否產(chǎn)生菌絲或孢子，以確定是否是因為有效感染玫煙色棒束孢菌而導致的死亡。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2010、SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行處理，并用Duncans新復極差法進行顯著性分析和Probit回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素篩選最適培養(yǎng)條件

2.1.1 單因素試驗法篩選最適培養(yǎng)基 基礎培養(yǎng)基選擇A培養(yǎng)基（25.0 g/L葡萄糖，6.0 g/L蛋白胨，2.0 g/L K2HPO4，1.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4），測定不同碳源、氮源對菌株NBL-Z8孢子濃度的影響。由表1可以看出，分別以蔗糖為碳源、蛋白胨為氮源時，菌株NBL-Z8可以獲得最大孢子濃度，分別為4.31×108、3.57×108 CFU/mL，且顯著高于其他處理。因此，確定將蔗糖、蛋白胨為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分。

2.1.2 單因素試驗法篩選最適發(fā)酵條件 如表2所示，當初始pH值為7時，菌株NBL-Z8的孢子濃度顯著高于其他處理，可見過酸或過堿的培養(yǎng)基均會影響菌株的產(chǎn)孢性能。菌株NBL-Z8在溫度為 15～30 ℃范圍內(nèi)的產(chǎn)孢性能良好，溫度過高或過低均不利于該菌產(chǎn)孢，菌株在溫度為25 ℃時的孢子濃度最大。當搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時，孢子濃度最大，但菌株在轉(zhuǎn)速超過200 r/min時，搖瓶中的菌株存在起泡、菌絲結(jié)球的現(xiàn)象，但是考慮到轉(zhuǎn)速為200、180 r/min時，菌株的孢子濃度不存在顯著性差異，因此所以選擇180 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。當菌株 NBL-Z8的接種量在3%～6%之間時，其菌體孢子濃度隨著接種量的增大而增加，當接種量為6%時，孢子濃度最大，為4.31×108 CFU/mL。

2.2 菌株對桃蚜的室內(nèi)毒力

表3中結(jié)果顯示，不同濃度的玫煙色棒束孢NBL-Z8孢子懸浮液對桃蚜的校正死亡率從處理 2 d 后（1 d后的校正死亡率為0%）起開始出現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）。1×104 CFU/mL濃度的孢子懸浮液對桃蚜的致死率較低，處理7 d后，校正死亡率僅為48.44%，致死中時間（LT50）為6.287 d;1×107 CFU/mL濃度的孢子懸浮液對桃蚜的致死率較高，處理7 d后時，校正死亡率可以達到88.33%，LT50為3.302 d;濃度為1×108 CFU/mL的孢子懸浮液處理組的效果最好，處理6 d后時，校正死亡率可達90%以上，LT50為3.118 d。

由表4中的數(shù)據(jù)可以看出，處理2～7 d后，不同處理下該菌對桃蚜的致死中濃度（LC50）分別為1.675×1013、1.038×108、3.653×105、3.584×104、1.660×104、1.367×104 CFU/mL。

上述結(jié)果表明，菌株NBL-Z8對桃蚜的致死率隨著孢子懸浮液濃度的增加而明顯提高，并且隨著處理時間的延長而增大，但是在不同濃度處理下，桃蚜的死亡率基本在4 d后達到1個峰值，隨后致死率的增加趨勢變緩，說明玫煙色棒束孢NBL-Z8菌株可以在較短時間內(nèi)造成桃蚜成蟲死亡。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，孢子濃度是篩選優(yōu)良菌株的重要指標，而菌株培養(yǎng)條件對菌種孢子濃度及毒力均有較大影響[14]。因此探索菌株NBL-Z8的最佳產(chǎn)孢條件，對于利用該菌防治害蟲具有重要意義。張仙紅等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖是玫煙色擬青霉液體培養(yǎng)的最適碳源，蛋白胨是最適氮源[15]。曹娜研究發(fā)現(xiàn)，薩氏液體培養(yǎng)基（SDY培養(yǎng)基）是最佳發(fā)酵培養(yǎng)基[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株NBL-Z8的最佳碳源、氮源分別為蔗糖、蛋白胨，這與田晶的研究結(jié)果[16]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌株的最佳產(chǎn)孢條件為溫度25 ℃、初始pH值7、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量6%、培養(yǎng)時間48 h。在接下來的試驗中，筆者將進一步探究各營養(yǎng)成分對玫煙色棒束孢NBL-Z8生長和生殖的影響。

用微生物或其代謝產(chǎn)物防治農(nóng)業(yè)害蟲具有選擇性強、對農(nóng)作物和自然環(huán)境安全、不傷害天敵、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，已經(jīng)逐漸引起人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌、綠僵菌[17-19]、蠟蚧輪枝菌[20-21]、達旦提狄克氏菌[22-23]等生防菌株對蚜蟲均具有良好的防治效果。據(jù)報道，玫煙色棒束孢對桃蚜具有較高的致病力[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株NBL-Z8在孢子濃度為1×107、1×108 CFU/mL時對桃蚜的致死率較高，處理7 d后，試蟲的校正死亡率分別為88.33%、96.89%，LT50分別為3.302、3.118 d，LC50為1.367×104 CFU/mL，該致死中濃度低于陳巍巍等測得的8.51×105 CFU/mL[24]、張仙紅等測得的8.71×106 CFU/mL[25]及孟豪等研究得出的1.20×105 CFU/mL[26]。以上結(jié)果表明，玫煙色棒束孢 NBL-Z8對桃蚜的生物防治潛力較大。此外，大量研究表明，玫煙色棒束孢對煙粉虱[27-29]、柑橘木虱[30-31]、小菜蛾[32]和朱砂葉螨[33]等多種害蟲具有較強的侵染力，是一種性能優(yōu)良的昆蟲病原真菌。

目前國外已經(jīng)篩選出具有高致病力的菌株，自20世紀60年代以來，已經(jīng)有10種玫煙色棒束孢制劑產(chǎn)品獲得注冊登記[34]，而國內(nèi)尚未出現(xiàn)商品化的玫煙色棒束孢制劑。因此，今后的工作重點是進行商品化研究，包括生產(chǎn)發(fā)酵技術、大田施用技術及田間評價體系等，可以為害蟲的綜合防治提供產(chǎn)品和技術支持。

4 結(jié)論

玫煙色棒束孢NBL-Z8對桃蚜具有較強的室內(nèi)毒力，可作為桃蚜生防制劑開發(fā)的潛力菌株。

參考文獻：

[1]von Dohlen C D，Rowe C A，Heie O E，et al. A test of morphological hypotheses for tribal and subtribal relationships of Aphidinae （Insecta：Hemiptera：Aphididae） using DNA sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2006，38（2）：316-329.

[2]鄭竹勝，邢 鯤，趙 飛，等. 甘藍蚜蟲田間防治研究[J]. 中國果菜，2015，35（4）：59-61.

[3]閏彥萍，王海榮，韓巨才. 山西甘藍蚜對7種殺蟲劑的抗性監(jiān)測[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34（18）：4684-4685.

[4]Nauen R，Elbert A. European monitoring of resistance to insecticides in Myzus persicae and Aphis gossypii （Hemiptera：Aphididae） with special reference to imidacloprid[J]. Bulletin of Entomological Research，2003，93（1）：47.

[5]武銀玉，曹亞萍，楊秀麗，等. 麥蚜抗藥性現(xiàn)狀及抗性治理研究進展[J]. 小麥研究，2017，38（2）：1-8.

[6]苗艷香. 蔬菜蚜蟲抗藥性現(xiàn)狀及治理策略[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)工程，2019，43（1）：68-70.

[7]Srigiriraju L，Semtner P J，Bloomquist J R. Monitoring for imidacloprid resistance in the tobacco-adapted form of the green peach aphid，Myzus persicae （Sulzer） （Hemiptera：Aphididae） in the eastern United States[J]. Pest Management Science，2010，66（6）：676-685.

[8]Zimmermann G. The entomopathogenic fungi Isaria farinosa （formerly Paecilomyces farinosus） and the Isaria fumosorosea species complex （formerly Paecilomyces fumosoroseus）：biology，ecology and use in biological control[J]. Biocontrol Science and Technology，2008，18（9）：865-901.

[9]曹 娜. 玫煙色棒束孢發(fā)酵條件及對刺吸式口器害蟲控制潛力研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2018.

[10]朱麗梅，嚴 慧，方慧子，等. 玫煙色棒束孢QH4對蚜蟲和煙粉虱殺蟲活性的研究[J]. 金陵科技學院學報，2018，34（1）：84-87.

[11]鄧建華，吳興富，莊 輝，等. 兩種擬青霉對煙蚜感染作用試驗[J]. 煙草科技，2005（3）：46-48.

[12]孫 莉，張艷璇，趙玲玲，等. 利用胡瓜新小綏螨攜帶玫煙色擬青霉菌兼防茄子蚜蟲和葉螨[J]. 中國農(nóng)學通報，2015，31（20）：91-96.

[13]邢培翔，刁紅亮，韓志慧，等. 煙色棒束孢IF-1106對2種果樹蚜蟲的致病力[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學，2019，47（11）：2029-2033，2045.

[14]李農(nóng)昌，樊美珍，李春如，等. 白僵菌有關培養(yǎng)條件及其與毒力關系的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報，1996，23（3）：254-259.

[15]張仙紅，張 奐，張未仲. 玫煙色擬青霉最適液體培養(yǎng)條件的研究[J]. 微生物學雜志，2006，26（6）：15-18.

[16]田 晶. 玫煙色棒束孢生物學特性及對煙粉虱致病作用研究[D]. 晉中：山西農(nóng)業(yè)大學，2014.

[17]Meyling N V，Eilenberg J. Ecology of the entomopathogenic fungi Beanveria bassiana and Metarhnm anisopliae in temperate agroecosystems：potential for conservation biological control[J]. Biological Control，2007，43（2）：145-155.

[18]Shan L T，F(xiàn)eng M G. Evaluation of the biocontrol potential of various Metarhiziu misolates against green peach aphid Myzus persicac （Homoptcra：Aphididae）[J]. Pest Management Scicnce，2010，66（6）：669-675.

[19]Poprawski T J，Parker P E，Tsai J H，et al. Laboratory and field evalua tion of hyphomycete insect pathogenic fungi for control of brown citrus aphid （Homoptera：Aphididae）[J]. Environmental Entomology，1999，28（2）：315-321.

[20]Diaz B M，Oggcrin M，Lastra C C L，et al. Characterization and virulence of Lecanicillium lecanii against diffetent aphid species[J]. BioControl，2009，54（6）：825-835.

[21]劉 浩，張 龍，張宗山. 蠟蚧輪枝菌對枸杞蚜蟲的室內(nèi)毒力和常用藥劑敏感性測定[J]. 中國蔬菜，2012（4）：87-90.

[22]Grenier A M，Duport G，Pages S，et al . The phytopathogen Diekeya dadantii （Frwinia chrysanthcmi 3937） is a pathogen of the pea aphid[J]. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（3）：1956-1965.

[23]Costeeharcyre D，Balmand S，Condemine G，et al. Dickeya dadantii，aplant pathogenic bacterium producing Cyt-like entomotoxins，causes septicemia in the pea aphid Acyrthosiphon pisum[J]. PLoS One，2012，7（1）：e30702.

[24]陳巍巍，馮光明. 四株玫煙色擬青霉作為桃蚜微生物防治因子的潛力評價[J]. 浙江大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），1999，25（6）：563-568.

[25]張仙紅，嵇能煥. 玫煙色擬青霉菌株的毒力測定[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學學報，2006，26（1）：24-26.

[26]孟 豪，田 晶，付淑慧，等. 玫煙色棒束孢與球孢白僵菌對桃蚜致病力對比[J]. 植物保護學報，2014，41（6）：717-722.

[27]周鵬飛，張 婧，張博文，等. 玫煙色棒束孢的遺傳地理差異及對B型煙粉虱的致病性[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報，2018，39（3）：60-64.

[28]Flores-Macias A，Diaz M P，Ramos-Lopez M A，et al. Study of the entomopathogenic fungus Isaria fumosorosea as microbiological control of the white fly Bemicia tabaci[J]. Interciencia，2013，38（7）：523-527.

[29]Tian J，Diao H L，Li L，Hao C，et al. Pathogenicity of Isaria fumosorosea to Bemisia tabaci，with some observations on the fungal infection process and host immune response[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2015，130：147-153.

[30]Hoy M，Singh R. Evaluations of a novel isolate of Isaria fumosorosea for control of the Asian citrus psyllid，Diaphorina citri （Hemiptera：Psyllidae）[J]. Florida Entomologist，2010，93：24-32.

[31]代曉彥，任素麗，周雅婷，等. 黃龍病媒介昆蟲柑橘木虱生物防治新進展[J]. 中國生物防治學報，2014，30（3）：414-419.

[32]呂利華，何余容，武亞敬，等. 玫煙色擬青霉對小菜蛾致病力的時間-劑量-死亡率模型模擬[J]. 昆蟲學報，2007，50（6）：567-573.

[33]Shi W B，F(xiàn)eng M G. Ovicidal activity of two fungal pathogens （Hyphomycetes） against Tetranychus cinnabarinus （Acarina：Tetranichidae）[J]. Chinese Science Bulletin，2004，49（3）：263-267.

[34]de Faria M R，Wraight S P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides：a comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types[J]. Biological Control，2007，43（3）：237-256.