有棱絲瓜耐熱性種質(zhì)資源篩選與耐熱生理響應(yīng)

朱德寧 劉素娜 趙綺薇 曹翠文 李蓮芳

摘要：開展有棱絲瓜耐熱性材料篩選與鑒定試驗，通過對30個品種高溫處理并進行耐熱性資源評價與耐熱性品種篩選，再從中選出3個不同耐熱性材料研究有棱絲瓜在高溫脅迫下的生理響應(yīng)機制。30個有梭絲瓜品種中，泰國絲瓜2等4個品種是耐熱品種;2017肉資-13等9個品種為較耐熱品種;泰國絲瓜1等6個品種是不耐熱品種;2018RZ-20等11個品種為熱敏品種。通過對耐熱品種2018RZ-19、較耐熱品種2017肉資-13和熱敏品種 2018CL-8 進行高溫脅迫，分別測定葉片細(xì)胞中相對電導(dǎo)率等生理指標(biāo)。測定結(jié)果顯示，葉片的細(xì)胞膜透性、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量均隨著高溫脅迫時間的延長而有不同程度增加。保護酶活性對植物高溫脅迫有一定影響，葉綠體色素含量隨著高溫脅迫時間的延長有所下降。對絲瓜耐熱性品種進行篩選及綜合評價分析，對有棱絲瓜種質(zhì)資源的收集與遺傳育種具有指導(dǎo)性意義。

關(guān)鍵詞：有棱絲瓜;耐熱性;生理響應(yīng);高溫脅迫;種質(zhì)資源;綜合評價

中圖分類號： S642.401 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0132-06

絲瓜分為普通絲瓜[Luffa cylindrical （L） Roem.Violales]和有棱絲瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]2個栽培種，主要分布于熱帶、亞熱帶的亞洲各地，在我國南北均有栽培，是我國主要的瓜類蔬菜，廣東省等南方地區(qū)以栽培有棱絲瓜為主。有棱絲瓜別稱廣東絲瓜，在華南簡稱為絲瓜，是葫蘆科絲瓜屬一年生攀緣草本植物，也是華南地區(qū)特產(chǎn)蔬菜之一[1-2]。有棱絲瓜為短日照植物，生物學(xué)特性喜溫耐濕，適宜其生長的環(huán)境溫度為20～30 ℃[3]。植物在長時間高溫條件下會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致使細(xì)胞內(nèi)溶物外滲，細(xì)胞膜內(nèi)外滲透平衡將受到影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，從而引起植株損傷甚至死亡[4-5]。在生產(chǎn)上溫度過高會導(dǎo)致絲瓜生長緩慢、產(chǎn)量下降、畸形瓜增多、品種下降等問題。

在我國南方地區(qū)，夏季炎熱，高溫高濕，大棚內(nèi)溫度更是高達42 ℃以上，對植物的生長發(fā)育甚至夏季蔬菜的市場供應(yīng)影響極大[6]。植物高溫脅迫反應(yīng)往往與植物種類、植物生長發(fā)育階段、植物器官部位與發(fā)育階段等有關(guān)[7]。絲瓜作為華南地區(qū)特色蔬菜之一，夏秋2季溫度偏高，田間溫度甚至高至40 ℃左右，對絲瓜的生長發(fā)育及品種選育產(chǎn)生較大的影響。因此，開展絲瓜耐熱性種質(zhì)資源綜合評價及高溫脅迫的生理響應(yīng)，對提高絲瓜品質(zhì)質(zhì)量與遺傳育種有重大意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究試驗材料為30份有棱絲瓜核心種質(zhì)資源，由廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院及國內(nèi)外引進的有棱絲瓜品種（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 有棱絲瓜苗期耐熱性篩選與鑒定 試驗于2019年7—11月在廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院南沙試驗基地進行。每個品種取種子20 g，溫湯浸種后，用紗布或棉布吸干水分，然后放置恒溫箱32 ℃左右下催芽，露白后即可播種[8]。采取穴盤育苗，將種子播于裝有基質(zhì)（草炭 ∶ 蛭石=3 ∶ 1）的32孔穴盤中，于光/暗周期14 h/10 h、溫度25 ℃條件下育苗。當(dāng)出苗率達到50%～60%后，揭去黑紗。1～2 d之后，移至田間，便于通風(fēng)補光以促使幼苗健壯生長。15 d左右，當(dāng)植株幼苗生長至1～2張真葉時，選取健壯幼苗20株，移至光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠生產(chǎn)）中培養(yǎng)。開始先在光照培養(yǎng)箱中適應(yīng)1 d， 然后將光培箱溫度設(shè)置為白天45 ℃、夜間30 ℃，相對濕度設(shè)置為75%光照度設(shè)置為全光照 171.4 μmol/（m2·s），光—暗周期12 h—12 h，高溫處理 5 d。

1.2.2 熱害指數(shù)與熱害等級分級 將上述30個核心種質(zhì)苗期移至光培箱進行高溫處理，每天記錄并統(tǒng)計幼苗的熱害情況，熱害程度包括子葉、真葉、心葉以及下胚軸及整株生長狀況，并進行拍照記錄。通過隸屬函數(shù)法與聚類分析法對30個品種的耐熱性進行綜合評價分析，初步篩選出有棱絲瓜耐熱性品種。根據(jù)不同品種在高溫脅迫下產(chǎn)生不同的熱害癥狀，將熱害癥狀進行分級處理。結(jié)合前人的研究經(jīng)驗，將熱害根據(jù)癥狀的輕重程度劃為0級、1級、2級、3級和4級。0級，即植株幼苗生長正常，無熱害;1級，植株幼苗1～2張葉稍微黃化，癥狀輕微;2級，植株幼苗1～2張葉片或真葉開始發(fā)黃，生長緩慢;3級，植株幼苗失水較多，2～3張葉或真葉萎蔫，心葉不正常;4級，整株葉片萎蔫或者枯死，下胚軸失水嚴(yán)重，心葉萎縮，植株倒伏嚴(yán)重（圖1）。

1.3 高溫脅迫下有棱絲瓜生理指標(biāo)測定

根據(jù)絲瓜苗期耐熱性品種的篩選，開展絲瓜對高溫脅迫的生理響應(yīng)，選取3個品種，分別為耐熱品種2018RZ-19、較耐熱品種2017肉資-13、熱敏品種2018CL-8。將以上3個品種苗期移至光培箱，并進行高溫脅迫處理，條件設(shè)置為45 ℃（白天），30 ℃ （夜間），相對濕度為75%，全光照 171.4 μmol/（m2·s），光暗周期設(shè)置為12 h/12 h。在高溫處理0、1、2、3 d條件下通過測定其相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性糖含量、保護酶活性及葉綠素含量等生理指標(biāo)，探索不同耐熱性絲瓜對高溫脅迫的生理響應(yīng)。

1.3.1 相對電導(dǎo)率測定 在絲瓜幼苗經(jīng)高溫處理后的0、1、2、3 d分別采集葉片，每個品種的同一葉位各取1張完全展開葉，1個品種采3株，共3個重復(fù)。將葉片在超純水中洗凈并擦干。采用 1.0 cm 的打孔器提取植株小葉片10張，放進試管中，加入15 mL蒸餾水。設(shè)置3個不同溫度條件，分別為室溫、50、100 ℃。首先，室溫下把小葉片和蒸餾水一起大力搖晃30 min后測量水溶液傳導(dǎo)電流的能力（EC0）;再放進50 ℃水浴中加熱30 min后，拿出來待溫度降至室溫后測量水溶液傳導(dǎo)電流的能力（EC1）;之后置于100 ℃水浴煮沸5 min后，拿出來待溫度降至室溫后測量水溶液傳導(dǎo)電流的能力（EC2），重復(fù)3次，取平均值。相對電導(dǎo)率的計算公式：RC=（EC1-EC0）/（EC2-EC0）×100%[9-10]。

1.3.2 丙二醛含量與可溶性糖含量測定 采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定丙二醛含量和可溶性糖含量[11-12]。在絲瓜幼苗經(jīng)高溫處理后0、1、2、3 d條件下分別采集葉片，在同一葉位各取1張完全展開葉，重復(fù)3次。將葉片清洗干凈并擦干。用電子天平稱取0.1 g葉片，放入研缽中，加入1.8 mL 10%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂研磨至勻漿，然后再加入4 mL 10%三氯乙酸（TCA）進一步充分研磨，將勻漿轉(zhuǎn)移到離心管中，4 000 r/min離心 10 min; 取上清液1 mL， 加入1 mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，混勻后在沸水浴上煮15 min，待冷卻再離心1次，取上清液在波長450、532、600 nm下的分別測定上清液吸光度，之后根據(jù)丙二醛（MDA）與可溶性糖含量顯色反應(yīng)測定葉片中MDA含量與可溶性糖含量。

1.3.3 葉綠素含量測定 葉綠素含量采用李合生的方法[13]測定。在絲瓜幼苗經(jīng)高溫處理后0、1、2、3 d條件下分別采集葉片，用清水清洗干凈并擦干，然后將葉片剪碎;稱取葉片0.2 g，轉(zhuǎn)至研缽中，加入適量乙醇，少量碳酸鈣粉和石英砂，研磨成勻漿，再加入乙醇10 mL，繼續(xù)充分研磨至組織轉(zhuǎn)白色，凈置。待靜置完之后，將其倒入25 mL棕色容量瓶中，用乙醇清洗干凈研缽表面，最后定容至 25 mL，上下?lián)u勻充分;用1 cm比色皿測量其在665、649、470 nm的吸光度，數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計。

1.3.4 保護酶活性的測定 在絲瓜幼苗經(jīng)高溫處理后的0、1、2、3 d采集葉片，在同一葉位各取1張完全展開葉，在超純水中洗凈并擦干。采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性，氮基四唑（NBT）法測定SOD活性[2]，南京建成生物工程研究所試劑盒測CAT活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 有棱絲瓜耐熱性品種篩選與熱害分級

通過對30個有棱絲瓜試驗品種進行高溫處理，結(jié)合耐熱指數(shù)統(tǒng)計分析，對有棱絲瓜耐熱性進行綜合評價分析，確定耐熱癥狀分級。然后利用聚類分析法對30個絲瓜品種進行聚類分析，將30個有棱絲瓜品種劃分成耐熱品種、較耐熱品種、不耐熱品種和熱敏品種4個類型。其中，耐熱品種包括泰國絲瓜2、2018RZ-19、綠勝3號、2018RZ-7 4個品種;較耐熱品種包括2017肉資-13、2019DS-11、夏勝4號等9個品種，不耐熱品種包括泰國絲瓜1、2013示范-長資-6-2、2014NSCT-32等6個品種;熱敏品種有2018RZ-20、2012-分離-長-32-2、2018RZ-37等11個品種（表2）。

2.2 細(xì)胞膜透性的變化

高溫脅迫后，有棱絲瓜的細(xì)胞膜相對電導(dǎo)率呈增加趨勢。高溫脅迫之前，不同耐熱性有棱絲瓜品種的細(xì)胞膜透性差異不明顯（圖2）。高溫處理1 d后，不同耐熱性品種的細(xì)胞膜透性差異變化也不大。而在高溫脅迫處理3 d后，3個品種的相對電導(dǎo)率明顯增大，熱敏品種2018CL-8和較耐熱品種2017肉資-13的相對電導(dǎo)率明顯高于耐熱品種2018RZ-19，其中熱敏品種2018CL-8的相對電導(dǎo)率變化最大，增加了126.08%，較耐熱品種2017肉資-13的相對電導(dǎo)率上升了58.91%，而耐熱品種2018RZ-19的相對電導(dǎo)率僅上升了6.14%。由此可見，受到高溫脅迫之后，耐熱性品種細(xì)胞膜可能會保持比較穩(wěn)定，透性變化不大;而熱敏品種在高溫脅迫下，細(xì)胞膜受損比較嚴(yán)重，通透性加大，從而導(dǎo)致電導(dǎo)率快速上升。

2.3 丙二醛含量的變化

不同高溫處理時間對有棱絲瓜丙二醛含量有比較大的影響。正常情況下，3個品種丙二醛的含量差異不明顯，基本在0.01 μmol/g。經(jīng)過高溫處理2 d后，3個品種的丙二醛含量明顯上升，其中熱敏品種2018CL-8的丙二醛含量變化最大。而在持續(xù)高溫脅迫處理3 d后，不同耐熱性品種的丙二醛含量均增加至最大值（圖3），其中熱敏品2018CL-8的丙二醛含量增大了179.67%，較耐熱品種2017肉資-13的丙二醛含量增大至135.58%，耐熱品種2018RZ-19變化最小，為51.02%。結(jié)果表明，高溫脅迫對有棱絲瓜丙二醛含量有影響，在一定程度上，隨著高溫處理時間延長會導(dǎo)致丙二醛含量增大，說明丙二醛含量與耐熱性有一定關(guān)系。因此，高溫處理下耐熱品種的丙二醛變化比熱敏品種小。

2.4 可溶性糖含量的變化

可溶性糖含量的變化與丙二醛含量有點類似。在高溫處理0、1 d，不同耐熱性品種的可溶性糖含量的變化差異不明顯（圖4）。但3個品種可溶性糖含量隨著高溫脅迫時間的延長都有一定的上升，在高溫處理2 d后，可溶性糖含量變化明顯，其中，熱敏品種2018CL-8的可溶性糖含量變化最大，耐熱品種2018RZ-19的可溶性糖含量影響比較小。高溫脅迫3 d后，熱敏品種2018CL-8的可溶性糖含量是高溫處理之前的4.57倍，較耐熱品種2017肉資-13、耐熱品種2018RZ-19分別是高溫處理之前的2.56倍、2.03倍。表明高溫脅迫下耐熱性強的品種新陳代謝運動可能比耐熱性弱的品種小，植物在高溫脅迫下通過增加可溶性糖含量來提高細(xì)胞的滲透濃度，保持細(xì)胞內(nèi)外滲透的平衡，從而提高自身的抗逆性。

2.5 葉綠素含量的變化

葉綠素含量隨著高溫脅迫處理時間的延長有所下降（圖5）。在高溫脅迫處理0、1 d時，高溫脅迫對不同耐熱性品種葉綠素含量基本無影響，保持比較穩(wěn)定。隨著高溫處理2 d之后，葉綠素含量開始下降，而且下降幅度明顯加快，處理3 d后下降至最低。其中，熱敏品種2018CL-8的葉綠素含量下降最大，比高溫處理之前下降67.3%，較耐熱品種2017肉資-13、耐熱品種2018RZ-19的葉綠素含量分別下降39.7%、26.9%。由此可以看出，高溫脅迫下葉綠素含量會有所下降，并且高溫處理時間越長，葉綠素含量下降越明顯。表明葉綠素含量的變化與植物耐熱性或許有關(guān)系。高溫脅迫會使植物的葉綠素合成減少，葉片稍微發(fā)黃，葉綠素含量下降。

2.6 高溫脅迫下SOD活性變化

從圖6可以看出，高溫處理后，SOD活性呈現(xiàn)上升趨勢或先上升、后下降趨勢。在高溫處理前，不同耐熱性品種的SOD活性差異并不明顯。高溫處理 1 d 后，3個品種的SOD活性出現(xiàn)了微小差異，而且不同耐熱性品種的SOD活性均呈小幅度上升趨勢。其中，耐熱品種2018RZ-8的上升幅度比熱敏品種2018CL-8和較耐熱品種2017肉資-13大。在高溫處理2 d，熱敏品種2018CL-8上升幅度最大，SOD活性上升了478%，耐熱品種2018RZ-19和較耐熱品種2017肉資-13分別上升了154%、318%。高溫處理3 d后，熱敏品種2018CL-8與耐熱品種2018RZ-19 SOD活性開始呈下降趨勢。

2.7 高溫脅迫下POD活性變化

高溫處理后，有棱絲瓜細(xì)胞中POD活性呈現(xiàn)先上升、后下降、再上升的趨勢（圖7）。高溫處理 0 d，3個品種有棱絲瓜細(xì)胞中的POD活性無明顯差異。高溫處理1 d，3個品種的POD活性均上升明顯，其中，熱敏品種2018CL-8上升最快，達原含量的2173%;較耐熱品種2017肉資-13、耐熱品種2018RZ-19分別增加了947%、511%。高溫處理 2 d 后，POD活性減小，其中，熱敏品種2018CL-8下降最明顯。高溫處理3 d，3個品種的POD活性開始上升。表明植物細(xì)胞通過調(diào)節(jié)POD酶的活性來抵御高溫脅迫導(dǎo)致的機體產(chǎn)生的過量的H2O2，POD活性升高，對H2O2的清除能力增強。

2.8 高溫脅迫下CAT活性變化

高溫處理后，有棱絲瓜細(xì)胞中，CAT活性呈下降趨勢（圖8）。高溫處理0 d，3個品種有棱絲瓜細(xì)胞中的CAT活性無明顯差異。高溫處理1 d，熱敏品種2018CL-8、較耐熱品種2017肉資-13和耐熱品種2018RZ-19的CAT活性均急速下降，基本下降了200%左右，其中，熱敏品種2018CL-8下降最多，下降了218%。高溫處理2 d，3個品種的CAT活性均下降，但下降不明顯。高溫處理 3 d，3個品種的CAT活性差異不明顯。

3 討論

植物在生長過程中，因外界環(huán)境因素往往會受到各種非生物脅迫的影響，高溫是影響植物生長因素之一。因此，有棱絲瓜的熱害指數(shù)、耐熱機制的生理調(diào)控及耐熱材料的篩選對其耐熱性鑒定和耐熱資源的綜合性評價有重要作用。耐熱性綜合評價涉及植物形態(tài)、光合作用、滲透調(diào)節(jié)、保護酶活性等生理特性及基因表達方面[14]。本試驗通過有棱絲瓜苗期高溫脅迫處理，建立有棱絲瓜苗期熱害脅迫評價體系，將其進行熱害癥狀分級，統(tǒng)計熱害指數(shù)，采用隸屬函數(shù)法和聚類分析法對30個有棱絲瓜品種進行了耐熱性鑒定，初步篩選出耐熱性品種4個，熱敏品種11個。通過試驗表明，耐熱性強的品種與不耐熱品種在高溫脅迫下生理反應(yīng)存在明顯差異。高溫脅迫會導(dǎo)致植物細(xì)胞膜完整性丟失，進而導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性增加和電解質(zhì)分解增大。丙二醛是細(xì)胞膜過氧化產(chǎn)物，也是細(xì)胞膜被破壞的標(biāo)志物質(zhì)。可溶性糖是植物細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。葉綠素是植物體內(nèi)的主要光合色素，受溫度影響比較大，其含量變化與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)，又是植物光合作用不可缺少的物質(zhì)[15]。在高溫脅迫前期，植物體內(nèi)催化超氧化物歧化和過氧化物氧化的反應(yīng)速度加快，從而降低體內(nèi)活性氧的濃度，達到減輕植物體內(nèi)因高溫脅迫產(chǎn)生的氧化反應(yīng)對植物細(xì)胞造成損傷的影響。因此，用相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性糖含量等指標(biāo)來衡量植物高溫脅迫受害程度有理論依據(jù)，對提高絲瓜遺傳育種與產(chǎn)量、質(zhì)量有重要現(xiàn)實意義。

參考文獻：

[1]何曉莉，羅劍寧，羅少波，等. 絲瓜主要生理特性研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（8）：114-116.

[2]張 勝. 絲瓜果實、種子性狀發(fā)育遺傳和種子質(zhì)量的研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2008.

[3]周小燕，羅劍寧，李金月，等. 有棱絲瓜苗期耐熱性及其對熱脅迫的生理響應(yīng)[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2017，25（4）：357-369.

[4]張紅梅，金海軍，丁小濤，等. 黃瓜幼苗對熱脅迫的生理反應(yīng)及葉綠素?zé)晒馓匦訹J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2011，29（5）：61-66.

[5]馬永戰(zhàn)，鄒 琦，程炳嵩. 高溫鍛煉與解除對冬小麥葉片細(xì)胞膜熱穩(wěn)定性的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1988（2）：57-60.

[6]伍紅雨，杜堯東. 近49年廣東高溫的氣候特征及其變化規(guī)律[J]. 熱帶氣象學(xué)報，2011，27（3）：427-432.

[7]任 彥. 番茄不同基因型耐熱性生理研究及種質(zhì)改良相關(guān)技術(shù)的研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2006：8-27.

[8]楊寅桂. 黃瓜耐熱性及熱脅迫響應(yīng)基因研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007：22-28.

[9]劉 寧，高玉葆，賈彩霞. 滲透脅迫下多花黑麥草葉內(nèi)過氧化物酶活性和脯氨酸含量以及質(zhì)膜相對透性的變化[J]. 植物生理學(xué)通訊，2000，36（1）：11-13.

[10]余炳偉，董日月，雷建軍，等. 黃瓜耐熱材料的篩選與鑒定[J]. 分子植物育種，2017，15（11）：4695-4705.

[11]涂三思. 黃姜POD和EST同工酶及高溫脅迫下脯氨酸可溶性糖和丙二醛含量變化研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004：16-24.

[12]林 艷，郭偉珍，徐振華，等. 大葉女貞抗寒性及冬季葉片丙二醛和可溶性糖含量的變化[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（25）：68-72.

[13]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[14]徐 海，宋 波，顧宗福，等. 植物耐熱機理研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，36（1）：243-250.

[15]李保印，周秀梅，王西波，等. 不同彩葉植物葉片中葉綠體色素含量研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，38（3）：285-288.