異丙腎上腺素誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激焦慮樣行為學(xué)檢測(cè)

張 影，魯艷杰，劉 瑩，許 倩，劉 鐳，左彥珍，李玉紅

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

隨著生物醫(yī)學(xué)模式向生物-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變，心理應(yīng)激在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的影響引起了越來(lái)越多的關(guān)注。慢性應(yīng)激是一種包括焦慮、抑郁、絕望等長(zhǎng)期的負(fù)面情緒，此時(shí)機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂，其中包括交感神經(jīng)系統(tǒng)（sympathetic nervous system, SNS）和下丘腦—垂體—腎上腺軸（the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA），SNS和HPA軸被激活后，所釋放的兒茶酚胺類激素是重要的應(yīng)激反應(yīng)激素，主要包括腎上腺素和去甲腎上腺素等[1-6]，這些激素作用于腎上腺素能α和β受體。近十年的研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激參與各種生理心理疾病的過(guò)程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-10]、DNA損傷[11]及其對(duì)大腦神經(jīng)元[12]的影響。在臨床上，慢性心理應(yīng)激現(xiàn)象普遍存在，主要是因?yàn)榛颊咴诮邮苤委煹倪^(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列身體上的不適，在這種長(zhǎng)期的壓力刺激下，患者容易產(chǎn)生以焦慮、抑郁為主的慢性應(yīng)激情緒[13]，處于慢性應(yīng)激狀態(tài)的患者會(huì)出現(xiàn)病情加重、生活質(zhì)量水平降低，甚至生存期縮短的現(xiàn)象。但是僅對(duì)出現(xiàn)慢性應(yīng)激焦慮情緒的患者實(shí)施護(hù)理教育等一般性心理支持，未能取得顯著效果。

慢性應(yīng)激動(dòng)物模型最早的建立方法是由Thaker等[14]通過(guò)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)建立的卵巢癌動(dòng)物模型，經(jīng)過(guò)多年的探索，Willner[15]改良的慢性不可預(yù)見(jiàn)性刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）試驗(yàn)的方法被廣泛接受，但是該試驗(yàn)方法操作難度較大，而且呈現(xiàn)出多樣化，方案的選擇與實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度的規(guī)定沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[16]。因此，慢性應(yīng)激動(dòng)物模型的建立方法尚不存在一種規(guī)范的方法，導(dǎo)致大多數(shù)實(shí)驗(yàn)局限在細(xì)胞水平。

β受體的激活與慢性應(yīng)激密切相關(guān)，利用外源性的兒茶酚胺類藥物異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠慢性應(yīng)激焦慮模型的方法具有可行性。本次實(shí)驗(yàn)以CUMS實(shí)驗(yàn)方法作為陽(yáng)性對(duì)照組，異丙腎上腺素的長(zhǎng)期誘導(dǎo)作為試驗(yàn)方案，旨在為慢性應(yīng)激焦慮模型的構(gòu)建提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明小鼠（昆明小鼠）50只，體質(zhì)量25～30g，購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2019-0008。SPF級(jí)飼養(yǎng)，晝夜節(jié)律12/12h，動(dòng)物定時(shí)給予食物和飲水（慢性應(yīng)激處理組除外）。

1.1.2 分組和模型制備 隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，昆明小鼠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，將50只昆明小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、慢性應(yīng)激組、ISO組、慢性應(yīng)激+ICI組、ISO+ICI組，每組10只。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及儀器 鹽酸異丙腎上腺素注射液ISO（上海禾豐制藥有限公司，中國(guó)）；ICI 118，551（Sigma，美國(guó)）；高架十字迷宮（型號(hào)：XR-XG201）；明暗箱（型號(hào)：XRXB120）；均購(gòu)自上海欣欣信息科技有限公司，采用配套行為學(xué)軟件進(jìn)行記錄。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

50只昆明小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、慢性應(yīng)激組、β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素（isoprenaline, ISO）組、慢性應(yīng)激+選擇性β2-AR阻滯劑ICI 118，551（ICI）處理組、β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素+選擇性β2-AR阻滯劑ICI 118，551（ISO+ICI）處理組，共5組，每組10只。對(duì)照組：正常飼養(yǎng)，每天腹腔注射生理鹽水；慢性應(yīng)激組：每天進(jìn)行慢性應(yīng)激處理；ISO處理組：利用β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素每天腹腔注射ISO（5mg/kg）；慢性應(yīng)激+ICI處理組：每天慢性應(yīng)激處理后腹腔注射ICI（0.2mg/kg）；ISO+ICI處理組每天腹腔注射給藥ISO（5mg/kg）和ICI（0.2mg/kg）。

慢性應(yīng)激處理方法:每天交替進(jìn)行通過(guò)禁食24h、禁水24h、黑暗刺激24h、光照刺激24h、貓叫聲（貓叫模擬軟件）刺激5min、冰上刺激1min、37℃水循環(huán)刺激5min、潮濕環(huán)境24h和倒立5min。

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將昆明小鼠放于面對(duì)開(kāi)放臂放至迷宮的中心區(qū)，攝像系統(tǒng)記錄下昆明小鼠5min運(yùn)動(dòng)軌跡視頻，指標(biāo)選擇：開(kāi)臂停留時(shí)間、閉臂停留時(shí)間、停留總時(shí)間及開(kāi)臂停留時(shí)間百分比；進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)、進(jìn)入閉臂次數(shù)、總次數(shù)和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比；判斷標(biāo)準(zhǔn)以昆明小鼠重心進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)，重心從該臂中退出為該次進(jìn)入活動(dòng)完成。

開(kāi)臂停留時(shí)間百分比=開(kāi)臂停留時(shí)間/（開(kāi)臂停留時(shí)間+閉臂停留時(shí)間）×100%；進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比=進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)/（進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)+進(jìn)入閉臂次數(shù)）×100%。

明暗箱實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將昆明小鼠放于明箱，攝像系統(tǒng)記錄下昆明小鼠5min運(yùn)動(dòng)軌跡視頻。指標(biāo)選擇：明箱停留時(shí)間、暗箱停留時(shí)間、明箱停留時(shí)間百分比、明箱活動(dòng)次數(shù)、暗箱活動(dòng)次數(shù)、穿梭總次數(shù)，選用動(dòng)態(tài)背景法監(jiān)測(cè)小鼠動(dòng)態(tài)，每只小鼠實(shí)驗(yàn)完成后均用75%酒精消毒以消除前一只小鼠的氣味。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

所有研究數(shù)據(jù)均應(yīng)用采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢性應(yīng)激組和ISO組昆明小鼠的行為學(xué)結(jié)果表現(xiàn)出一致性，慢性應(yīng)激+ICI組和ISO+ICI組與對(duì)照組小鼠表現(xiàn)出一致性。在現(xiàn)象上表明β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素可誘導(dǎo)昆明小鼠出現(xiàn)慢性應(yīng)激焦慮樣行為，而特異性β2受體阻滯劑ICI阻止了這一變化。

2.1 高架十字迷宮各臂停留時(shí)間結(jié)果

開(kāi)臂停留時(shí)間和開(kāi)放臂停留時(shí)間比例：慢性應(yīng)激組和ISO組小鼠均顯著小于對(duì)照組（P<0.05），慢性應(yīng)激+ICI組和ISO+ICI組與對(duì)照組昆明小鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；閉臂停留時(shí)間：慢性應(yīng)激組和ISO組小鼠均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），慢性應(yīng)激+ICI組和ISO+ICI組與對(duì)照組昆明小鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；停留總時(shí)間：各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖1：

圖1 高架十字迷宮中昆明小鼠各臂停留時(shí)間

2.2 高架十字迷宮各臂進(jìn)入次數(shù)結(jié)果

進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比：慢性應(yīng)激組和ISO組小鼠均顯著小于對(duì)照組（P<0.05），慢性應(yīng)激+ICI組和ISO+ICI組與對(duì)照組昆明小鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；進(jìn)入閉臂次數(shù)：慢性應(yīng)激組和ISO組小鼠均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），慢性應(yīng)激+ICI組和ISO+ICI組與對(duì)照組昆明小鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；進(jìn)入總次數(shù)：各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖2：

圖2 高架十字迷宮中昆明小鼠各臂進(jìn)入次數(shù)

2.3 明暗箱停留時(shí)間結(jié)果

慢性應(yīng)激組和ISO組昆明小鼠的明箱停留時(shí)間、明箱停留時(shí)間百分比均低于對(duì)照組昆明小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；暗箱停留時(shí)間高于對(duì)照組昆明小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。慢性應(yīng)激+ICI組和ISO+ICI組昆明小鼠的明箱停留時(shí)間、暗箱停留時(shí)間、明箱停留時(shí)間百分比與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。如圖3：

圖3 昆明小鼠明暗箱停留時(shí)間

2.4 明暗箱活動(dòng)次數(shù)結(jié)果

慢性應(yīng)激組和ISO組昆明小鼠的明箱活動(dòng)次數(shù)和 穿梭次數(shù)均低于對(duì)照組昆明小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；暗箱進(jìn)入次數(shù)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。慢性應(yīng)激+ICI組和ISO+ICI組昆明小鼠的明箱活動(dòng)次數(shù)、暗箱活動(dòng)次數(shù)和穿梭次數(shù)與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。如圖4：

圖4 昆明小鼠明暗箱進(jìn)入次數(shù)

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)可分為急性應(yīng)激和慢性應(yīng)激，在長(zhǎng)期慢性應(yīng)激刺激下，兒茶酚胺類激素的表達(dá)量增高，焦慮癥、抑郁癥等發(fā)病率增高，同時(shí)也會(huì)誘發(fā)很多疾病的發(fā)生，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等[17-20]?，F(xiàn)如今，對(duì)慢性應(yīng)激模型動(dòng)物的行為學(xué)分析是判斷動(dòng)物模型建立是否成功的主要手段，高架十字迷宮和明暗箱實(shí)驗(yàn)是動(dòng)物慢性應(yīng)激焦慮樣行為研究中較為經(jīng)典與成熟的測(cè)試方法[21-24]。目前較公認(rèn)的慢性應(yīng)激模型多為Willner改良的CUMS試驗(yàn)，但該方法并沒(méi)有一種規(guī)范的實(shí)驗(yàn)方案，加上在實(shí)際操作過(guò)程中的工作量較大，有時(shí)需要特殊儀器設(shè)備，并且在造模過(guò)程中容易造成動(dòng)物的物理?yè)p傷，方法仍不成熟。到目前為止，β2受體與慢性應(yīng)激關(guān)系的實(shí)驗(yàn)多數(shù)為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

異丙腎上腺素是常見(jiàn)的臨床用藥，是一種人工合成的藥物，對(duì)于β1和β2受體均具有強(qiáng)大的激動(dòng)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)使用外源性異丙腎上腺素模擬慢性壓力狀態(tài)時(shí)兒茶酚胺類激素的釋放，對(duì)昆明小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期刺激。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激小鼠更易表現(xiàn)為焦慮樣行為，在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為開(kāi)臂停留時(shí)間、進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)、開(kāi)臂停留時(shí)間百分比和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比均顯著減少，與本次行為學(xué)結(jié)果相符合；在明暗箱實(shí)驗(yàn)中，慢性應(yīng)激模型小鼠明箱停留時(shí)間、明箱停留時(shí)間百分比、明箱活動(dòng)次數(shù)顯著和穿梭次數(shù)顯著減少，暗箱停留時(shí)間顯著高，暗箱進(jìn)入次數(shù)與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明異丙腎上腺素藥物誘導(dǎo)組與慢性壓力刺激組出現(xiàn)一致的行為，即異丙腎上腺素能夠模擬慢性壓力刺激建立慢性應(yīng)激小鼠模型。用β2受體阻滯劑ICI處理的慢性應(yīng)激的昆明小鼠都表現(xiàn)出與對(duì)照組一致的行為方式，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中慢性應(yīng)激+ICI組和ISO+ICI組昆明小鼠的開(kāi)臂停留時(shí)間、進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)、開(kāi)臂停留時(shí)間百分比、進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比、進(jìn)入閉臂次數(shù)和進(jìn)入各臂總次數(shù)與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；明暗箱實(shí)驗(yàn)中慢性應(yīng)激+ICI組和ISO+ICI組昆明小鼠的明箱停留時(shí)間、暗箱停留時(shí)間、明箱停留時(shí)間百分比、明箱活動(dòng)次數(shù)、暗箱活動(dòng)次數(shù)和穿梭次數(shù)與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），此結(jié)果表明，特異性β2受體阻滯劑ICI可抑制慢性應(yīng)激小鼠出現(xiàn)焦慮樣行為，顯示異丙腎上腺素可能是通過(guò)β2受體發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完善。

本次實(shí)驗(yàn)符合良好慢性應(yīng)激模型特征[25]，體現(xiàn)出了動(dòng)物模型行為表現(xiàn)的模擬性（慢性應(yīng)激組和ISO處理組一致的行為學(xué)結(jié)果），同時(shí)也具有一定的理論合理性（造模手段與慢性應(yīng)激和β2受體相關(guān)）。考慮到β2特異性受體激動(dòng)劑易導(dǎo)致心悸、骨骼肌震顫等不良反應(yīng)明顯的副作用，長(zhǎng)期、單一應(yīng)用β2受體激動(dòng)劑可造成β2受體的下調(diào)，易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[26]，以及前期無(wú)β2特異性受體激動(dòng)劑動(dòng)物用藥的參考，本次實(shí)驗(yàn)未選β2特異性受體激動(dòng)劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，CUMS建立慢性應(yīng)激模型存在一定的不足，本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)長(zhǎng)期使用異丙腎上腺素誘導(dǎo)昆明小鼠，使其行為學(xué)表現(xiàn)與慢性應(yīng)激組一致，說(shuō)明異丙腎上腺素有望成為構(gòu)建慢性應(yīng)激動(dòng)物模型的有效藥物，為后續(xù)的臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供了一種新的慢性應(yīng)激焦慮模型的構(gòu)建思路。