實驗室大鼠超聲波的情緒意義與測量?

俞德霖 尹 彬

（福建師范大學心理學院 福建福州 350117）

大鼠（Rattus norvegicus）是生物學、醫(yī)學、心理學等學科常用的實驗動物。在使用大鼠實驗中，超聲波記錄可作為衡量其情緒狀態(tài)重要的行為學證據(jù)。

1 大鼠超聲波的分類與情緒意義

青春期和成年大鼠發(fā)出的超聲波（ultrasonic vocalizations）可分為兩大類：22 kHz 范圍的超聲波與50 kHz 范圍的超聲波[1]。22 kHz 范圍的超聲波的聲學特征是，頻率在20～35 kHz 之間，持續(xù)時間較長，可達300 ms 以上，缺乏明顯的頻率變化。50 kHz 范圍的超聲波根據(jù)聲音頻率的變化可進一步分為flat 和FM（frequency modulated）2 種：flat-50 kHz 超聲波的持續(xù)時長在10～100 ms 之間，頻率在35～50 kHz 內(nèi)幾乎保持不變；而FM-50 kHz超聲波的持續(xù)時長在20～150 ms 之間，頻率在40～80 kHz 之間，具有較大幅度的波動。

實驗表明，不同的超聲波頻率可反映大鼠的某些特定行為。22 kHz 范圍的超聲波被認為反映了厭惡和恐懼等消極情緒狀態(tài)：當大鼠身邊有捕食者存在或面對攻擊性同類時，會發(fā)出22 kHz 范圍的超聲波[2-3]。在曠場、高架十字迷宮等焦慮樣行為測試中，播放22 kHz 范圍的超聲波，會讓被測大鼠有更多的防御性行為，使其大腦中與焦慮、恐懼情緒調(diào)節(jié)和防御等相關(guān)的區(qū)域（例如，杏仁核和終紋狀核）c-Fos表達增加[4-5]。而50 kHz范圍的超聲波則會在受到食物獎勵，以及和同類進行社會互動等條件下發(fā)出，例如，在藥理學實驗中注射苯丙胺和與同伴進行打鬧（playful fighting）時[6-7]。而此類超聲波的發(fā)出在神經(jīng)生理上與中腦邊緣系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的活性，以及腹側(cè)紋狀體伏隔核的多巴胺活性增加有關(guān)[8-9]。在50 kHz 范圍超聲波的2 種子類型的行為學意義上，有學者認為，F(xiàn)M-50 kHz 超聲波代表了一種普遍的積極情緒狀態(tài)，而flat-50 kHz 超聲波則代表了一種社會接觸（social contact）的通訊[7]?；胤?0 kHz 范圍的超聲波則使大鼠在曠場、高架十字迷宮中有更多的探索行為，在生理上能誘導(dǎo)釋放多巴胺，使伏隔核中c-Fos陽性神經(jīng)元增加[4,10]。大鼠超聲波的回放效應(yīng)也從另一個側(cè)面驗證了其情緒功能。因此，在研究中可將22 kHz 范圍的超聲波作為大鼠在實驗過程中的消極情緒指標，而將FM-50 kHz 超聲波作為大鼠在實驗過程中的積極情緒指標，通過對聲波信號的編碼，量化大鼠的情緒狀態(tài)。

2 測量方法

實驗中最好用采樣率為384 kHz 的麥克風錄制。根據(jù)采樣定理，帶通信號的最低采樣率在帶寬的2～4 倍之間[11]。在實際的實驗室操作中發(fā)現(xiàn)，如果僅使用192 kHz 采樣率的麥克風或采樣上限為192 kHz 的錄音軟件錄制，在頻譜圖上實際的頻率上限只能達到60 kHz 左右，雖然這對于采集22 kHz 范圍的超聲波已足夠，卻不足以涵蓋50 kHz 范圍的超聲波可能覆蓋的全部頻率范圍。因此，如果要對大鼠的超聲波進行更全面的測量，使用384 kHz 采樣率的麥克風和錄音軟件更合適。錄音軟件可使用開源軟件Audacity，這款軟件最高可達到384 kHz 的采用率和PCM 24 bit 精度的錄制。麥克風與大鼠嘴部的距離15～60 cm 為宜，距離太近（＜5 cm）容易采集到大鼠的呼氣聲、腳步聲等噪音，干擾后續(xù)的數(shù)據(jù)分析；而距離太遠（＞150 cm）則會導(dǎo)致收集到的聲波信號過于微弱，難以被識別。同時，還應(yīng)注意消除環(huán)境背景噪音，例如，周邊的電流會產(chǎn)生30 kHz 的電磁干擾，可能影響到對22 kHz 范圍超聲波的識別。

圖1 展示了在實驗室采集到的50 kHz 范圍的超聲波樣本：①為FM-50 kHz 超聲波，可觀察到有明顯的頻率變化，并出現(xiàn)了方向相反的波峰；②為flat-50 kHz 超聲波，在波形上呈一條短平的直線。圖2 展示了在實驗室采集到的22 kHz 范圍的超聲波樣本；③為22 kHz 范圍的超聲波，持續(xù)時間接近500 ms，波形起伏不大。注意在圖1 和圖2的縱坐標軸30 kHz 處均有一條明顯的直線，即為周邊電流產(chǎn)生的電磁噪聲。

圖1 50 kHz 范圍的超聲波示例

在對超聲波的分析上，可將采集到的音頻使用MATLAB 進行快速傅里葉變換（FFT）生成頻譜圖（圖1、圖2），由數(shù)位經(jīng)過訓(xùn)練的研究者進行人工篩選，且對人工篩選結(jié)果計算評分者信度（inter-rater reliability），即數(shù)位實驗者統(tǒng)計結(jié)果間的 相 關(guān) 性[6]。也 可 使 用Avisoft、Ultravox 和 基 于MATLAB 的DeepSqueak[12]等自動化的分析軟件對大鼠發(fā)出的超聲波進行識別與統(tǒng)計。

圖2 22 kHz 范圍的超聲波示例

需要注意的是，當波形變化不大時，flat 與FM有時可能難以區(qū)分。建議遇到這種情況時，首先觀察波形，如果波形上出現(xiàn)方向相反的波峰，則歸到FM 中，否則歸到flat 中；其次看頻率的變化量（Δfrequency），如果頻率的變化量大于5 kHz，則歸到FM 中，否則歸到flat 中[13]。有時實驗室測量條件并不能完全消除背景噪聲（包括電磁的），仍然存在干擾，會在軟件分析上帶來很多的錯誤識別，需要在軟件分析的結(jié)果上再進行人工篩選。此外，一些噪聲可能在波形與頻率上和大鼠發(fā)出的超聲波比較接近，當從頻譜圖上無法區(qū)分時，可使用Audacity 等專業(yè)的音頻處理軟件改變音頻的速率（rate）后播放。根據(jù)人耳聽到的音色進行區(qū)分：噪音的音色比較接近金屬摩擦的聲音，而大鼠的音色比較接近鳥類的鳴叫。降低音頻的速率，既可降低大鼠超聲波的音高，使之進入人耳可聽范圍；又可讓持續(xù)時間僅10～20 ms 的超聲波更易被人識別。22 kHz 范圍的超聲波可降速至原速的20%～50%，50 kHz 范圍的超聲波可降速至原速的5%～10%。

3 應(yīng)用

大鼠的超聲波在精神病學和藥理學的研究上已得到廣泛應(yīng)用：例如，用22 kHz 范圍的超聲波評估大鼠焦慮或疼痛的情緒強度[14]，用50 kHz 范圍的超聲波評估大鼠愉悅的情緒強度[6]。在研究中可統(tǒng)計全記錄過程中出現(xiàn)的所有超聲波，也可對時間抽樣，統(tǒng)計單位時間內(nèi)的超聲波。在具體量化指標的選取上，近5 年的研究以統(tǒng)計超聲波的次數(shù)與累計持續(xù)時間居多，通過對實驗組與對照組在聲波次數(shù)或累計持續(xù)時間上的差異檢驗藥效。

在動物行為上，大鼠的超聲波也可作為一種編碼指標。例如，當大鼠發(fā)生攻擊行為時，使用聲波可區(qū)分大鼠的攻擊是屬于侵犯性的攻擊，還是娛樂性的攻擊，從而對行為進行更精確的、帶有情緒性的編碼。與其他測量大鼠情緒的方法，例如，皮質(zhì)酮、皮膚電等相比，超聲波的采集更方便，分析速度更快，并且是無創(chuàng)、非介入的。

還可通過對采集的聲波進行實時的快速傅里葉變換，依據(jù)頻譜圖的波形監(jiān)控實驗。例如，在進行T 迷宮等學習與記憶測試之前，發(fā)現(xiàn)大鼠發(fā)出大量22 kHz 范圍的超聲波，可能是大鼠被實驗者抓取而處于焦慮的情緒狀態(tài)。這時可適度安撫大鼠，或等大鼠不再發(fā)出22 kHz 范圍的超聲波之后再進行實驗，有助于在學習與記憶測試中排除情緒變量的干擾。未來研究者可考慮在涉及到大鼠情緒測量的課題中，采集大鼠的超聲波進行分析。