芍藥苷對(duì)幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

鄭婷婷 趙聰選 張莉

(1.大連市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連116000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院超聲心電中心，遼寧 沈陽(yáng)110032)

癲癇是以大腦神經(jīng)元突發(fā)異常放電導(dǎo)致大腦功能出現(xiàn)短暫障礙的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可導(dǎo)致大腦皮質(zhì)、海馬體等區(qū)域神經(jīng)元損傷，也是兒童最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一[1-2]。研究表明，約75%的癲癇患者于兒童時(shí)期起病，口服抗癲癇藥物是主要治療方法[3]。盡管癲癇的診斷和治療研究不斷進(jìn)步，但抗癲癇藥物的長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致諸多不良反應(yīng)，且仍有30%左右的兒童患者療效不佳，嚴(yán)重者發(fā)展為難治性癲癇，對(duì)患者的身心健康造成嚴(yán)重影響[4]。因此，探究癲癇的發(fā)病機(jī)制，尋找新的癲癇治療藥物及靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。芍藥苷是是白芍、赤芍和牡丹的主要有效成分，屬于水溶性單萜類(lèi)糖苷，據(jù)報(bào)道，芍藥苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)和調(diào)節(jié)免疫的作用，已廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究和治療中，能夠通過(guò)多種作用機(jī)制減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5-7]。癲癇發(fā)病后往往造成神經(jīng)元的損傷，我們猜想是否芍藥苷對(duì)癲癇發(fā)病造成的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。本研究采用腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)，觀察芍藥苷對(duì)幼鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，探究其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar幼年鼠72只，3周齡，體重(100±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0011。飼養(yǎng)條件：室溫(22±2)℃，濕度(50±10)%，每天定時(shí)換氣，保持12 h：12 h光暗照明，食水不限。研究方案獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 芍藥苷(純度≥98%，美國(guó)Sigma-Aldrich)；氯化鋰、匹羅卡品(美國(guó)Sigma-Aldrich)；地西泮注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司)；HE染色試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Nissl染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司)；引物(日本Takara)；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit，SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes(美國(guó)Thermo Scientific)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein gene，Bax)、線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白(dynamin-related protein 1，DRP1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔源單克隆抗體，羊抗兔二抗(美國(guó)CST公司)；平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)載體-1(equilibrative nucleoside transporter-1，ENT1)蛋白兔源單克隆抗體(美國(guó)abcam公司)；雙板垂直電泳儀(北京六一儀器廠，型號(hào)：DYCZ-24KS)；顯微鏡(日本奧林巴斯，型號(hào)：IX53)；多功能凝膠成像系統(tǒng)(Syngene，型號(hào)：G:BOX)；酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，型號(hào)：Multiskan MK3)；高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：TGL16MB)。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模與給藥 3周齡SPF級(jí)Wistar大鼠72只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、芍藥苷組(50 mg/kg，i.p.)。除對(duì)照組外，其余各組幼鼠腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)SE，造模方法參考文獻(xiàn)[8]：大鼠稱(chēng)重后腹腔注射127 mg/kg氯化鋰，20 h后腹腔注射1 mg/kg硫酸阿托品以降低匹羅卡品的外周膽堿能反應(yīng)，30 min后腹腔注射50 mg/kg匹羅卡品。對(duì)照組大鼠僅腹腔注射等量生理鹽水。造模后2 h，芍藥苷組大鼠腹腔注射芍藥苷(50 mg/kg/d)，對(duì)照組和模型組同時(shí)腹腔注射等量生理鹽水。造模后密切觀察大鼠行為學(xué)變化，按照Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]分為6級(jí)：0級(jí)為造模后無(wú)任何反應(yīng)；Ⅰ級(jí)為大鼠面部抽搐、口角咀嚼、胡須抖動(dòng)；Ⅱ級(jí)為大鼠面部抽動(dòng)陣攣，不自主點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)為大鼠單側(cè)肢體陣發(fā)性抽搐；Ⅳ級(jí)為大鼠雙側(cè)前肢抽搐，并出現(xiàn)站立現(xiàn)象；Ⅴ級(jí)為在Ⅳ級(jí)的基礎(chǔ)上大鼠出現(xiàn)站立不穩(wěn)和跌倒。達(dá)到 4級(jí)或以上的大鼠視為造模成功，癲癇發(fā)作30 min后腹腔注射10 mg/kg地西泮終止SE。

1.3.2 組織處理 造模1 d、3 d、7 d后，各組大鼠腹腔注射5%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉。每組取4只大鼠快速斷頭取腦，將腦組織存放于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于ELISA試劑盒、Western blot和qRT-PCR檢測(cè)。剩余大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，開(kāi)胸，暴露心臟，剪開(kāi)右心耳，灌注150 mL生理鹽水沖去血液，然后灌注150 mL 4%多聚甲醛固定，先慢后快，內(nèi)固定完畢后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定48 h，用于Nissl染色。

1.3.3 Nissl染色觀察海馬組織病理學(xué)改變 腦組織4%多聚甲醛固定，冠狀切取含海馬的視交叉前后3 mm 腦組織，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，預(yù)冷切片(厚度為4 μm)，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，Nissl染色液染色3～10 min，蒸餾水洗滌2次，每次15 s，95%乙醇脫水5 min，二甲苯透明5 min，滴加中性樹(shù)膠封片，置于顯微鏡高倍鏡下觀察，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡視野下Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量，取平均值。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)海馬組織SOD活力和MDA含量 取造模第7天獲取的大鼠海馬組織，加入預(yù)冷PBS緩沖液，冰上研磨成勻漿，10 000 r·min-1離心10 min取上清，離心半徑為12.5 cm，分裝在EP管中，-80 ℃保存。①SOD活性檢測(cè)：取待測(cè)樣品20 μL，依次加入SOD檢測(cè)緩沖液、WST-8工作液和反應(yīng)啟動(dòng)工作液，37 ℃孵育30 min，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算抑制百分率，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測(cè)定) /ΔA空白×100%，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的SOD酶活力(U/mg)。②MDA含量檢測(cè)：取待測(cè)樣品100 μL，依次加入工作液、蒸餾水和待測(cè)樣品，置于100 ℃水浴中孵育60 min，冰浴冷卻，10 000 g常溫離心10 min，吸取200 μL上清液加入玻璃比色皿中，測(cè)定各樣品在450 nm、532 nm和600 nm處的吸光度A值，計(jì)算ΔA450=A450測(cè)定-A450空白，ΔA532=A532測(cè)定-A532空白，ΔA600=A600測(cè)定-A600空白，MDA含量(nmol/g)=5×[12.9×(ΔA532-ΔA600)-2.58×ΔA450]。

1.3.5 Western Blot檢測(cè)海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1和ENT1蛋白表達(dá) 取造模第7天獲取的大鼠海馬組織，冰上研磨，離心取沉淀，加入裂解液提取組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后將條帶放入10 mL Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1兔源一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶1000，4℃過(guò)夜，第2天用TBST清洗后加入羊抗兔二抗(1∶2000)37℃孵育2 h，洗膜，滴加發(fā)光液，置凝膠成像系統(tǒng)顯影。免疫印跡實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參蛋白為GAPDH，Image J軟件分析各個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的灰度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3.6 qRT-PCR法檢測(cè)海馬Bcl-2、Bax、DRP1和ENT1 mRNA表達(dá) 取造模第7天獲取的大鼠海馬組織，冰上研磨，加1 mL Trizol裂解液提取組織總RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara 公司設(shè)計(jì)合成，所有樣品均以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq 酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA 模板2 μL+上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 5 min終止反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化。引物序列，見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠行為學(xué)變化 造模后5 min，大鼠出現(xiàn)面部抽搐、口角咀嚼、流涎、腹瀉等外周反應(yīng)。造模后10 min，大鼠面部抽動(dòng)陣攣，不自主眨眼、點(diǎn)頭、胡須抖動(dòng)。造模后30 min以上，大鼠呈雙側(cè)前肢抽搐和站立現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)站立不穩(wěn)和跌倒，表明造模成功。

2.2 芍藥苷對(duì)海馬組織病理變化的影響 Nissl染色顯示，對(duì)照組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元呈多層分布，錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞形態(tài)正常，染色均勻，排列緊密，胞體呈圓形或橢圓形，核仁明顯，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富，偶見(jiàn)細(xì)胞核固縮。與正常組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少、變形，排列紊亂，胞體縮小或破裂，細(xì)胞核固縮，胞漿內(nèi)尼氏小體顯著減少。與模型組比較，芍藥苷組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元受損程度減輕。見(jiàn)圖1。對(duì)照組、模型組、芍藥苷組Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量分別進(jìn)行組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1d=89.36，P1d<0.01；F3d=68.65，P3d<0.01；F7d=72.38，P7d<0.01)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，第1天、第3天和第7天時(shí)模型組(t1d=44.25，P1d<0.01；t3d=38.91，P3d<0.01；t7d=52.17，P7d<0.01)和芍藥苷組(t1d=25.73，P1d<0.05；t3d=36.84，P3d<0.01；t7d=42.28，P7d<0.05)Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量均顯著高于對(duì)照組，芍藥苷組Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量均低于模型組(t1d=47.69，P1d<0.01；t3d=37.19，P3d<0.01；t7d=26.58，P7d<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，對(duì)照組在第1天、第3天、第7天時(shí)Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.02，P>0.05)，模型組和芍藥苷組在第1天、第3天、第7天時(shí)Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量分別進(jìn)行組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F模型組=18.36，P<0.05；F芍藥苷組=11.14，P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較顯示，模型組在第3天和第7天時(shí)Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量均高于第1天(t3d=24.21，P3d<0.05；t7d=21.54，P7d<0.05)，第7天時(shí)Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量高于第3天(t7d=34.06，P7d<0.01)。芍藥苷組第3天和第7天時(shí)Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量低于第1天(t3d=19.36，P3d<0.05；t7d=33.27，P7d<0.01)，第3天和第7天時(shí)Nissl陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t3d=1.33，P3d>0.05；t7d=0.94，P7d>0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 Nissl染色觀察大鼠海馬組織病理變化(400×)Figure 1 Nissl staining was used to observe the pathological changes of rat hippocampus注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.芍藥苷組

表2 各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)Nissl染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較Table 2 Comparison of Nissl staining positive cells in each group at different time

2.3 ELISA法檢測(cè)芍藥苷對(duì)海馬組織氧化應(yīng)激的影響 對(duì)照組、模型組、芍藥苷組大鼠海馬組織SOD活力、MDA含量分別進(jìn)行組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.25、41.28、31.20，均P<0.01)，進(jìn)一步兩兩比較顯示，模型組和芍藥苷組SOD活力低于對(duì)照組(t模型組=25.66，P<0.05；t芍藥苷組=39.24，P<0.01)，MDA含量高于對(duì)照組(t模型組=31.32，P<0.01；t芍藥苷組=48.96，P<0.01)。與模型組比較，芍藥苷組SOD活力升高(t芍藥苷組=26.47，P<0.05)，MDA含量降低(t芍藥苷組=42.58，P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠海馬組織SOD活力和MDA含量比較Table 3 Comparison of SOD activity and MDA content in hippocampus of rats in each group

2.4 Western Blot檢測(cè)芍藥苷對(duì)海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、芍藥苷組Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1蛋白表達(dá)水平分別進(jìn)行組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.98、33.87、63.21、49.82，均P<0.01)。進(jìn)一步兩兩比較顯示，模型組(tbax=20.51，P<0.05；tDRP1=33.19，P<0.01；tENT1=26.32，P<0.05)和芍藥苷組(tbax=19.34，tDRP1=27.63，tENT1=19.77，均P<0.05)海馬組織Bax、DRP1和ENT1表達(dá)顯著高于對(duì)照組，模型組(tbcl-2=37.36，P<0.01)和芍藥苷組(tbcl-2=29.57，P<0.05)Bcl-2表達(dá)顯著低于對(duì)照組。與模型組比較，芍藥苷組Bax、DRP1和ENT1表達(dá)降低(tbax=61.25，tDRP1=58.17，tENT1=36.49，均P<0.01)，Bcl-2表達(dá)增加(tbcl-2=59.01，P<0.01)。見(jiàn)圖2，表4。

表4 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of protein expression of Bcl-2,Bax,drp1 and ENT1 in hippocampus of rats in each group

圖2 Western Blot檢測(cè)大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1蛋白表達(dá)Figure 2 Western blot was used to detect the protein expression of Bcl-2,Bax,DRP1 and ENT1 in hippocampus of rats

2.5 qRT-PCR檢測(cè)芍藥苷對(duì)海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1 mRNA的影響 結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、芍藥苷組3組間Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FBcl-2=26.14，P<0.05；FBax=49.78，P<0.01；FDRP1=24.76，P<0.05；FENT1=32.33，P<0.01)。進(jìn)一步兩兩比較顯示，模型組(tbax=44.36，P<0.01；tDRP1=46.37，P<0.01；tENT1=25.03，P<0.05)和芍藥苷組(tbax=43.45，tDRP1=52.24，tENT1=31.55，均P<0.01)海馬組織Bax、DRP1和ENT1 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，模型組(tbcl-2=29.31，P<0.05)和芍藥苷組(tbcl-2=48.05，P<0.01)Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組。與模型組比較，芍藥苷組Bax、DRP1和ENT1 mRNA表達(dá)降低(tbax=24.54，tDRP1=26.83，tENT1=19.06，均P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達(dá)增加(tbcl-2=28.65，P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1 mRNA表達(dá)比較Table 5 Comparison of Bcl-2,Bax,DRP1 and ENT1 mRNA expression in hippocampus of rats in each group

3 討論

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)發(fā)作性疾病，具有重復(fù)性、短暫性和發(fā)作性等特點(diǎn)，也是幼兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病中致死率和致殘率極高的急重癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[10-11]。癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)元異常放電和興奮，這種活動(dòng)與能量代謝密切相關(guān)，而線粒體在能量代謝和轉(zhuǎn)換過(guò)程中起關(guān)鍵作用[12-13]。研究表明，長(zhǎng)期反復(fù)的癲癇發(fā)作可導(dǎo)致線粒體功能受損，使參與調(diào)控線粒體分裂過(guò)程的關(guān)鍵蛋白——DRP1異常高表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元損傷[14]。ENT1是一種轉(zhuǎn)運(yùn)核苷及其類(lèi)似物的膜整合蛋白，該蛋白在哺乳動(dòng)物組織中廣泛存在，在控制神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外腺苷的水平中發(fā)揮主導(dǎo)作用，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng)[15]。研究表明，癲癇發(fā)作時(shí)，ENT1可通過(guò)抑制腺苷受體提高胞外谷氨酸水平，谷氨酸是人體內(nèi)主要的興奮性氨基酸，而興奮性氨基酸的水平過(guò)高可導(dǎo)致癲癇的發(fā)作[16]。Luo等[17]的研究表明，DRP1的表達(dá)異?？捎绊懢€粒體動(dòng)力學(xué)失衡，影響ENT1功能變化，增加谷氨酸等興奮性氨基酸的釋放增加，是導(dǎo)致癲癇的機(jī)制之一。在本研究中，我們以DRP1-ENT1軸為切入點(diǎn)，觀察芍藥苷對(duì)癲癇幼鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用，初步探究其作用機(jī)制。

在本研究中，我們通過(guò)腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)SE，模型組、芍藥苷組大鼠均出現(xiàn)癲癇發(fā)作，Racine評(píng)分為4級(jí)以上，表明造模成功。研究表明，癲癇發(fā)作可造成腦神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡，可直接影響患兒的病情發(fā)展和預(yù)后情況[18]。本研究通過(guò)Nissl染色觀察芍藥苷對(duì)癲癇大鼠海馬損傷的保護(hù)作用。病理切片染色顯示，模型組癲癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元受損明顯，排列紊亂，胞體縮小或破裂，細(xì)胞核固縮，胞漿內(nèi)尼氏小體減少，隨著時(shí)間的推移，損傷細(xì)胞數(shù)量增加。與模型組比較，芍藥苷組大鼠海馬CA3區(qū)受損神經(jīng)元數(shù)量減少，受損程度減輕，損傷細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間的推移未增加，表明芍藥苷對(duì)癲癇造成的大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有抑制作用。研究表明，癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病可誘發(fā)大腦細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)削弱其抗氧化能力，是癲癇發(fā)生及持續(xù)發(fā)作的重要機(jī)制之一，其中，SOD是一種重要的抗氧化酶，SOD的水平可反映機(jī)體清除自由基的能力；MDA則與組織細(xì)胞受損程度相關(guān)，是氧自由基損傷組織細(xì)胞后產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物[19-20]。夏順剛等[21]研究表明，調(diào)節(jié)患者機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)可有效減少癲癇發(fā)作。本研究結(jié)果顯示，癲癇可增加海馬組織MDA含量，降低SOD活力，而芍藥苷可抑制癲癇誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，增加SOD活力，減少M(fèi)DA產(chǎn)生。Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，Bax過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2可與Bax形成二聚體，抑制Bax基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[22-23]。研究表明，增加Bcl-2和降低Bax的表達(dá)水平可減少海馬神經(jīng)元的凋亡，產(chǎn)生對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用和抑制癲癇的作用[24]。在本研究中，我們檢測(cè)了第7天時(shí)各組大鼠海馬組織中Bcl-2和Bax的表達(dá)情況，以此檢驗(yàn)芍藥苷對(duì)癲癇發(fā)作誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，Bax蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，使用芍藥苷對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)后可顯著減少Bax的表達(dá)水平，增加Bcl-2的表達(dá)水平，表明芍藥苷可顯著改善癲癇發(fā)作導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。研究表明，癲癇發(fā)作與線粒體功能密切相關(guān)，DRP1是調(diào)控線粒體活動(dòng)的關(guān)鍵蛋白，可通過(guò)影響ENT1的表達(dá)參與癲癇的發(fā)生，而抑制EMT1的功能可降低海馬神經(jīng)元的動(dòng)作電位頻率，對(duì)癲癇發(fā)作后神經(jīng)元損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[25-26]。本研究檢測(cè)了癲癇發(fā)作后第7天時(shí)各組大鼠海馬組織DRP1和ENT1的蛋白和mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠海馬組織存在DRP1和ENT1基礎(chǔ)表達(dá)，而模型組海馬組織DRP1和ENT1蛋白和mRNA的表達(dá)顯著增加。與模型組比較，使用芍藥苷對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)可顯著減少DRP1和ENT1蛋白和mRNA的表達(dá)水平，表明芍藥苷能夠抑制癲癇誘發(fā)的DRP1和ENT1異常高表達(dá)。

4 結(jié)論

芍藥苷可減輕癲癇誘發(fā)的海馬組織損傷和細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制DRP1和ENT1的活化有關(guān)。