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    雞血藤對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)后恢復(fù)的作用及機(jī)制*

    2021-06-30 01:04:14丁徐趙毅黃濤宋登新
    西部醫(yī)學(xué) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:雞血藤性骨折骨密度

    丁徐 趙毅 黃濤 宋登新

    (上海市第一人民醫(yī)院寶山分院骨科,上海 200940)

    骨質(zhì)疏松癥是一種全身性、代謝性骨骼系統(tǒng)疾病,與年齡、性別、種族等因素密切相關(guān),骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的后果[1-4]。雞血藤來(lái)源于豆科植物密花豆的干燥藤莖,具有促進(jìn)骨折愈合、抗關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)血管生成等作用[5-8]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,近年研究表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨折的愈合密切相關(guān),激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠促進(jìn)骨折的愈合,使成骨細(xì)胞的數(shù)量增加,促進(jìn)新骨的生成[9-13]。本文通過(guò)研究雞血藤對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后恢復(fù)的作用及對(duì)大鼠體內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用,為骨質(zhì)疏松性骨折的治療提供新的參考和依據(jù),現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年雌性SD大鼠,6周齡,體質(zhì)量(180±20)g,購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(瀘)2017-0001],動(dòng)物房溫度(22±2)℃,濕度(50±10)%,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.2 主要儀器與試劑 雞血藤提取物(10∶1)購(gòu)自武漢市恒沃科技有限公司;雙能 X 線骨密度測(cè)量?jī)x購(gòu)自美國(guó)GE公司;IN STRON 3367電子拉伸試驗(yàn)機(jī)購(gòu)自英國(guó)英斯特朗公司;雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;LRP5、β-catenin、Runx2及GAPDH抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;RIPA蛋白裂解液、ECL顯色液購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 骨質(zhì)疏松大鼠模型的建立 將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、雞血藤低劑量組、雞血藤中劑量組及雞血藤高劑量組5組,每組12只。除對(duì)照組外,其余大鼠采用大鼠卵巢摘除法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型[14],具體方法為:腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后,采用背側(cè)入路,常規(guī)備皮、消毒后,取后方髂骨嵴上2cm,脊柱旁1cm處做長(zhǎng)約2cm縱行切口,依次切開皮膚,皮下和肌層,暴露腹腔,沿輸卵管尋找到卵巢組織后,嚴(yán)密結(jié)扎輸卵管并切除卵巢,逐層間斷縫合,術(shù)后肌肉注射給予每只大鼠80萬(wàn)U青霉素預(yù)防感染,對(duì)照組不做處理,然后所有大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)8周,期間大鼠自由飲食。造模結(jié)束后應(yīng)用雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x,檢測(cè)所有大鼠骨密度,以評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松大鼠模型建立是否成功。

    1.3.2 骨折大鼠模型的建立及給藥 骨質(zhì)疏松大鼠建模成功后,參照文獻(xiàn)方法[15],除對(duì)照組外,其余所有大鼠行右大腿中段外側(cè)縱向皮膚切口,長(zhǎng)約3cm,暴露股骨干,在股骨干中段用線鋸鋸斷成橫行骨折,用電鉆以直徑1.0mm克氏針從骨折端鉆入遠(yuǎn)端,穿出股骨髁,復(fù)位骨折,從近折端打入克氏針,截?cái)喽嘤嗫耸厢槪饘娱g斷縫合,術(shù)中注意保護(hù)坐骨神經(jīng)和肌肉組織,術(shù)后肌肉注射給予每只大鼠80萬(wàn)U青霉素預(yù)防感染,對(duì)照組不做處理。術(shù)后第二天開始,雞血藤低、中、高劑量組根據(jù)大鼠體重分別按照50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg灌胃給予大鼠雞血藤提取物,對(duì)照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水,所有組別每天給藥1次,連續(xù)給藥8周,最后一次給藥24h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3.3 大鼠骨密度的測(cè)定 給藥結(jié)束后,以大鼠右側(cè)股骨骨折端2.0mm×2.0mm 為中心區(qū)域,使用DPX-ALPHA LUNAR TM1通過(guò)雙能X射線吸收測(cè)定法(DEXA)在Hi-res、small animal模式下測(cè)量骨痂骨密度。

    1.3.4 大鼠股骨生物力學(xué)測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[16],所有大鼠禁食12h后,腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后腹主動(dòng)脈取血處死,取大鼠右側(cè)股骨標(biāo)本,去除克氏針后,進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn),加載速度為2 mm/min,計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線,然后讀出最大載荷和抗彎強(qiáng)度。

    1.3.5 蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE染色) 大鼠處死后,將右側(cè)股骨骨折端放入4%中性甲醛中固定48h,脫鈣液脫鈣處理,每周更換一次脫鈣液,共脫鈣5周,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,于正中矢狀面進(jìn)行4μm連續(xù)切片。然后進(jìn)行常規(guī)HE染色,在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。HE染色步驟:①脫蠟:將石蠟切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min。②復(fù)水:依次置于100%乙醇2 min→95%的乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min,各兩次,然后把水吸干。③蘇木精染色:置于蘇木精溶液中2 min,自來(lái)水流水沖洗,2 min,把水吸干。④分化:1%鹽酸乙醇分化30 s,自來(lái)水浸泡15 min,吸干水。⑤伊紅染色:置于伊紅溶液中2 min。⑥脫水:依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(Ⅰ)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min。⑦封片:置于通風(fēng)櫥,待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min,待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹膠封片。

    1.3.6 Western blot檢測(cè)大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平 將大鼠右側(cè)股骨骨折端骨組織在液氮中迅速研磨成粉末,取約200 g粉末加入1mL含PMSF的組織裂解液于冰上靜置2 h,采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,處理好待測(cè)樣品后,取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)膜,將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1h,經(jīng)LRP5、β-catenin、Runx2及GAPDH抗體(1∶1000)孵育后,4℃過(guò)夜。PBST充分洗膜后,加入二抗(1∶2000)室溫孵育1 h,PBST清洗后顯色液顯影,利用凝膠成像儀成像后,進(jìn)行灰度值檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1 骨折前各組大鼠全身骨密度 與對(duì)照組相比,模型組及雞血藤低、中、高劑量組大鼠全身骨密度均顯著降低(P<0.05),且模型組及雞血藤低、中、高劑量組間大鼠骨密度不存在顯著性差異(P>0.05),提示骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功,可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見(jiàn)表1。

    表1 骨折前各組大鼠全身骨密度Table 1 Whole body bone mineral density of rats in different groups before fracture

    2.2 雞血藤對(duì)骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨密度的影響 與對(duì)照組相比,模型組骨質(zhì)疏松性骨折大鼠股骨骨折端骨密度顯著降低(P<0.05),提示造模成功;與模型組相比,雞血藤低、中、高劑量組大鼠股骨骨折端骨密度顯著升高(P<0.05),且隨著雞血藤劑量的增加,骨折大鼠股骨骨密度逐漸升高,提示雞血藤能夠呈劑量依賴性顯著增加骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后的骨密度,促進(jìn)受損骨組織恢復(fù),改善術(shù)后骨組織生理結(jié)構(gòu)及功能,見(jiàn)表2。

    表2 各組大鼠股骨骨密度Table 2 Bone mineral density of femur in different groups of rats

    2.3 雞血藤對(duì)骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨生物力學(xué)的影響 與對(duì)照組相比,模型組大鼠最大載荷和抗彎強(qiáng)度均顯著降低(P<0.05),提示造模成功;與模型組相比,雞血藤低、中、高劑量組大鼠最大載荷和抗彎強(qiáng)度均顯著升高(P<0.05),且隨著雞血藤劑量的增加,大鼠最大載荷和抗彎強(qiáng)度逐漸升高,提示雞血藤能夠呈劑量依賴性顯著改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后的生物力學(xué)指標(biāo),促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨組織生理結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù),加速新骨的形成,增強(qiáng)骨組織硬度,從而降低大鼠再次骨折風(fēng)險(xiǎn),改善大鼠的疾病狀態(tài)及轉(zhuǎn)歸,見(jiàn)表3。

    表3 各組大鼠最大載荷和抗彎強(qiáng)度Table 3 Maximum load and bending strength of rats in different groups

    2.4 組織病理學(xué)檢查 與對(duì)照組相比,模型組大鼠骨痂骨小梁明顯減少,散在分布,排列不整齊,成骨細(xì)胞明顯減少,與模型組相比,雞血藤各劑量組大鼠骨痂骨小梁明顯增多,成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多,且雞血藤低、中劑量組大鼠骨小梁粗細(xì)均勻,排列緊密,部分連成網(wǎng)狀,可見(jiàn)新生微小血管,雞血藤高劑量組大鼠骨小梁增粗明顯,生長(zhǎng)旺盛,排列致密整齊,可見(jiàn)大量成骨細(xì)胞及新生血管,提示雞血藤能夠顯著改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨痂的形成,促進(jìn)骨組織的恢復(fù)及愈合,加快骨折大鼠新骨的形成,見(jiàn)圖1。

    圖1 各組大鼠組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE100×)Figure 1 Histopathological examination of rats in different groups注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.雞血藤低劑量組;D.雞血藤中劑量組;E.雞血藤高劑量組

    2.5 雞血藤對(duì)骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后股骨Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 各組大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平,見(jiàn)圖2。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,模型組大鼠骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平均顯著降低(P<0.05),提示骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨組織的恢復(fù)與Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān);與模型組相比,雞血藤各劑量組大鼠骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平均顯著升高(P<0.05),且LRP5、β-catenin、Runx2水平與雞血藤劑量表現(xiàn)出依賴性,提示雞血藤能夠顯著提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平,激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)骨折大鼠骨組織修復(fù)。

    圖2 各組大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平Figure 2 Protein levels of LRP5,β-catenin and Runx2 in femoral fracture tissues of rats in different groups注:與對(duì)照組相比,①P<0.05;與模型組相比,②P<0.05

    3 討論

    骨質(zhì)疏松癥是一種全身性、代謝性骨骼系統(tǒng)疾病,其病理特征為骨量降低、骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加,骨強(qiáng)度下降,易發(fā)生骨折。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制與年齡、性別、種族等因素密切相關(guān),其中絕經(jīng)后婦女發(fā)生率較高[1-3]。骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的后遺癥,目前臨床上對(duì)于骨質(zhì)疏松性骨折的治療基本原則是復(fù)位、固定、功能鍛煉和抗骨質(zhì)疏松[4]。

    雞血藤來(lái)源于豆科植物密花豆的干燥藤莖,中國(guó)古典醫(yī)學(xué)著作記載雞血藤具有活血補(bǔ)血,調(diào)經(jīng)止痛,舒筋活絡(luò)等作用。近年研究發(fā)現(xiàn),雞血藤具有促進(jìn)骨折愈合、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、改善心肌缺血、促進(jìn)血管生成、改善小鼠脾臟輻射損傷等藥理作用[5-8]。雞血藤用于治療骨質(zhì)疏松等相關(guān)疾病的中藥成方制劑廣泛記載于中醫(yī)古典醫(yī)學(xué)著作中,近年仲超[17]、宋松[18]等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)含有雞血藤的中藥方劑在骨質(zhì)疏松的臨床治療中療效顯著。但雞血藤對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)后恢復(fù)的作用及機(jī)制目前尚罕見(jiàn)明確報(bào)道。

    Wnt/β-catenin信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在發(fā)育過(guò)程許多不同的細(xì)胞和組織中,Wnt/β-catenin整合許多其他通路所傳遞的信號(hào),并通過(guò)多種細(xì)胞因子引起一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),β-catenin既是一個(gè)完整的細(xì)胞-細(xì)胞粘附接頭蛋白也是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)輔因子,存在于多種條件依賴的活化和抑制復(fù)合體中,與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和增殖密切相關(guān),同時(shí)也與多種疾病密切相關(guān)[9-10]。研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨折的愈合密切相關(guān),激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠促進(jìn)骨折的愈合,使成骨細(xì)胞的數(shù)量增加,促進(jìn)新骨的生成[11-13]。石曉征等[19]發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平顯著降低,梅花鹿茸Ⅰ型膠原能夠顯著改善大鼠骨密度,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。趙素霞等[20]研究發(fā)現(xiàn)去卵巢引起的大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān),通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)狀態(tài)能夠顯著改善大鼠骨質(zhì)疏松癥狀。史巖等[21]也發(fā)現(xiàn)在骨質(zhì)疏松性骨折大鼠疾病恢復(fù)過(guò)程中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路扮演著重要角色,調(diào)節(jié)大鼠該通路相關(guān)蛋白的表達(dá),能夠促進(jìn)骨折大鼠的傷口愈合。由此可見(jiàn),Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松及發(fā)病機(jī)制及疾病恢復(fù)過(guò)程中都至關(guān)重要,調(diào)節(jié)該信號(hào)通路的表達(dá)可能是骨質(zhì)疏松治療過(guò)程中的關(guān)鍵。

    本文研究結(jié)果表明:與模型組相比,雞血藤各劑量組大鼠股骨骨折端骨密度、最大載荷和抗彎強(qiáng)度均顯著升高,骨密度是反應(yīng)骨量的常用指標(biāo),骨生物力學(xué)中最大載荷及抗彎強(qiáng)度能夠直接反應(yīng)骨質(zhì)疏松骨骼的骨折風(fēng)險(xiǎn)及骨生理結(jié)構(gòu)及功能,這表明雞血藤能夠顯著提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨組織的生理結(jié)構(gòu)的恢復(fù),促進(jìn)新骨形成,加速骨折的愈合,降低大鼠再次發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn),改善大鼠的疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。組織病理學(xué)變化明顯改善,雞血藤各劑量組大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平均顯著升高,提示雞血藤能夠顯著提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)治療后骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平,激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)骨折大鼠骨組織修復(fù)。由于時(shí)間及資金限制,本文未能就雞血藤對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路上下游相關(guān)的其他蛋白進(jìn)行考察,擬在今后的研究中對(duì)雞血藤對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠發(fā)病機(jī)制相關(guān)的其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其靶向調(diào)節(jié)作用進(jìn)行深入探討。

    4 結(jié)論

    雞血藤能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠內(nèi)固定術(shù)后骨密度、骨生物力學(xué)等的恢復(fù),其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

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