豬整合素β1蛋白的表達(dá)及多克隆抗體的制備

王一，李春秋，欒廣宇，郭東華，張旭，原冬偉，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319）

整合素是一種成員較多的免疫受體蛋白，整合素（integrin）最早是在1987年研究發(fā)現(xiàn)的，其主要由α與β兩種亞基組成。目前發(fā)現(xiàn)有18種α亞基及8種β亞基，兩種亞基通過不同的組合方法形成了24種不同的整合素分子[1]。整合素是一種廣泛分布在細(xì)胞表面的膜狀蛋白，可在細(xì)胞表面作為重要的黏附受體[2]。根據(jù)配體結(jié)合特異性與亞基組成分類，整合素最大的三個(gè)分組為α亞基、β1亞基和β2亞基。整合素的受體包括精氨酶-甘氨酶-天冬氨酶（RGD）、層粘連蛋白、白細(xì)胞、膠原蛋白[3]。α和β亞基彼此不具有同源性，結(jié)構(gòu)有較大的差異。從細(xì)胞外結(jié)構(gòu)來看，雖然兩種亞基的胞外區(qū)都比較長(zhǎng)，大約含有700至1 100種氨基酸而胞內(nèi)區(qū)則相對(duì)較短，至含有40至70種氨基酸。但是我們也發(fā)現(xiàn)，和β亞基相比，α亞基的胞內(nèi)區(qū)的長(zhǎng)度較短，所以，二者的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)差異性較大。但是β4屬于一個(gè)例外，其胞內(nèi)區(qū)較長(zhǎng)[4]。

整合素的胞外區(qū)和細(xì)胞外基質(zhì)相連，胞內(nèi)區(qū)和細(xì)胞骨架相連。所以，整合素起到連接細(xì)胞和外界環(huán)境的功能，使得細(xì)胞具備黏附的能力[5]。整合素可以作為雙向性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介，它可以介導(dǎo)ECM信號(hào)從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)傳遞，調(diào)控細(xì)胞的活性、代謝、黏附、遷移等。此由外向內(nèi)傳遞信息由整合素與胞質(zhì)蛋白結(jié)合介導(dǎo)[6]。它也可以介導(dǎo)胞質(zhì)蛋白信號(hào)從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外傳遞，調(diào)控細(xì)胞分化、存活、增殖等，其中整合素β亞基在信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的作用。此由內(nèi)向外傳遞信號(hào)由胞內(nèi)的刺激因子介導(dǎo)[7-8]。整合素與黏附分子及信使分子相互作用而實(shí)現(xiàn)整合素的雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。整合素的亞基具有不同的功能，整合素β1是一種可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接的作用，使得細(xì)胞能夠產(chǎn)生黏附作用；而整合素β2主要作用于各個(gè)細(xì)胞之間，其主要在白細(xì)胞表面表達(dá)；整合素β3參與血小板聚集，在血栓形成中發(fā)揮作用[9]。

機(jī)體在感染病毒之后，細(xì)胞表面的受體最先和病毒接觸，從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，細(xì)胞表面的糖蛋白是最主要的受體物質(zhì)，也就是病毒最先與之結(jié)合的位置，而整合素正是一種存在于細(xì)胞表面的糖蛋白物質(zhì)[10]。研究發(fā)現(xiàn)整合素可以在多種病毒感染過程中發(fā)揮作用，整合素可以作為目前已知的多種病毒受體或共受體，例如人類皰疹病毒、艾博拉病毒、免疫缺陷病毒、腺病毒、口蹄疫病毒、輪狀病毒等[11-16]，促進(jìn)病毒感染宿主細(xì)胞，因此使其在病毒學(xué)研究領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。整合素β1及其自身和α亞基結(jié)合的異二聚體，都可以作為多種病毒的感染受體或感染相關(guān)蛋白參與病毒的侵入過程。例如，β1亞基和αv亞基形成的整合素αvβ1在禽偏肺病毒的感染過程中起著重要作用，促進(jìn)病毒與細(xì)胞的結(jié)合[17]；在狂犬病病毒感染者的機(jī)體內(nèi)，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)整合素β1發(fā)揮了重要作用，促進(jìn)了狂犬病病毒與細(xì)胞的結(jié)合，增加了感染的幾率[18]。高水平表達(dá)的整合素β1促進(jìn)愛波斯坦—巴爾病毒的感染[19]。整合素β1通過激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)牛痘病毒進(jìn)入細(xì)胞[20]。大腦中高效表達(dá)的整合素β1能夠促進(jìn)巨細(xì)胞病毒感染[21]。

目前，有關(guān)豬整合素β1作為與病毒感染受體或相關(guān)蛋白的報(bào)道鮮為人知，研究通過對(duì)豬整合素β1進(jìn)行序列優(yōu)化后利用大腸桿菌對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，從而制備出多克隆抗體，并對(duì)制備出的抗體進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)。為進(jìn)一步研究豬整合素β1在豬病毒感染過程中的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用兔購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，IPTG、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG及HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自Biosharp公司，Xh oI限制性內(nèi)切酶及Bam HI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，TMB單組分顯色液、質(zhì)粒小量提取試劑盒及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，PEG8 000試劑盒購(gòu)自德國(guó)BioFrox公司。

1.2 豬整合素β1基因的合成

通過CBS在線網(wǎng)站使用TMHMM-2.0工具分析豬整合素β1基因序列（GenBank NM_213968.1）的跨膜區(qū)、胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)。選擇親水的胞外區(qū)序列，用DNAStar軟件的Protean工具預(yù)測(cè)抗原區(qū)，根據(jù)大腸桿菌的偏愛密碼子對(duì)抗原性良好區(qū)域進(jìn)行優(yōu)化，在5'與3'末端加入Bam HI與Xho I酶切位點(diǎn)，豬整合素β1基因的核苷酸序列人工合成后與pGEX-6p-1載體連接，實(shí)驗(yàn)中所使用的質(zhì)粒pGEX-6p-1-β1是上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 豬整合素β1基因的原核表達(dá)及純化

首先，將合成的質(zhì)粒pGEX-6p-1-β1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21（DE3）中，然后從中選擇一個(gè)單一的菌落，將其放入具有氨芐抗性的LB溶液中，將溶液置于37℃的環(huán)境中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。當(dāng)檢測(cè)到該培養(yǎng)液的OD600值為0.6時(shí)，則向其中加入0.6 mmol·L-1的IPTG。然后將溶液置于160 r·min-1的環(huán)境中16 h，將溫度調(diào)節(jié)為16℃，然后將完成誘導(dǎo)的溶液置于離心機(jī)中，溫度4℃，轉(zhuǎn)速為5 000 g，離心10 min后將菌液沉淀用預(yù)冷的PBS洗后在4℃離心機(jī)內(nèi)5 000 g離心10 min，重復(fù)5次。對(duì)細(xì)菌溶液進(jìn)行在低溫狀態(tài)下超聲波破碎后（防止蛋白降解），通過SDS-PAGE電泳對(duì)細(xì)菌的全菌液、上清液及沉淀物對(duì)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。蛋白膠泡在0.1 mmol·L-1KCL預(yù)冷溶液中顯色2 min，使用手術(shù)刀片小心的切下凝膠中染為銀白色的目的條帶，銀白色凝膠用PBS洗3次，洗掉目的條帶上的KCL溶液，碾碎膠加入適量的PBS，在-80℃反復(fù)凍融3次以上（蛋白凍融次數(shù)越多，回收效率越高）。凍融后的膠及PBS在4℃離心機(jī)內(nèi)8 000 g離心10 min，最終得到純化的豬整合素β1重組蛋白，測(cè)定濃度用于后續(xù)的免疫實(shí)驗(yàn)兔及ELISA抗原包被（若蛋白濃度過低，我們可以使用PEG8 000進(jìn)行濃縮，獲得最合適的蛋白濃度），將純化的蛋白保存在-80℃冰箱。

1.4 豬整合素β1重組蛋白的鑒定

用純化的豬整合素β1重組蛋白SDS-PAGE電泳，230 mA電流在120 min內(nèi)通過濕轉(zhuǎn)電泳法，完成轉(zhuǎn)膜之后將其封閉2 h，然后用PBST溶液對(duì)其進(jìn)行清洗。將GST單克隆抗體1∶1 000作為一抗，將其置于4℃的環(huán)境中；將HRP-山羊抗鼠IgG 1∶10 000作為二抗，將其置于常溫中避光1 h，然后用PBST溶液對(duì)其進(jìn)行清洗。最后通過掃描成像系統(tǒng)查看結(jié)果。

1.5 豬整合素β1重組蛋白抗體的制備

首先將經(jīng)過純化的重組蛋白pGEX-6p-1-β1，用BCA法對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè)，按0.5 mg每只實(shí)驗(yàn)兔將純化后的蛋白與佐劑按體積比1∶1進(jìn)行混合，在低溫環(huán)境下使用旋渦振蕩器充分振蕩，乳化液體在清水中5 min內(nèi)不出現(xiàn)擴(kuò)散現(xiàn)象表明充分乳化。將乳化后的液體皮下多點(diǎn)注射2.0 kg左右的實(shí)驗(yàn)兔背部。蛋白和弗氏完全佐劑混合為首次免疫，蛋白和弗氏不完全佐劑混合為二、三次免疫。實(shí)驗(yàn)中各次免疫出現(xiàn)的時(shí)間相隔14 d左右。在開始實(shí)驗(yàn)后的第7 d從兔的耳部靜脈處收集血液，采集血清，將免疫前的兔子血清作為對(duì)照組使用。在第三次免疫8 d后處死實(shí)驗(yàn)兔取其全血后進(jìn)行血清分離。

1.6 豬整合素β1重組蛋白抗體效價(jià)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)中效價(jià)的檢測(cè)方法為間接ELISA法，首先用包被溶液對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行稀釋，稀釋后的溶液濃度為1μg·mL-1，然后將96孔板的每孔加入100μL稀釋后液體包被板子，在4℃的溫度過夜孵育（目的是特異抗原與固相載體結(jié)合用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)）。次日棄液，每孔使用300μL的PBST（0.01 mol·mL-1PBS，PH=7.4，0.05%Tween-20）進(jìn)行洗滌，室溫振蕩3次，每次5 min。棄液后用5%的脫脂乳37℃恒溫箱內(nèi)封閉2 h，每孔150μL。棄液用PBST每孔300μL，洗3次，每次5 min。以待檢陽性血清與未免疫實(shí)驗(yàn)兔的陰性血清為一抗，用PBST進(jìn)行稀釋，用方陣法確定一抗的最佳稀釋度。稀釋梯度按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400至1∶12 800。在每個(gè)孔內(nèi)加入100μL血清稀釋液，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)作用1 h。將溶液去除后置于PBST中清洗，然后輕拍ELISA板去除清洗液。然后將孔板的所有孔中都加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）溶液100μL，然后將孔板再次放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)作用1 h，將溶液去除后置于PBST環(huán)境中清洗，然后輕拍ELISA板去除清洗液。再次將孔板中加入TMB顯色液100μL，然后將其置于無光的室內(nèi)，在常溫下放置10 min，然后向其中加入100μL的2 mol·L-1H2SO4終止液，此時(shí)底物顯色變黃，顏色越深代表抗體量越高。5 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔在OD450nm的吸光度，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以便進(jìn)行后續(xù)分析。計(jì)算陽性與陰性血清的OD450值之比（P/N），當(dāng)P/N值小于1.5時(shí)血清為陰性，當(dāng)大于或等于1.5而小于2.1為可疑血清，當(dāng)大于或等于2.1時(shí)血清為陽性。所以在P/N值大于或等于2.1時(shí)的抗體血清最高的稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。

1.7 豬整合素β1多克隆抗體的特異性鑒定

選用含天然整合素β1蛋白的仔豬小腸組織作為樣品進(jìn)行Western blot方法分析。提取仔豬小腸組織總蛋白通過SDS-PAGE電泳將蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。5%的脫脂乳用PBST進(jìn)行稀釋后在37℃封閉2 h，PBST充分洗滌。取出三免后的實(shí)驗(yàn)兔多抗血清，將其加入到PBST溶液中稀釋成1∶1 000的比例，將此溶液作為一抗置于4℃的環(huán)境中過夜放置，用PBST洗滌后HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗置于常溫下放置1 h，用PBST溶液反復(fù)清洗3次。最后使用凝膠成像儀觀察結(jié)果，從而確認(rèn)豬整合素β1多克隆抗體和天然整合素β1之間是否會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬整合素β1重組蛋白表達(dá)及純化結(jié)果

首先需要對(duì)豬整合素β1胞外區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過CBS在線網(wǎng)站使用TMHMM-2.0工具，結(jié)果顯示豬整合素β1的胞外區(qū)為1～728位氨基酸（圖1）。尋找胞外區(qū)抗原性良好區(qū)域?yàn)楹罄m(xù)蛋白表達(dá)奠定基礎(chǔ)，使用DNAStar軟件分析出豬整合素β1的26～728位氨基酸具有良好的抗原性（圖2）?；诖竽c桿菌偏嗜性密碼子的基礎(chǔ)上對(duì)基因優(yōu)化后合成，把Bam HI酶切位點(diǎn)加到5'末端，把Xho I酶切位點(diǎn)加到3'末端，人工合成豬整合素β1核苷酸序列。將合成的基因與原核表達(dá)載體pGEX-6p-1連接起來，使用Bam HI和Xho I限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-β1雙酶切進(jìn)行分析研究，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在2 109 bp和4 984 bp上，兩個(gè)片段的大小和預(yù)測(cè)基本相同，檢測(cè)結(jié)果如下（圖3）所示。將保存完好的質(zhì)粒pGEX-6p-1-β1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21（DE3）中，加入0.6 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)，完成后將其置于超聲環(huán)境中破碎，然后用聚乙酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析。結(jié)果顯示，在102 ku左右發(fā)現(xiàn)目的蛋白成功表達(dá)，且以包涵體的狀態(tài)存在。因此為了獲得純化蛋白實(shí)驗(yàn)通過切膠純化的方法（圖4）。

圖1 豬整合素β1跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of transmembrane helices of porcine integrinβ1

圖2 豬整合素β1抗原區(qū)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of porcine integrinβ1 antigen region

圖3 pGEX-6p-1-β1合成質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of double digestion of pGEX-6p-1-β1 synthetic plasmid

圖4 豬整合素β1重組蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果Fig.4 Expression and purification results of porcine integrinβ1 recombinant protein

2.2 豬整合素β1的抗原性分析

實(shí)驗(yàn)中的抗原性分析的檢測(cè)方法為Western blot法，將經(jīng)過純化的豬整合素β1重組蛋白經(jīng)過Western blot分析后得出，pGEX-6p-1-β1重組蛋白它的原核表達(dá)載體pGEX-6p-1帶有GST標(biāo)簽，鼠源的GST一抗能夠特異性結(jié)合GST標(biāo)簽，說明純化蛋白是豬整合素β1的目的蛋白（圖5）。

圖5 純化豬整合素β1重組蛋白Western blot結(jié)果Fig.5 Western blot of purified porcine integrinβ1 protein

2.3 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)

使用間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)，檢測(cè)結(jié)果顯示，豬整合素β1多克隆抗體效價(jià)為1∶12 800。

2.4 豬整合素β1抗體檢測(cè)效果

從仔豬的小腸部位中取出膜蛋白，該蛋白中含有天然的整合素β1，利用Western blot法對(duì)其抗原性進(jìn)行分析，結(jié)果在130 ku左右有一條特異性條帶，與整合素β1蛋白大小相近，此結(jié)果說明制備的多克隆抗體能識(shí)別天然整合素β1蛋白（圖6）。

圖6 多抗與天然整合素β1蛋白反應(yīng)性鑒定結(jié)果Fig.6 Results of identification of reactivity of polyclonal antibody with natural integrinβ1 protein

3 討論

整合素有許多功能，如在癌癥發(fā)生、免疫反應(yīng)、血栓治療、炎癥、胚胎形成等方面都發(fā)揮重要作用，還可以作為受體在病毒與細(xì)胞的感染過程中發(fā)揮作用[22-23]。由于整合素廣泛分布于許多動(dòng)植物細(xì)胞膜的表面，病毒顆粒感染宿主細(xì)胞過程中會(huì)直接或間接與整合素接觸，因此在病毒感染過程中整合素可能具有重要參與作用。目前，整合素可作為多種病毒的感染受體或感染相關(guān)蛋白，在病毒研究領(lǐng)域備受關(guān)注。目前有報(bào)道稱，整合素可以作為人類皰疹病毒、艾博拉病毒、免疫缺陷病毒、腺病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒等多種病毒的受體或共受體[11-16]。口蹄疫病毒感染受體研究中已被報(bào)道的有整合素 β1、β3、β6、β8，其中整合素β6能夠增強(qiáng)病毒感染[24-26]。PEDV是一種冠狀結(jié)構(gòu)的病毒，自身帶有囊膜，當(dāng)PEDV進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，首先通過病毒表面的纖突糖蛋白和腸絨毛上的受體結(jié)合，二者通過膜融合的方式使病毒進(jìn)入[27]。PEDV的敏感細(xì)胞Vero中有17種膜蛋白與病毒受體相關(guān)，包括整合素β1[28]。而且PEDV病毒粒子表面的纖突糖蛋白能夠識(shí)別整合素的不同配體序列[29]。豬整合素 αvβ3能夠在Vero、IEC細(xì)胞上促進(jìn)PEDV感染[30]。豬整合素β1與β3都是整合素家族成員且同在于細(xì)胞表面，因此猜測(cè)在PEDV感染過程中豬整合素β1也可能發(fā)揮作用。為完成后續(xù)研究，試驗(yàn)構(gòu)建表達(dá)豬整合素β1的原核表達(dá)載體并制備多克隆血清用于PEDV入侵宿主細(xì)胞機(jī)制的驗(yàn)證。

制備抗體主要是選擇蛋白合適的抗原區(qū)，蛋白的親水性、抗原性、可及性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及疏水性等多種特性對(duì)抗原區(qū)域的選擇作為參考，其中蛋白的親水性與可及性對(duì)抗原表位的形成發(fā)揮重要的作用[31]。由于整合素β1胞外區(qū)的蛋白的主要作用是產(chǎn)生黏附，所以實(shí)驗(yàn)先對(duì)整合素β1的跨膜區(qū)域進(jìn)行了分析，然后對(duì)其分析出的胞外區(qū)進(jìn)行抗原性預(yù)測(cè)，對(duì)胞外區(qū)具有很好的抗原性區(qū)域人工合成。實(shí)驗(yàn)中選擇pGEX-6p-1原核表達(dá)載體，因?yàn)閜GEX-6p-1載體的GST標(biāo)簽不僅具有增加外源蛋白可溶性的作用，而且易于蛋白純化。在對(duì)豬整合素β1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，在分子質(zhì)量在102 ku時(shí)，出現(xiàn)了特異性條帶，這說明蛋白成功表達(dá)，但是重組蛋白的形式是包涵體的狀態(tài)。因此在制備多克隆抗體時(shí)，使用了KCL染色SDS-PAGA電泳切膠純化方法。通過切膠免疫法能實(shí)現(xiàn)蛋白的提取，而且提取出的蛋白不僅純度相對(duì)較高，完整性也相對(duì)較好。此外，通過此方法提取出的蛋白為包涵體蛋白，經(jīng)過蛋白純化后可以直接免疫兔。為了制備出特異性強(qiáng)和高效價(jià)的豬整合素β1多克隆抗體，以實(shí)驗(yàn)兔為研究對(duì)象，通過蛋白免疫法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，較核酸免疫效價(jià)更高，但是抗原持續(xù)發(fā)揮作用時(shí)間短，所以，試驗(yàn)采用重復(fù)加強(qiáng)免疫，兩周免疫1次，共免疫3次或得高效價(jià)血清[32]。免疫動(dòng)物過程中抗原中添加的弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑后改變其物理狀態(tài)，有利于增強(qiáng)抗原的免疫應(yīng)答[33]。試驗(yàn)制備的豬整合素β1多克隆抗體具有較高效價(jià)為1∶12 800，此多抗能夠通過Western blot方法特異性識(shí)別仔豬小腸上皮細(xì)胞中的整合素β1蛋白。試驗(yàn)所制備豬整合素β1多克隆抗體也可通過間接免疫熒光的抗原抗體反應(yīng)對(duì)細(xì)胞或組織中抗原的進(jìn)行定位，為后續(xù)整合素β1與病毒定位和作用研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

試驗(yàn)成功制備了特異性強(qiáng)和高效價(jià)的豬整合素β1多克隆抗體，該抗體的備制成功為后續(xù)豬整合素β1與豬病病毒感染等作用研究提供基礎(chǔ)。