miR-503、PKD1在非小細胞肺癌患者外周血中的表達及臨床意義

吳艷麗 熊艷 蘆爽 孫厚斌

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的組織學類型，腺癌和鱗癌是NSCLC最常見的兩種病理類型，近年來NSCLC發(fā)病率不斷增高，已成為全球范圍內(nèi)致死率最高的腫瘤[1]。肺癌因為在早期階段并無顯著的臨床特點和癥狀，也沒有特異性強的檢測手段，很多肺癌患者在確診時已處于發(fā)展階段，進而使治療效果和預后受到嚴重影響[2]。為了預防和控制可能的NSCLC發(fā)生，檢測NSCLC的生物標志物至關(guān)重要，因此要改善NSCLC的診斷準確性。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-503(microRNA-503，miR-503)在NSCLC和肝細胞癌中表達顯著下調(diào)，也可通過靶向原纖維蛋白-1促進糖尿病足潰瘍患者的傷口愈合[3-5]。蛋白激酶D(Protein kinase D，PKD)是一種新發(fā)現(xiàn)的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其中蛋白激酶D1(Protein kinase D1，PKD1)是PKD家族研究最深入的成員，在細胞增殖、凋亡、侵襲等一系列生物學行為中起重要調(diào)控作用[6]。Wei等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PKD1在NSCLC患者的癌組織中顯著上調(diào)，可能是miR-503的直接靶標。經(jīng)MirTarBase網(wǎng)站預測，miR-503與PKD1存在結(jié)合位點，因此本研究通過檢測NSCLC患者血清中miR-503、PKD1表達水平，分析兩者對NSCLC診斷的臨床意義，以期為NSCLC的臨床診斷提供一定參考。

資料與方法

一、一般資料

收集2016年1月～2018年1月在本院經(jīng)病理診斷并確診的NSCLC患者61例(試驗組)，另選取同期體檢人群61例作為對照組。兩組患者年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。根據(jù)國際肺癌研究協(xié)會第八版肺癌TNM分期標準，將患者分為I+Ⅱ期43例，Ⅲ期18例[8]。NSCLC患者納入標準：①有明確的病理診斷結(jié)果的NSCLC患者(符合《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范·第六分冊·原發(fā)性支氣管肺癌》[9])，首次治療或既往治療結(jié)束1個月以上；②具有可測量病灶；③患者有完整的臨床資料；④同意遵守醫(yī)囑并簽署知情同意書者。排除標準：①合并心、肝等嚴重疾病；②有系統(tǒng)性免疫缺陷癥的患者；③兒童、孕婦和精神病患者；患有膿毒癥、支氣管肺炎等炎癥性疾病。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。

表1 兩組一般資料比較

二、主要試劑和儀器

低溫高速離心機、Nano Drop 2000(美國Thermo Scientific公司)，熒光實時定量PCR儀(美國Applied biosygtems公司)，Trizol試劑(美國Invirotrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生物科技公司)，SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒(大連TaKaRa公司)，-80℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)，Milli-Q超凈水凈化系統(tǒng)(美國Millpore公司)，引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。

三、方法

1 樣本采集與保存

所有病理及對照組人員均于清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，靜置30 min，室溫3000 rpm/min，離心15 min，吸取上清液分別裝入EP管中，置于-80℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測對照組及試驗組血清中miR-503、PKD1 mRNA表達

按照Trizol法提取對照組及試驗組血清樣本中總RNA，分光光度計測總RNA純度及濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒說明書進行qRT-PCR反應，以U6、GAPDH基因為內(nèi)參，miR-503、PKD1、U6、GAPDH引物序列(見表2)。反應條件為：95℃，10 min；40 個PCR循環(huán)(95℃，10 s；60℃，60 s，72℃，15 s)。采用2-ΔΔCt方法計算NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA相對表達量。

表2 qRT-PCR引物序列

四、統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以平均數(shù)±標準差描述，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以[n(%)]描述，行卡方檢驗。采用Pearson法分析NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA表達的相關(guān)性；受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic，ROC)曲線評估血清中miR-503、PKD1 mRNA表達水平對NSCLC的診斷價值。當P<0.05時，代表差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA在對照組及試驗組中的表達

檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗組miR-503表達水平降低，PKD1 mRNA表達水平升高，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 miR-503、PKD1 mRNA在對照組及試驗組血清中的表達

二、NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

以miR-503、PKD1 mRNA表達水平平均值為界值，分為miR-503、PKD1 mRNA低表達組和高表達組。miR-503、PKD1 mRNA表達水平與年齡、性別、分化程度無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與組織學類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表4)。

表4 miR-503、PKD1 mRNA表達水平與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

三、miR-503 、PKD1 mRNA表達水平的相關(guān)性

Mirtarbase網(wǎng)站預測，miR-503與PKD1存在結(jié)合位點，Pearson法分析結(jié)果顯示，試驗組中miR-503 、PKD1 mRNA表達呈負相關(guān)(r=-0.597，P<0.05)(見圖1、2)。

圖1 miR-503與PKD1結(jié)合位點

圖2 miR-503 、PKD1表達水平的相關(guān)性

四、血清中miR-503、PKD1 mRNA表達水平對NSCLC的診斷價值

血清中miR-503、PKD1 mRNA聯(lián)合檢測診斷NSCLC的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.861，敏感度為82.0%、特異性為85.2%(見表5、圖3)。

表5 血清中miR-503、PKD1 mRNA表達水平對NSCLC的診斷價值

圖3 血清中miR-503、PKD1 mRNA診斷NSCLC的ROC曲線分析

討 論

肺癌在我國癌癥中發(fā)病率和死亡率均居于首位，每年肺癌發(fā)病人數(shù)約78.1萬，死亡人數(shù)約62.6萬[10]。肺癌的病理分型中NSCLC約占總數(shù)的85%，由于在早期缺乏明顯特異性癥狀，同時易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者在確診時已進入中晚期階段，治療效果及預后不佳[11]。近年來，隨著肺癌早期篩查技術(shù)的普及和治療方式的發(fā)展，截止到2015年，我國男性肺癌患者病死率下降了45%，女性肺癌患者病死率下降了19%[12]。對于早期肺癌患者，癌細胞尚未轉(zhuǎn)移，外科手術(shù)切除癌癥組織為最佳治療方式。對于肺癌分期預后較差的患者，需要采取輔助化療、靶向治療、免疫治療等提高生存率。因此，肺癌的早期篩查、診斷和治療對于提高患者的生存率、延長患者壽命十分重要。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-503與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其在甲狀旁腺癌和腎上腺皮質(zhì)癌中過表達[13-14]；在腎上腺癌中，表達上調(diào)與患者的總體生存期縮短有關(guān)[14]。PKD1基因位于人類染色體14q11位置，在人體內(nèi)腦、心臟、肺等多個器官中廣泛表達，同時其在維持心肌細胞功能和心血管系統(tǒng)健康及免疫調(diào)節(jié)方面起到關(guān)鍵作用[15]。Liu等[3]證實miR-503在NSCLC患者組織樣本中表達下調(diào)，且miR-503異常低表達與患者預后不良有關(guān)，是預后不良的獨立危險因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PKD1在多種腫瘤中表達異常，如在前列腺癌、乳腺癌胃癌和胃癌中顯著下調(diào)[16]，而過表達PKD1在胰腺癌、皮膚癌的發(fā)展中起重要作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗組血清中miR-503表達水平降低，PKD1 mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義。本研究通過miRtarbase網(wǎng)站預測，miR-503與PKD1存在結(jié)合位點。經(jīng)Pearson法分析，NSCLC患者血清miR-503 、PKD1 mRNA表達呈負相關(guān)，提示在NSCLC發(fā)展過程中，miR-503、PKD1 mRNA可能存在負反饋調(diào)節(jié)機制，而miR-503表達水平的降低和PKD1 mRNA表達水平的升高可能加劇了NSCLC的疾病進展。本研究結(jié)果顯示，miR-503、PKD1表達水平與年齡、性別、分化程度無關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義；與組織學類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義。提示二者表達水平受到疾病的進程影響，也暗示二者參與了NSCLC的發(fā)展過程中。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-503、PKD1診斷NSCLC均具有良好的敏感度及特異性，血清中miR-503、PKD1 mRNA聯(lián)合檢測診斷NSCLC的AUC為0.861，敏感度為82.0%、特異性為85.2%，兩者聯(lián)合診斷價值更高。提示miR-503、PKD1可能共同參與了NSCLC患者的疾病發(fā)生發(fā)展過程，兩者均具有較高的臨床價值，聯(lián)合檢測診斷價值更高。

綜上所述，miR-503 在NSCLC患者血清中低表達，PKD1高表達，二者呈負相關(guān)，均可能與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，聯(lián)合檢測對臨床診斷具有一定參考意義。本研究也存在研究樣本數(shù)量偏少，研究深度不夠的不足，miR-503、PKD1在NSCLC患者體內(nèi)的作用機制有待進一步研究。