M1型和M2型巨噬細(xì)胞及相關(guān)組織因子在結(jié)核性胸膜炎患者治療前后的變化及意義

朱錦琪 陳劍波 楊紅忠 高欣

結(jié)核性胸膜炎(Tuberculous pleurisy effusion, TP)是臨床上最常見的肺外結(jié)核類型，研究表明TP患者會(huì)發(fā)生胸膜粘連及肥厚，而后者可引起限制性肺功能下降，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。巨噬細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)中具主要功能執(zhí)行細(xì)胞，在TP發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用[2]。研究報(bào)道巨噬細(xì)胞在不同的環(huán)境下分化為具有不同功能的亞型，其中M1型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞免疫的作用，而M2型巨噬細(xì)胞主要負(fù)向調(diào)控免疫反應(yīng)[3,4]。但目前尚鮮有巨噬細(xì)胞分化與TP的相關(guān)報(bào)道，本研究旨在探究不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞及其相關(guān)組織因子在TP患者中的表達(dá)和治療對(duì)其的影響及意義,以期為臨床靶向調(diào)控M1/M2巨噬細(xì)胞分化的治療及藥物研發(fā)，提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

1 一般情況 選取自2018年01月至2018年12月在我院住院治療，診斷為結(jié)核性胸膜炎的患者38例，男性21例，女性17例，平均年齡(38.2±6.9)歲。另選取同期來我院體檢中心體檢的志愿者20 例作為健康對(duì)照組，其中男性13例，女性7例，平均年齡(35.6±4.7)歲。兩組受試者的性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究的全部受試者均簽署知情同意書。

2 入組標(biāo)準(zhǔn) (1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)指定的《臨床診療指南結(jié)核病分冊(cè)》中結(jié)核性胸膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)且診斷為 TP 的患者；(2)能取得胸腔積液進(jìn)行檢測(cè)者；(3)既往無結(jié)核病治療史；(4)同意入組的患者。

3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)合并 HIV 感染及胸腔細(xì)菌感染者；(2)孕婦及年齡<16歲或>80歲；(3)入院及出院1月后復(fù)查未取得胸腔積液者；(4)合并腫瘤、自身免疫性疾病、肝炎或其他系統(tǒng)性疾病的患者；(5)正在進(jìn)行抗凝或抗血小板治療的患者；(6)不能耐受抗TP治療者；(7)拒絕參加本研究的患者。

二、方法

1 主要試劑與儀器 組織因子測(cè)定的ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物公司；RPMI 1640與PBS緩沖液購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物公司；小鼠抗人F4/80-APC mAb、CD206-PE/Cy5.5 mAb、CD86-FITC mAb均購自美國Biolegend公司；淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購自美國Thermo公司；FACS Arial Ⅱ流式細(xì)胞儀購自美國BD Bioscience公司。

2 標(biāo)本采集 入選的TP患者在入院接受抗結(jié)核治療前及常規(guī)結(jié)核性胸膜炎治療1月后抽取外周血20 mL及胸腔積液10 mL；健康對(duì)照組抽取外周血20 mL。所有外周血均于晨起空腹抽取并用肝素進(jìn)行抗凝。

3 標(biāo)本檢測(cè) 所有受試者的外周血平均分為2份，一份用于檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中巨噬細(xì)胞M1、M2比例，另外一份用于檢測(cè)IL-10、 IL-12、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)的表達(dá)水平；胸腔積液同樣平均分為2份，分別進(jìn)行檢測(cè)胸腔積液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞(PFMC)中巨噬細(xì)胞M1、M2所占比例及IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1、腺苷脫氫酶(ADA)、乳酸脫氫酶(LDH)、蛋白的表達(dá)水平。

4 細(xì)胞因子及生化指標(biāo)的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay , ELISA)測(cè)定胸腔積液與外周血中IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1的含量；其他檢測(cè)如胸腔積液中ADA、 LDH、蛋白等均在本院檢驗(yàn)科進(jìn)行測(cè)定。

5 外周血與胸腔積液中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC/PFMC)的分離 采用Ficoll密度梯度離心法分離所有受試者外周血及TP患者胸腔積液中的PBMC/PFMC，方法簡(jiǎn)述如下：將收集血液標(biāo)本及TP患者的胸腔積液標(biāo)本置于離心機(jī)中，常溫下1 500 r/min離心10 min，取下層細(xì)胞沉淀與等體積的PBS混勻后緩慢勻速加至適量的Ficoll液面上，并使其形成界面。將上述得到的分層液體于室溫下在緩升緩降的離心機(jī)中2 320 r/min離心20 min, 使其分層，移液管小心吸出中間形成的“云霧層”細(xì)胞，并加入5倍體積的PBS，室溫下1 500 r/min離心10 min，底層沉淀即為分離所需的PBMC/PFMC，PBS洗滌細(xì)胞2次進(jìn)行純化，并置于細(xì)胞凍存液中于液氮中進(jìn)行保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞中M1與M2比例 常規(guī)復(fù)蘇PBMC/PFMC后，用含10% FBS的RPMI 1640于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)30 min后取出，并調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，取2mL至流式管中，800 r/min離心5 min，棄上清后，加入100 μl的PBS重懸細(xì)胞，依次加入F4/80-APC、CD206-PE/Cy5.5、CD86-FITC,于4 ℃避光孵育30 min后，加入2 mL PBS洗滌細(xì)胞，800 r/min離心10min ,棄上清，再加入0.2 mL PBS重懸細(xì)胞，0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)分析。其中M1巨噬細(xì)胞的特征性表面分子標(biāo)記物為F4/80+CD86+，M2細(xì)胞為F4/80+CD206+。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)在分析前均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊的兩獨(dú)立樣本的均數(shù)之間比較，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的兩獨(dú)立樣本的均數(shù)之間比較，采用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗(yàn)；同一組治療前后的計(jì)量資料分析，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的單因素方差分析；兩變量間的線性相關(guān)分析，若數(shù)據(jù)服從雙變量正態(tài)分布且方差齊，采用Pearson線性相關(guān)分析；若不服從上述條件，則采用Spearman相關(guān)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、FCM檢測(cè)外周血PBMC與胸腔積液PFMC中M1、M2巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組患者PBMC與PFMC中F4/80+CD86+M1巨噬細(xì)胞與F4/80+CD206+M2巨噬細(xì)胞所占比例，結(jié)果顯示在PBMC中，治療前TP組的M2型巨噬細(xì)胞(37.405±10.652)較對(duì)照組(12.1337±8.533)顯著升高(P<0.01)，而治療前TP組中的M1型巨噬細(xì)胞(8.407±3.189)較對(duì)照組(9.023±6.542)無明顯變化(P>0.05)；在治療前TP組PFMC中M2型巨噬細(xì)胞(68.594±30.177)所占比例較M1型巨噬細(xì)胞(22.436±16.329)明顯升高(P<0.01)(見圖1)。TP患者經(jīng)1個(gè)月規(guī)律抗TP治療后，F(xiàn)CM檢測(cè)外周血PBMC及胸腔積液PFMC中M1、M2巨噬細(xì)胞所占比例，結(jié)果顯示與TP組治療前相比，PBMC中M2型巨噬細(xì)胞(22.354±11.371)顯著下降(P<0.01)，而M1型巨噬細(xì)胞(10.063±4.855)明顯降低(P<0.05)；在PFMC中，TP組與治療前相比，M2型巨噬細(xì)胞(55.178±20.661)顯著下降(P<0.01)，而M1型巨噬細(xì)胞(11.304±5.722)亦明顯減少(P<0.05)(見圖2)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組患者M(jìn)1、M2巨噬細(xì)胞的比例

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TP患者抗TP治療后M1、M2巨噬細(xì)胞的比例

二、血清中與胸腔積液中各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的分析

ELISA檢測(cè)TP組與健康對(duì)照組外周血中IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1的水平，結(jié)果顯示與健康對(duì)照組相比，TP組治療前外周血中IL-10、PAI-1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，而t-PA卻明顯降低(P<0.01)，IL-12無明顯變化(P>0.05)；在治療前TP組中，胸腔積液中IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1的表達(dá)水平均較外周血中顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；TP組治療后，外周血中IL-10、PAI-1較治療前相比，表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，胸腔積液中，IL-10、PAI-1、ADA、LDH較治療前顯著降低(P<0.05)，而t-PA較治療前明顯升高(P<0.01)，其他檢測(cè)指標(biāo)均無明顯變化(P>0.05)(見表1)。

表1 外周血中與胸腔積液中各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的分析

三、TP患者M(jìn)1、M2型巨噬細(xì)胞與各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)之間的關(guān)系

治療前，TP患者外周血中：M1型巨噬細(xì)胞與IL-10、 IL-12、 t-PA、 PAI-1無明顯相關(guān)性(P>0.05)；M2型巨噬細(xì)胞與 IL-10、 PAI-1呈正相關(guān)(P<0.05)，與IL-12、 t-PA無明顯相關(guān)性(P>0.05)。在TP患者胸腔積液中：M1型巨噬細(xì)胞與IL-12呈正相關(guān)(P<0.05)，與IL-10、t-PA、 PAI-1、LDH、ADA、蛋白無明顯相關(guān)性(P>0.05)；M2型巨噬細(xì)胞與IL-10、PAI-1、LDH、ADA呈正相關(guān)(P<0.05)，與t-PA呈明顯負(fù)相關(guān)，與IL-12、蛋白無明顯相關(guān)性P>0.05)(見表2、3)。

表2 外周血中M1、M2型巨噬細(xì)胞與各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性

表3 胸腔積液中M1、M2型巨噬細(xì)胞與各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性

討 論

TP是最常見的肺外結(jié)核類型，常見的并發(fā)癥為胸膜黏連增厚，胸腔積液等，若病情遷延惡化將出胸廓塌陷、膿胸、支氣管胸膜瘺等嚴(yán)重并發(fā)癥，直接影響患者的生活質(zhì)量及預(yù)后[3, 5]。

巨噬細(xì)胞作為結(jié)核感染的第一道防線，其在結(jié)核分支桿菌的的刺激下可產(chǎn)生IL-1α，LI-12等一系列細(xì)胞因子以促進(jìn)巨噬細(xì)胞本身抗原遞呈功能的上調(diào)和T細(xì)胞的激活，而激活的T細(xì)胞能夠分泌IFN-γ、TNF等促炎因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化[6，7]。成熟活化的巨噬細(xì)胞具有M1、M2兩種功能形態(tài)，前者主要促進(jìn)炎癥反應(yīng)，募集、活化多種促炎因子，如IL-1、IL-12、TNF-α等，流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)CD86為其表面特征性表達(dá)蛋白，而M2型巨噬細(xì)胞主要緩解炎癥反應(yīng)，合成及分泌抗炎因子IL-10、TNF-β等以促進(jìn)組織修復(fù)與重塑，常見的M2型表面標(biāo)志有CD163、CD206等[4]。

近年來，有多數(shù)學(xué)者報(bào)道在結(jié)核病中出現(xiàn)巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象，如Huang等[8]報(bào)道在肺結(jié)核患者體內(nèi)，高表達(dá)的IL-37能夠通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化并促進(jìn)后者對(duì)抗炎因子IL-10、TGF-β、INF-γ的分泌從而促進(jìn)疾病的發(fā)生、發(fā)展。Bénard A等[9]在對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌可直接刺激小鼠體內(nèi)的B細(xì)胞使其通過分泌Ⅰ型IFN調(diào)節(jié)骨髓中的巨噬細(xì)胞向抑制炎癥反應(yīng)的M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行分化。在本研究中通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比健康人群與結(jié)核性胸膜炎患者的外周血發(fā)現(xiàn)，TP患者PBMC中M2型巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位且其表達(dá)率顯著高于健康人群，而M1型巨噬細(xì)胞在兩組人群中尚無發(fā)現(xiàn)明顯變化。在TP患者的PFMC中同樣證實(shí)，M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)率明顯高于M1型巨噬細(xì)胞。在經(jīng)過1個(gè)月的規(guī)律抗TP治療后，流式細(xì)胞術(shù)再次檢測(cè)TP患者PBMC與PFMC的M1、M2型巨噬細(xì)胞變化，結(jié)果顯示治療后TP患者的M1、M2細(xì)胞表達(dá)均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，其中以M2型巨噬細(xì)胞比例減少最為顯著。這提示在TP患者體內(nèi)同樣存在M1/M2表達(dá)失衡的現(xiàn)象，而抗結(jié)核治療可對(duì)其進(jìn)行部分改善。纖溶功能與胸膜的纖維化形成密切相關(guān)，纖溶活性的下降可導(dǎo)致纖維蛋白在臟層與壁層胸膜的沉積黏連[10]。組織型纖溶酶原激活物(t-PA)與纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)是機(jī)體中重要的一對(duì)纖溶因子，其通過在血液與胸腔內(nèi)形成t-PA/ PAI-1復(fù)合物使前者失活，降低血液中或組織內(nèi)的纖溶活性，減少纖維蛋白的溶解現(xiàn)象[11， 12]。而腺苷脫氫酶(ADA)與乳酸脫氫酶(LDH)作為胸腔積液檢測(cè)胸腔積液性質(zhì)具有重要的參考價(jià)值。有研究表明在結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，檢測(cè)ADA是診斷胸膜結(jié)核的首選篩查方法，且其對(duì)診斷TP的敏感性及特異度均可達(dá)90%以上[13，14]。有文獻(xiàn)報(bào)道胸腔積液中LDH≥1000 IU/L多提示胸膜炎癥反應(yīng)較重，故LDH也是反應(yīng)胸膜黏連增厚的重要指標(biāo)之一[14]。

為進(jìn)一步明確上述組織因子是否與TP患者體內(nèi)M1/M2極化現(xiàn)象具有相關(guān)性，我們又通過ELISA檢測(cè)外周血與胸腔積液中的組織因子IL-10、IL-12、t-PA、PAI-1與ADA、LDH、蛋白的表達(dá)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TP患者外周血中M2型巨噬細(xì)胞與IL-10、PAI-1呈正相關(guān)，在胸腔積液中M1型巨噬細(xì)胞與IL-12呈正相關(guān)，M2型巨噬細(xì)胞與IL-10、PAI-1、ADA、LDH呈正相關(guān)，與t-PA呈明顯負(fù)相關(guān)。且與健康人群相比，TP患者外周血中IL-10、PAI-1的表達(dá)顯著增加，而t-PA明顯降低，經(jīng)1個(gè)月的規(guī)律治療后，TP患者外周血中及胸腔積液中IL-10、PAI-1明顯降低，t-PA明顯升高，胸腔積液中的ADA、LDH、蛋白同樣較治療前明顯降低，這提示經(jīng)規(guī)律治療后TP患者外周血中及胸腔積液中的組織因子較前部分恢復(fù)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在結(jié)核性胸膜炎中存在M1/M2極化現(xiàn)象，其中以M2巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位，且外周血與胸腔積液中IL-10、PAI-1、t-PA與ADA、LDH水平與M2型巨噬細(xì)胞具有一定的相關(guān)性，而抗結(jié)核治療可明顯改善M1/M2表達(dá)失衡及組織因子過度表達(dá)的現(xiàn)象。然而，上述作用機(jī)制可能僅僅是一個(gè)方面，有關(guān)巨噬細(xì)胞在結(jié)核性胸膜炎中的其他作用，尚需進(jìn)一步研究探討。