慢性阻塞性肺疾病患者IL-6、IL-8、TNF-α水平與支氣管黏膜自噬的相關(guān)性分析

王萌萌 於海洋 孫雨晴 程朋朋 汪倩 管雯斌 韓鋒鋒

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Diseases，COPD，簡(jiǎn)稱(chēng)慢阻肺)是一種常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，全球40歲以上發(fā)病率高達(dá)9% ～10%[1]。慢阻肺因其高發(fā)病率、高致死率和高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的特點(diǎn)，現(xiàn)已成為嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。探究慢阻肺的發(fā)病機(jī)制，對(duì)研發(fā)其藥物靶向治療具有重要意義。研究表明慢阻肺是一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，特別是急性加重期，包括CRP、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α在內(nèi)的炎性介質(zhì)均會(huì)升高[3]。同時(shí)也有研究表明自噬與慢阻肺的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，我們的前期研究已發(fā)現(xiàn)慢阻肺患者肺組織自噬水平在輕、中度組增強(qiáng)，重度組減弱[4]。本文通過(guò)檢測(cè)慢阻肺患者血清和BALF中炎癥因子及支氣管黏膜組織中自噬相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)水平，分析其二者在慢阻肺疾病進(jìn)展中的作用。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

研究對(duì)象選自2016 年6月1日至 2019年10月1日期間收治于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸科的慢阻肺穩(wěn)定期患者以及同期健康體檢者。本研究經(jīng)過(guò)上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并通過(guò)受試對(duì)象的知情同意。實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為3組：慢阻肺患者分為A和B組，A組(輕度+中度組)(n=12)、B組(重度+極重度組)(n=8)，以及對(duì)照組(n=10)，組間患者的性別比例和病情嚴(yán)重程度等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中，慢阻肺組診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2017年慢性阻塞性肺疾病國(guó)際診治指南[5]，依照肺功能檢查評(píng)估氣流受限嚴(yán)重程度，慢阻肺患者肺功能FEV1/FVC均<70%，輕度FEV1≥80%預(yù)計(jì)值，中度50%≤FEV1<80%預(yù)計(jì)值，重度30%≤FEV1<50%預(yù)計(jì)值，極重度FEV1<30%預(yù)計(jì)值，將慢阻肺患者分為輕度、中度、重度、極重度(其中輕度n=6、中度n=6、重度n=7，極重度n=1)。排除已明確診斷以下疾病及禁忌癥的患者：支氣管炎，活動(dòng)性肺結(jié)核，間質(zhì)性肺疾病，肺栓塞，慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓，嚴(yán)重肝、腎功能不全，嚴(yán)重心血管疾病，神經(jīng)肌肉疾病，腦梗死或腦出血后遺癥，有支氣管鏡檢查禁忌癥。

二、實(shí)驗(yàn)材料

TNF-α、IL-6、IL-8試劑盒購(gòu)自Elabscience公司。Atg5、P62引物合成(上海生物工程有限公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[TakaRa]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3( microtubule associa-ted protein 1 light chain-3B，LC3B)抗體、P62抗體購(gòu)自Abcam，Beclin1抗體購(gòu)自CST。GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶山羊抗兔(二抗)、辣根過(guò)氧化物酶山羊抗小鼠(二抗)購(gòu)自碧云天。

三、試驗(yàn)方法

1 肺功能檢測(cè) 采用意大利科時(shí)邁肺功能儀(COSMED 公司產(chǎn))測(cè)定3組受試者的第一秒用力呼氣量占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1/預(yù)計(jì)值%)、肺活量占預(yù)計(jì)值百分比(FVC/預(yù)計(jì)值%)、FEV1/FVC(%)。

2 酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測(cè)血清、肺泡灌洗液中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α 于清晨空腹抽肘正中靜脈血5 mL，支氣管電子內(nèi)鏡系統(tǒng)BF290(OLYMPUS 公司產(chǎn))下收集肺泡灌洗液5 mL，2層無(wú)菌紗布過(guò)濾待離心，外周血及肺泡灌洗液均3 800 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清及肺泡灌洗液IL-6、IL-8、TNF-清，所有操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3 免疫組織化學(xué)染色 支氣管鏡下收集患者支氣管黏膜組織約15 mg，操作按SABC免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。烘片、脫水、3% H2O2滅活、抗原修復(fù)、5%牛血清清蛋白(BSA)封閉，30 min后孵兔抗人LC3B抗體4 ℃冰箱過(guò)夜，羊抗兔二抗室溫孵育30 min，加入試劑SABC室溫孵育20 min，DAB顯色試劑盒顯色。蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察、照相。

4 實(shí)時(shí)熒光定量real-time PCR檢測(cè)人肺組織中Atg5、P62的mRNA表達(dá) 支氣管鏡下收集患者支氣管黏膜組織約15 mg與1 mL Trizol相混合后放入組織勻漿器中充分研磨，RNA分離提取后，反向轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)；反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s 40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s ，15 s 1個(gè)循環(huán)，樣本目的基因的計(jì)算公式為2-ΔΔCt。以GAPDH為內(nèi)參照，人GAPDH上游引物CAGGAGGCATTGCTGATGA，下游引物GAAGGCTGGGGCTCATTT，人Atg5上游引物TGGACAGTTGCACACACTAGGA，下游引物TCAGATGTTCACTCAGCCACTG；人P62上游引物TGGCCATGTCCTACGTGAAG，下游AGCCATCGCAGATCACATTG。

5 Western blot測(cè)定支氣管黏膜自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin1、LC3B的表達(dá) 支氣管鏡下收集患者支氣管黏膜組織約15 mg與300 μl蛋白裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)混合后加入勻漿器中，充分研磨，轉(zhuǎn)移入1.5 mL EP管超聲粉碎，冰上裂解30 min，以14 000 r/min離心20 min后取上清，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度。12% SDS-PAGE凝膠80 V電泳120 min，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1 ∶1 000稀釋)孵育4 ℃過(guò)夜。一抗復(fù)溫30 min，二抗(1 ∶1 000稀釋)孵育40 min，發(fā)光劑顯影成像。結(jié)果用Image LabTM軟件進(jìn)行灰度值分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象臨床資料的一般性描述

A組、B組與對(duì)照組性別比例和病情嚴(yán)重程度等一般資料相比，性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A組、B組FEV1/預(yù)計(jì)值%明顯低于對(duì)照組(P<0.001)(見(jiàn)表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象臨床資料的一般性描述

二、人血清和肺泡灌洗液上清中IL-6、IL-8及TNF-α的表達(dá)

與對(duì)照組相比，血清炎癥因子A組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組中IL-6、IL-8及TNF-α表達(dá)明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-6的P<0.05，IL-8、TNF-α的P<0.01)。肺泡灌洗液上清A組IL-6表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),B組中IL-6、IL-8及TNF-α表達(dá)明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-6的P<0.05，IL-8的P<0.001、TNF-α的P<0.05)(見(jiàn)圖1、2)。

圖1 血清炎癥因子IL-6、IL-8及TNF-α的表達(dá)(與對(duì)照組比較，*P<0.05， **P<0.01)

圖2 肺泡灌洗液上清炎癥因子IL-6、IL-8及TNF-α的表達(dá)(與對(duì)照組比較，*P<0.05, ***P<0.001)

三、支氣管黏膜組織免疫組化LC3B染色

與對(duì)照組相比，A組、B組患者支氣管黏膜組織的LC3B蛋白表達(dá)量減少(見(jiàn)圖3)。

圖3 支氣管黏膜組織LC3B蛋白免疫組織化學(xué)(HE ×200)

四、自噬相關(guān)基因Atg5、P62的mRNA表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果分析顯示Atg5在A組、B組mRNA顯著低于對(duì)照組(其中A組、B組P<0.001)，P62在A組、B組mRNA顯著高于對(duì)照組(其中A組、B組P<0.001)(見(jiàn)圖4)。

圖4 支氣管黏膜組織Atg5、P62的 mRNA基因表達(dá)

五、自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達(dá)

Western blot分析結(jié)果顯示， Beclin1在A組、B組蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(其中A組P<0.001，B組P<0.001)。P62在A組、B組蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(其中A組P<0.001，B組P<0.001)。LC3B在A組、B組蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(其中A組P<0.01，B組P<0.001)(見(jiàn)圖5)。

圖5 支氣管黏膜組織Beclin1、P62、LC3B的蛋白表達(dá)

六、炎癥因子水平與自噬作用的相關(guān)性分析

與正常對(duì)照組對(duì)比，隨著疾病嚴(yán)重程度的進(jìn)展LC3B蛋白表達(dá)量與血清IL-8水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.001，P<0.01),與肺泡灌洗液IL-8水平呈負(fù)相關(guān)(r=0.022，P<0.01),與血清、肺泡灌洗液IL-6、TNF-α水平無(wú)相關(guān)性(見(jiàn)表2、3)。

表2 血清炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-癥與LC3B蛋白表達(dá)量的相關(guān)性分析

表3 肺泡灌洗液炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α與LC3B蛋白表達(dá)量的相關(guān)性分析

討 論

慢阻肺患者炎癥的發(fā)生及發(fā)展與多種炎癥細(xì)胞活化及炎癥因子和介質(zhì)的釋放有關(guān)，氣道和肺部對(duì)有毒顆粒及氣體的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)是慢阻肺最主要的發(fā)病機(jī)制[5]。慢阻肺的慢性炎癥主要累及氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管，其中中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞參與慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展，這些細(xì)胞激活后釋放包括IL-6、IL-8、TNF-α在內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)[6]。IL-6是一種具有多種生物活性的趨化因子，因其具有激活和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞等生理特性，可以通過(guò)促進(jìn)B細(xì)胞的成熟，分泌IgG、IgE、IgA等細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。有研究表明慢阻肺患者血清IL-6和肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平顯著升高[7]。IL-8是一種多細(xì)胞源性的炎癥因子，具有多種生物效能，中性粒細(xì)胞與IL-8接觸后可發(fā)生形態(tài)變化，胞內(nèi)Ca+濃度升高脫顆粒，外周血組胺釋放增加引發(fā)炎癥反應(yīng)參與調(diào)節(jié)疾病的關(guān)鍵病理改變，此外IL-8對(duì)淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞也有一定作用，在慢阻肺疾病病理中IL-8可誘導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑[8]。TNF-α可以激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，以增加其細(xì)胞毒性作用，釋放更多IL-6、IL-8等細(xì)胞炎性因子，進(jìn)而加快炎癥反應(yīng)進(jìn)程[9-10]。本研究結(jié)果顯示慢阻肺患者血清IL-6、IL-8、TNF-α水平高于對(duì)照組，提示在慢阻肺患者的肺組織和氣道中存在炎癥反應(yīng)和氣道重塑，這為臨床預(yù)測(cè)慢阻肺患者疾病嚴(yán)重程度提供了理論依據(jù)。

細(xì)胞自噬作為一種新的細(xì)胞程序性死亡方式，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)的一種重要保護(hù)機(jī)制，是通過(guò)溶酶體介導(dǎo)的降解細(xì)胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器的代謝及更新過(guò)程[11-12]。自噬參與慢阻肺疾病的氣道重塑、肺氣腫和血管重塑等病理過(guò)程，隨著疾病的不斷進(jìn)展，自噬保護(hù)作用逐漸減弱[13]。氣道重塑是慢阻肺發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要特征，病理表現(xiàn)為纖毛減少、缺失和運(yùn)動(dòng)障礙，杯狀細(xì)胞增多，支氣管黏膜假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮鱗化，纖維結(jié)締組織等增生并伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；隨著疾病的進(jìn)展，后期還可出現(xiàn)細(xì)小支氣管管壁膠原化，終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端異常擴(kuò)張進(jìn)而導(dǎo)致肺氣腫[14]。慢阻肺早期可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、管壁增厚，隨著疾病不斷進(jìn)展血管平滑肌增厚、膠原纖維增多和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)自噬與血管重塑亦關(guān)系密切[15]。最新研究表明細(xì)胞自噬與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，固有免疫系統(tǒng)利用胚系基因編碼的模式識(shí)別受體T0LL樣受體(toll-like receptors，TLR)、NOD樣受體(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR)的激活能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，而細(xì)胞自噬對(duì)炎癥反應(yīng)又有精細(xì)調(diào)控作用，以避免過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)有機(jī)體的損害與刺激[16-17]。同時(shí)細(xì)胞自噬與抗感染免疫密切相關(guān)，而細(xì)胞自噬的缺損是誘發(fā)炎癥反應(yīng)和炎癥性疾病的一個(gè)重要因素，細(xì)胞自噬能通過(guò)促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除而弱化炎癥反應(yīng)[18-21]。本研究結(jié)果顯示輕度+中度組、重度+極重度組，較對(duì)照組自噬作用顯著減弱，且有遞減趨勢(shì)，提示在慢阻肺疾病的進(jìn)展中隨著疾病的嚴(yán)重程度不斷加重，自噬的保護(hù)作用逐漸降低，這為我們臨床上減緩慢阻肺疾病進(jìn)展和改善預(yù)后提供了新思路。

本研究以慢阻肺患者(輕度+中度組、重度+極重度組)與非慢阻肺體檢者為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，與對(duì)照組相比，輕度+中度組、重度+極重度組血清、肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α顯著升高，提示血清、肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α水平與慢阻肺患者嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可能參與了慢阻肺疾病的發(fā)展過(guò)程，并且IL-6、IL-8、TNF-α水平升高表明炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，可能對(duì)慢阻肺患者的生存質(zhì)量造成負(fù)面影響和作用。因此，檢測(cè)患者血清、肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α水平對(duì)慢阻肺嚴(yán)重程度的臨床診療、預(yù)后評(píng)估都有一定的指導(dǎo)意義。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著慢阻肺患者疾病嚴(yán)重程度不斷加重，與對(duì)照組相比，輕度+中度組、重度+極重度組慢阻肺患者支氣管黏膜Beclin1、LC3B Ⅱ的蛋白表達(dá)量在慢阻肺輕度+中度組、重度+極重度組蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，P62的蛋白表達(dá)量在慢阻肺輕度+中度組、重度+極重度組蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組。Atg5的mRNA基因表達(dá)量在慢阻肺輕度+中度組、重度+極重度組顯著低于對(duì)照組，P62的mRNA基因表達(dá)量在慢阻肺輕度+中度組、重度+極重度組顯著高于對(duì)照組。結(jié)果提示輕度+中度組、重度+極重度組自噬作用顯著減弱，不難推斷在慢阻肺疾病演變過(guò)程中，自噬的保護(hù)作用逐漸降低，并參與了慢阻肺疾病的發(fā)展過(guò)程，患者支氣管黏膜組織降解胞質(zhì)內(nèi)受損的結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器的能力逐漸減弱，細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下代謝產(chǎn)生游離脂肪酸、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要的能量逐漸減少，從而進(jìn)一步加重病情。自噬基因參與凋亡通路，當(dāng)表達(dá)降低，凋亡基因可表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，肺功能逐漸降低，導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度逐漸加重。更重要的是，支氣管黏膜自噬作用與血清以及肺泡灌洗液中IL-8水平呈負(fù)相關(guān)，提示IL-8可能與自噬作用的調(diào)控有關(guān)，兩者之間的相互作用可能在慢阻肺疾病的進(jìn)程中，也扮演了不可忽視的角色。

隨著慢阻肺疾病嚴(yán)重程度逐漸加重，炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，炎癥因子水平的升高可能與自噬功能受損有關(guān)，但目前具體機(jī)制尚未完全明確，有待我們進(jìn)一步去探明。因此了解慢阻肺疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制對(duì)于正確評(píng)價(jià)慢阻肺的疾病狀態(tài)，尋找與疾病急性加重發(fā)作頻率、進(jìn)展、預(yù)后的相關(guān)指標(biāo)及臨床診治具有重要意義。