大穗看麥娘與日本看麥娘的DNA條形碼鑒定

蘇杰天 姜翠蘭 黃兆峰 馬玉婷 孟帥帥 宋斌 魏守輝 黃紅娟

摘要 ：大穗看麥娘是我國麥田新發(fā)生的惡性雜草，與日本看麥娘苗期形態(tài)相近，導致難以識別和有效監(jiān)測。本研究利用4個DNA 條形碼候選序列（rbcL、matK、trnH-psbA和ITS2）對13份大穗看麥娘和10份日本看麥娘葉片材料進行分子鑒定，采用Vector NTI分析擴增的DNA序列峰圖質量并比對堿基差異，通過MEGA 6.0軟件中的K2P模型計算樣本種內和種間的雙參數遺傳距離，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明，4個DNA 條形碼序列中僅matK擴增測序結果不理想。日本看麥娘在4種DNA條形碼序列中不存在種內差異，大穗看麥娘在rbcL、matK和ITS2序列中無種內差異，僅在trnH-psbA序列中存在7個差異位點。大穗看麥娘和日本看麥娘種間各DNA條形碼序列均有差異，trnH-psbA、rbcL、matK和ITS2序列存在的差異位點數分別為6、3、14和28。ITS2的種間平均遺傳距離大于rbcL，且具有特異性，適宜用于大穗看麥娘和日本看麥娘的準確鑒定。

關鍵詞 ：雜草生物學; 種類鑒定; 大穗看麥娘; 日本看麥娘; DNA條形碼

中圖分類號：

S 451.221， Q 781

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020096

Identification of Alopecurus myosuroides and A.japonicus by DNA barcode

SU Jietian1， JIANG Cuilan1， HUANG Zhaofeng1， MA Yuting2， MENG Shuaishuai1，

SONG Bin3， WEI Shouhui1*， HUANG Hongjuan1*

（1. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China;

2. Shifang Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Sichuan Province， Deyang 618400， China;

3. Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300192， China）

Abstract

Alopecurus myosuroides is a new emerging worst weed in wheat fields and has similar seedling appearance to A.japonicus. Screening DNA barcode for molecular identification of A.myosuroides and Ajaponicus is crucial for effective weed identification and monitoring. To distinguish the A.myosuroides and Ajaponicus， four DNA barcode fragments， rbcL， matK， trnH-psbA and ITS2 were used for molecular identification of 13 A.myosuroides and 10 A.japonicus samples. The quality of sequence peak map was observed and base differences were compared by Vector NTI software. The two-parameter genetic distance （K2P） was calculated by MEGA 6.0 software， and the phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining （NJ）. The results showed that among the four DNA barcodes， only matK amplification sequencing was found to be unsatisfactory. There were seven locus differences in A.myosuroides for trnH-psbA， but no intraspecific difference for rbcL， matK and ITS2 in A.myosuroides and for all the barcoding sequences in A.japonicas. There were interspecific locus differences between A.myosuroides and A.japonicus， the numbers of different locus for trnH-psbA， rbcL， matK and ITS2 were 6， 3， 14 and 28， respectively. The average genetic distance of ITS2 was larger than that of rbcL， which also had specificity. ITS2 was suitable for accurate identification of Amyosuroides and A.japonicus.

Key words

weed biology; species identification; Alopecurus myosuroides; Alopecurus japonicus; DNA barcode

看麥娘屬Alopecurus L.植物屬于禾本科Gramineae一年生或多年生草本植物。全球有40～50種，主要分布在北半球溫帶、寒帶以及南美洲部分地區(qū)，有8種分布于我國[12]，其中日本看麥娘A.japonicus Steud.和大穗看麥娘A.myosuroides Huds.是我國麥田惡性雜草。這些雜草與小麥苗競爭生長資源和空間，降低小麥的抗逆能力，影響小麥的產量和品質[3]。大穗看麥娘現在在我國冬小麥種植區(qū)呈快速蔓延的趨勢，在山東、河南和河北的一些冬小麥田成為惡性雜草[4]，目前我們在天津、河北、安徽和陜西等?。ㄊ校┑柠溙镎{查中均發(fā)現其高密度發(fā)生危害，發(fā)生面積逐漸增加，危害也有加重趨勢。日本看麥娘在我國分布較廣，主要危害稻茬小麥和油菜等夏熟作物。由于除草劑的長期單一使用，日本看麥娘和大穗看麥娘對ALS和ACCase抑制劑都有抗藥性發(fā)生的報道，大穗看麥娘作為我國新入侵的惡性雜草，對其抗藥性研究國外報道較多，國內還缺乏相關的系統(tǒng)報道[513]。因此需要提高對大穗看麥娘的警惕性，及早識別和采取有效措施進行防控，避免大穗看麥娘的蔓延并減少其抗藥性的發(fā)生。兩種雜草幼苗期形態(tài)十分相似，通過形態(tài)難以進行識別，因此，找到有效且準確鑒別大穗看麥娘和日本看麥娘的方法對于其傳播擴散的控制以及除草劑的合理使用至關重要。

DNA條形碼（DNA barcode）是生物基因組中能夠代表該物種，有足夠變異且易擴增的標準化的DNA序列。DNA條形碼技術（DNA barcoding）是利用標準的基因片段對物種進行快速鑒定的技術。2003年加拿大科學家Hebert首次提出線粒體基因細胞色素C氧化酶 （cytochrome oxidase Ⅰ，COⅠ）可作為識別動物的手段，建立了識別鱗翅目昆蟲的COⅠ模型并得到驗證[14]。之后DNA條形碼被引入植物學中[15]，現在已經成功用于生物物種分類和鑒定[1618]、生態(tài)學調查和生物多樣性評估[1921]等研究領域。DNA條形碼可利用生物殘跡來鑒定形態(tài)學無法鑒定的已知或未知物種。在植物鑒定中，對于一些植物種屬內形態(tài)變異復雜、性狀受環(huán)境影響大、表型鑒定困難的植物，DNA條形碼因具有鑒定快速和準確的優(yōu)勢，得到了廣泛的應用。陳小露等[22]用ITS2（internal transcribed spacer 2，核基因核糖體第二內轉錄間隔區(qū)）鑒定61份龍葵Solanum nigrum L.及其近緣種樣品，結果表明ITS2能夠準確鑒定龍葵及其近緣種。焦麗娟等[23]選用rbcL（葉綠體1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基編碼基因rubisco large subunit）、matK（tRNA成熟酶編碼基因maturase K）、trnH-psbA（葉綠體基因間隔區(qū)序列）和ITS2對中國秋海棠屬Begonia L.26個種136個個體進行了分析，由于ITS2種內和種間變異大，鑒定率高，被用作秋海棠屬DNA條形碼鑒定的候選片段。烏吉斯古楞[24]選用委陵菜屬Potentilla L.中22個種的42個居群材料進行了DNA條形碼篩選，并進行NJ進化樹和ML進化樹分析，發(fā)現單獨片段的matK的ML聚類最理想，組合片段rbcL+matK+trnH-psbA的鑒定效果最好，但組合片段也不能將委陵菜屬植物完全分開，其中星毛委陵菜P.acaulis L.存在區(qū)分難度。本研究利用DNA條形碼技術基于成熟的DNA序列片段rbcL、matK、trnH-psbA以及ITS2進行鑒定篩選，獲得最優(yōu)鑒定序列，設法僅使用1對引物就能成功區(qū)分日本看麥娘和大穗看麥娘，實現對兩種看麥娘樣品的快速、準確鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和試劑

TissueLyser Ⅱ樣品破碎儀（北京天根生化科技有限公司），Nanodrop One超微量分光光度計（基因有限公司），T100Tm PCR擴增儀（Bio-Rad公司），ML204電子天平（Mettle-Toledo），1-14離心機（Sigma），JY600C瓊脂糖凝膠電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司），Tanon-3500凝膠圖像分析系統(tǒng)（北京原平皓生物技術有限公司）。

新型植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），瓊脂糖（Biowest Agarose），Gel Red核酸染色劑（Biotium），2×TSINGKE Master Mix、DL 2000 Marker、10×Loading Buffer（北京擎科生物技術有限公司）。

1.2 試驗樣品和培養(yǎng)

DNA條形碼材料：種子樣品采集于2017年和2018年，采自 5省13地的小麥田。經成株物種特征比對，鑒定其中有10份日本看麥娘種子和13份大穗看麥娘種子（表1）。特異性驗證材料：選用15種麥田禾本科雜草作為特異性驗證材料，種子樣品采集于2016年和2017年，采自7?。ㄊ校?0地的小麥田（表2）。按照1∶1∶1的比例混合普通壤土、花卉土（北京豐瑞佳業(yè)科技有限公司）和蛭石，選擇顆粒飽滿的種子樣品播種于盆（8.5 cm×8.5 cm×9.5 cm）裝土壤中，每盆按照五點法種植，每份樣品種2盆，確保其有足夠溫濕度條件，待長至2～3個葉片時取樣。

1.3 DNA提取和檢測

取2 mL圓底離心管，每管加入2枚直徑為3 mm的無菌鋼珠，每份選取100 mg的葉片樣品并剪成1 cm小段裝入對應編號的離心管，于-80℃冰柜冷凍8 h，取出后使用樣品破碎儀將樣品破碎至粉狀，采用北京天根新型植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，置于-20℃冰箱保存。采用超微量分光光度計檢測供試樣品DNA濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA純度檢測。

1.4 PCR擴增和測序

PCR反應體系（30 μL）：基因組DNA 1 μL、上下游引物各1 μL（各片段引物信息見表3）[25]、12 μL ddH2O和15 μL 2×TSINGKE Master Mix，離心10 s，進行PCR反應。擴增參數：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，最適退火溫度30 s，72℃延伸30～50 s，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠進行檢測并用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結果。選擇條帶清晰、單一的PCR產物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行雙向測序。

1.5 數據分析

利用Vector NTI軟件檢測基因組DNA序列峰圖質量，檢查和校對堿基，對基因組DNA序列進行剪切拼接。通過MEGA 6.0軟件[26]，計算樣本種內和種間的雙參數遺傳距離（Kimura 2-parameter，K2P），采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹[27]，基于K2P模型及自舉檢驗法（bootstrap method）檢驗各分支的置信值，測定1 000次循環(huán)[28]。

2 結果與分析

2.1 樣品PCR檢測結果

所有樣品的DNA濃度范圍在41.1～232.3 ng/μL，根據檢測結果，用ddH2O將DNA稀釋至工作濃度（30～50 ng/μL），其中rbcL、trnH-psbA和ITS2 DNA條形碼PCR的擴增效率均達到100%，matK擴增效率為85%。

2.2 大穗看麥娘與日本看麥娘DNA條形碼的序列特征

擴增得到大穗看麥娘和日本看麥娘的rbcL序列片段長度為553 bp（比對長度相同），核苷酸差異數3，種內平均遺傳距離0，種間平均遺傳距離0.005 4。大穗看麥娘和日本看麥娘的ITS2片段長度分別為444 bp和446 bp，比對后長度447 bp，核苷酸差異數28，種內平均遺傳距離0，種間平均遺傳距離0.056 6。大穗看麥娘和日本看麥娘的matK片段長度為898 bp（比對長度相同），核苷酸差異數14，種內平均遺傳距離0，種間平均遺傳距離0.015 8，但日本看麥娘種群的matK序列經多次PCR擴增，通常無條帶或出現poly結構，測序比對結果不理想。大穗看麥娘和日本看麥娘的trnH-psbA序列片段長度為620 bp（比對長度相同），核苷酸差異數13，種內平均遺傳距離0.011 4，種間平均遺傳距離0.015 5，大穗看麥娘在該序列中存在種內差異，存在鑒定復雜問題。

序列分析結果表明，各DNA條形碼序列差異位點數由大到小依次為ITS2、matK、trnH-psbA和rbcL，GC含量由大到小依次為ITS2、rbcL、trnH-psbA和matK。rbcL、matK和ITS2種內平均遺傳距離均為0，但由于matK的PCR擴增測序結果不理想，trnH-psbA序列中存在種內差異，因此不采用，所以僅rbcL和ITS2可用于鑒別日本看麥娘和大穗看麥娘。

2.3 大穗看麥娘與日本看麥娘DNA條形碼的差異位點

大穗看麥娘與日本看麥娘在trnH-psbA上存在6個差異位點，在matK上存在14個差異位點，但不能滿足鑒別要求。大穗看麥娘與日本看麥娘在rbcL序列中存在3個差異位點，分別是52位T/C、136位A/G、及313位T/G差異。大穗看麥娘與日本看麥娘在ITS2序列中存在28個差異位點，分別是55位T/C、103106位G---/ATAC、114115位TA/CG、120位C/G、123位A/G、139位T/C、149150位TA/GC、154位G/A、170位T/A、184位T/G、188位T/C、240位A/T、244位A/G、247位T/C、255位G/A、259260位AA/GT、263位A/G、267269位TTG/CA-、284位A/C及289位C/T差異（圖1）。

2.4 候選DNA條形碼的特異性驗證

選取13種農田常見的禾本科雜草并隨機挑選大穗看麥娘（DS10）和日本看麥娘（RB3）樣本各一份（表2），對rbcL和ITS2進行特異性驗證。rbcL特異性驗證中，經序列比對，只有日本看麥娘在313位堿基為G，不同于其他14份供試材料，但大穗看麥娘在該序列中不存在特異堿基，因此rbcL不具有特異性，不能用于鑒別大穗看麥娘和日本看麥娘。ITS2特異性驗證中，大穗看麥娘與日本看麥娘在103-106位存在G---/ATAC堿基差異，均不同于其他供試材料，同時大穗看麥娘在115、123、150位存在特異堿基。證明ITS2在供試材料中存在特異性，可用于鑒別大穗看麥娘和日本看麥娘。

通過MEGA 6.0軟件，計算ITS2序列下特異性驗證材料中種間的雙參數遺傳距離。大穗看麥娘與日本看麥娘之間的遺傳距離為0.062，大穗看麥娘與其他13份材料的遺傳距離為0.062～0.317，日本看麥娘與其他13份材料的遺傳距離為0.030～0.307。用鄰接法構建ITS2序列下特異性驗證材料的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），基于K2P距離模型及自舉檢驗法檢驗各分支的置信值，測定1 000次循環(huán)。大穗看麥娘和日本看麥娘與用于特異性試驗的其他13份材料均存在差異，麥田雜草節(jié)節(jié)麥Aegilops tauschii Coss.、圓柱山羊草A.cylindrica Host.、菵草Beckmannia syzigachne （Steud.） Fernald、日本看麥娘、鬼蠟燭Phleum paniculatum Huds、大穗看麥娘和硬草Sclerochloa dura （L.） Beauv.聚為一個群，其他類群與本類群的親緣關系較遠。結果表明ITS2能將大穗看麥娘與日本看麥娘分開，并且與其他禾本科雜草也存在明顯差異，具有很強的特異性。

3 討論

DNA條形碼的通用性方面，本研究擴增的DNA序列區(qū)段選用國際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組（CBOL Plant Working Group）推薦的應用較為廣泛的rbcL、matK、trnH-psbA和ITS2[2930]，這4種DNA區(qū)段是陸地植物通用的DNA條形碼。matK擴增及測序成功率為85%，且經多次PCR擴增測序結果不理想，不適用于鑒別日本看麥娘和大穗看麥娘，rbcL、trnH-psbA和ITS2的PCR擴增及測序成功率均為100%。

物種鑒定正確性方面，ITS2在大穗看麥娘和日本看麥娘種間的差異位點數較其他DNA條形碼多，并且不存在種內差異，具有很好的區(qū)分性。相比之下trnH-psbA存在種內差異，不具有很好的區(qū)分性。特異性驗證中，大穗看麥娘和日本看麥娘的ITS2序列與供試的其他13種禾本科雜草均存在特異堿基差異，證明ITS2序列具有很好的特異性，而rbcL序列中只有日本看麥娘具有特異堿基，不能對大穗看麥娘進行鑒定。

綜上所述，ITS2可準確區(qū)分大穗看麥娘和日本看麥娘，可對未知的大穗看麥娘和日本看麥娘樣本進行快速鑒定，大大提高了鑒定效率，也提高了檢測的速度和準確性。同時ITS2存在很強的特異性，對于發(fā)現新物種和控制外來入侵也具有重要的價值[31]。本研究的特異性驗證材料中沒有涉及其他看麥娘屬雜草，對于其特異性驗證還有待進一步探究。因此，在今后的研究中，應擴大 DNA 條形碼技術在看麥娘屬植物中的應用，尋找出適合看麥娘屬不同種的DNA條形碼序列，為實現看麥娘屬植物的快速鑒定奠定基礎。

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（責任編輯：田 喆）