吳海霞 袁夢蕾 江娜 馬桂珍 孫漫紅 李世東

摘要 ：粉紅螺旋聚孢霉Clonostachys rosea是一種重要的植物病原生防真菌。本研究測定了不同地理來源的42株粉紅螺旋聚孢霉菌株對核盤菌Sclerotinia sclerotiorum菌核的寄生能力，以及菌株幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性，同時測定了不同菌株對番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的拮抗作用以及對番茄果實灰霉病的防治效果。結果表明，不同來源的粉紅螺旋聚孢霉菌株對核盤菌菌核均有一定的寄生能力，45.2%的菌株寄生能力達到4級，β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶活性與其寄生能力呈極顯著正相關。研究發(fā)現(xiàn)，粉紅螺旋聚孢霉菌株對番茄灰霉病菌有一定的拮抗作用，抑制率最高可達78.4%;HN-56、STG-21-1、GS6-1等菌株對離體番茄果實灰霉病的防效達到75%以上，顯示出良好的生防潛力。本研究為豐富植物真菌病害生防資源和高效粉紅螺旋聚孢霉生防制劑的研發(fā)奠定了基礎。

關鍵詞 ：粉紅螺旋聚孢霉; 菌寄生; 細胞壁降解酶; 核盤菌; 番茄灰霉病

中圖分類號：

S 432.44

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020120

Screening and evaluation of highly efficient biocontrol

strains of Clonostachys rosea

WU Haixia1，2， YUAN Menglei2， JIANG Na2， MA Guizhen1*， SUN Manhong2*， LI Shidong2

（1. School of Marine Science and Technology， Jiangsu Ocean University， Lianyungang 222005， China;

2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Clonostachys rosea is an important biocontrol fungus of plant diseases. In this study， 42 C.rosea strains derived from different areas were chosen and their mycoparasitic ability against Sclerotinia sclerotiorum sclerotia， enzyme activities of chitinase and β-1，3-glucanase and control effects on tomato gray mold caused by Botrytis cinerea were investigated. The results indicated that all the isolates tested could parasitize the sclerotia， in which 45.2% reached the highest level of grade four. The enzyme activities of chitinase and β-1，3-glucanase had significant positive correlations with fungal mycoparasitic ability. The maximum of inhibition rates of C.rosea against B.cinerea was 78.4%， and the control efficacies of strain HN-56， STG-21-1 and GS6-1 against gray mold of tomato fruits in vitro achieved more than 75%. This study provides new resources of biocontrol agents against plant fungal diseases and lays a foundation for the development of biocontrol agents of C.rosea.

Key words

Clonostachys rosea; mycoparasitism; cell wall degrading enzyme; Sclerotinia sclerotiorum; Botrytis cinerea

我國是一個農業(yè)生產大國，長期以來植物病害，尤其是真菌病害嚴重制約了農作物的安全和可持續(xù)生產[12]。如核盤菌Sclerotinia sclerotiorum引起的菌核病，其產生的菌核可在土壤中存活多年，條件適宜時萌發(fā)侵染植物，造成農作物產量和品質的下降[36];由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的灰霉病是番茄生產中的毀滅性病害之一，可侵染果實、花、葉和莖等部位，嚴重時番茄減產60%以上，在儲運過程中也會造成果實大量腐爛，帶來巨大損失[78]。對植物真菌病害的防治，可采取栽種抗病品種、農業(yè)防治、化學防治和生物防治等多種手段[9]，但在實際生產中仍以化學防治為主。長期大量使用化學農藥帶來的環(huán)境污染、農藥殘留、食品安全等問題日益嚴重，利用生防微生物及其代謝產物抑制病害的發(fā)生和傳播越來越受到人們的關注[10]。

拮抗菌的應用是生物防治的一個重要方面。方翔等[11]篩選出對桑葚菌核病有明顯拮抗作用的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌Bacillus methylotrophicus，邵勝楠等[12]從新疆高寒地區(qū)分離到1株高效卡那霉素鏈霉菌Streptomyces kanamyceticus可有效抑制番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌，牛貞福等[13]利用綠色木霉Trichoderma viride防治番茄灰霉病，田間防效達到60%以上。盡管一些生防菌已在田間得到應用，但在實際生產中往往會受到土壤環(huán)境等多方面的影響，導致防治效果不佳或不穩(wěn)定。因此，迫切需要開展各類高效生防新菌株的篩選評價，以提高生防作用效果、擴大應用范圍。

粉紅螺旋聚孢霉Clonostachys rosea（異名：粉紅黏帚霉Gliocladium roseum）是一類重要的菌寄生菌，對多種植物病害顯示出良好的生防潛力[1418]。已有的研究表明，粉紅螺旋聚孢霉可以寄生病原真菌，產生幾丁質酶、葡聚糖酶等細胞壁降解酶，抑制病原菌的侵染[19]，還可以通過拮抗作用、對營養(yǎng)物質的競爭和誘導植物抗性等多種方式抑制病害的發(fā)生與擴展[2021]。粉紅螺旋聚孢霉的研究起步較晚，目前對這類生防資源的挖掘還十分缺乏。本研究選取國內外不同來源的粉紅螺旋聚孢霉菌株，進行了寄生能力和細胞壁降解酶活性測定，以及對番茄灰霉病防治效果評價，以期為病害防控提供新的生防資源，為粉紅螺旋聚孢霉生防制劑的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

不同來源粉紅螺旋聚孢霉菌株42株（表1）、核盤菌、番茄灰霉菌均由中國農業(yè)科學植物保護研究所土傳病害生防實驗室保存。

1.1.2 供試藥劑

50%腐霉利可濕性粉劑（WP），日本住友化學株式會社生產。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

PDA：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，水1 L。

胡蘿卜培養(yǎng)基[22]：胡蘿卜200 g切成小塊，裝于2 L三角瓶中。

菌核粉培養(yǎng)基：核盤菌菌核粉碎，過25目篩。培養(yǎng)基中含1%菌核粉、0.3%NaCl、0.3%K2HPO4和0.3%MgSO4，250 mL三角瓶裝液量60 mL。121℃滅菌25 min，待用。

DNS溶液：稱取192 g酒石酸鉀鈉溶于預熱至70℃的500 mL蒸餾水中，依次加入6.3 g DNS、21 g NaOH和5 g無水Na2SO4，定容至1 000 mL，棕色瓶中儲存。

膠體幾丁質制備：稱取5 g幾丁質加入200 mL濃鹽酸中，加熱溶解，然后加入2 000 mL雙蒸水，4℃過夜，5 000 r/min離心5 min，收集膠體物質。

1%膠體幾丁質磷酸緩沖液：1 mL膠體幾丁質溶于含37.5 mL的0.2 mol/L K2HPO4和62.5 mL 0.2 mol/L NaH2PO4溶液中。

0.2 mol/L pH 5醋酸醋酸鈉緩沖液：0.2 mol/L醋酸溶液14.8 mL和0.2 mol/L醋酸鈉溶液352 mL混勻。

β-1，3-葡聚糖酶促反應底物：100 mg昆布多糖溶于100 mL 0.2 mol/L pH 5醋酸醋酸鈉緩沖液中。

1.1.4 試驗番茄

圣女果，產地海南，購自北京生鮮超市。

1.2 方法

1.2.1 菌核培養(yǎng)

將實驗室前期保存的核盤菌菌核用1% NaClO表面消毒30 s，無菌水沖洗4遍，超凈工作臺中吹干，然后放置于PDA平板中央，每皿放1個菌核，25℃培養(yǎng)4 d。待菌核萌發(fā)菌絲后，挑取菌絲接種到9 cm的PDA平板上，25℃培養(yǎng)5 d，用解剖刀切成1 cm的菌塊，全部接種到胡蘿卜培養(yǎng)基中，每皿接2瓶。26℃培養(yǎng)10～15 d，待長出黑色顆粒狀菌核后，用自來水反復沖洗去除物料及菌絲，用75%乙醇表面消毒，陰涼干燥處儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 寄生能力測定

將不同來源的粉紅螺旋聚孢霉菌株接種于PDA平板上，26℃培養(yǎng)7～10 d，加入5 mL無菌水洗脫孢子，調節(jié)菌懸液濃度至孢子含量107個/mL。菌核消毒后，浸于不同的菌懸液中，10 min后取出，滅菌濾紙上晾干，然后轉入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿（9 cm）中，每皿放置20～25粒菌核。28℃保濕培養(yǎng)10 d，觀察菌核被寄生的情況。根據(jù)菌株生長及菌核的腐爛程度，將粉紅螺旋聚孢霉寄生能力分為5個等級[22]。0級：菌核表面無寄生菌生長;1級：菌核表面長有寄生菌，菌核萌發(fā);2級：菌核表面長有寄生菌，菌核萌發(fā)受到抑制但表皮不脫落;3級：菌核表面長有寄生菌，菌核表皮脫落，但菌核內部無軟化現(xiàn)象;4級：菌核表面長滿寄生菌，整個菌核變得軟腐（圖1）。每個菌株3個重復。

1.2.3 粉紅螺旋聚孢霉β-1，3-葡聚糖酶活性

按4%接種量將不同菌株孢子懸液接種于菌核粉培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。取發(fā)酵液4℃下離心15 min，轉速10 000 r/min，收集上清液作為粗酶液。

葡萄糖標準曲線的繪制：試管中分別加入0、50、100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 μL葡萄糖標準溶液，加蒸餾水定容至2.0 mL。加入2.0 mL DNS溶液，100℃水浴10 min，冷卻后定容至15 mL，分光光度計（UV-2550型，日本島津）540 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

β-1，3-葡聚糖酶活性的測定：試管中分別加入1 mL葡聚糖底物和1 mL粗酶液，40℃恒溫水浴30 min，以100℃滅活粗酶液為對照。加入2.0 mL DNS溶液100℃水浴終止反應，測定吸光度。3次重復。

1.2.4 粉紅螺旋聚孢霉幾丁質酶活性

N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線的繪制：試管中分別加入0、50、100、150、200，250、300、350 μL N-乙酰氨基葡萄糖標準溶液，加水定容至0.5 mL，再加入0.5 mL DNS溶液，100℃水浴10 min，冷卻后定容至5 mL，540 nm測定吸光度，繪制標準曲線。

幾丁質酶活性的測定：試管中加入1 mL 1%膠體幾丁質底物和1 mL粗酶液，40℃恒溫水浴30 min，離心取上清液，以滅活粗酶液為對照。加入0.5 mL DNS溶液100℃終止反應，測定吸光度。3次重復。

1.2.5 對灰霉病菌的拮抗作用

對強寄生力和細胞壁降解酶活性高的菌株進行拮抗作用測定。PDA平板培養(yǎng)粉紅螺旋聚孢霉和番茄灰霉病菌，用打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，在距PDA平板兩側1.5 cm處分別放置粉紅螺旋聚孢霉和番茄灰霉病菌菌塊，28℃對峙培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑，計算粉紅螺旋聚孢霉對番茄灰霉病菌的抑制率。抑制率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。以只接種番茄灰霉病菌的PDA平板為對照。每個處理3次重復。

1.2.6 對離體番茄果實灰霉病的防治效果

灰霉病菌在PDA平板上，28℃培養(yǎng)10 d，加入無菌水洗脫孢子，3層擦鏡紙過濾，血球計數(shù)板調節(jié)菌液孢子濃度為5×104個/mL。選取大小一致、外皮無損傷的新鮮圣女果，用1% NaClO消毒30 s，無菌水反復沖洗，吹干，用滅菌的1 mL Tip頭在果皮赤道處刺1個1 mm深的小孔，然后浸于濃度為107個/mL的不同粉紅螺旋聚孢霉菌株的孢子懸浮液中，30 min后取出，無菌濾紙吸取殘留的菌液。將一直徑5 mm的無菌濾紙片貼在小孔上，然后滴加10 μL灰霉病菌孢子懸浮液。以無菌水和50%腐霉利可濕性粉劑1 000倍稀釋液分別代替粉紅螺旋聚孢霉菌懸液作為空白對照和藥劑對照。28℃保濕培養(yǎng)，7 d后調查番茄果實發(fā)病情況。每個處理4次重復。

根據(jù)病斑的擴展程度對番茄灰霉病進行分級[23]。0級：無病斑;1級：病斑直徑≤1 cm;3級：1 cm<病斑直徑 ≤ 2 cm;5級：2 cm<病斑直徑 ≤ 3 cm;7級：3 cm<病斑直徑≤4 cm;9級：病斑直徑>4 cm。病情指數(shù)=100×∑（各級發(fā)病果實數(shù)量×相對級值）/（調查總數(shù)×最高級值）;防效=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 粉紅螺旋聚孢霉菌株對核盤菌菌核的寄生能力

供試粉紅螺旋聚孢霉菌株對核盤菌菌核均具有一定的寄生作用。其中19個菌株寄生能力達到4級，菌核被寄生后變得軟腐，表面布滿粉紅螺旋聚孢霉的菌絲;12個菌株寄生能力達到3級，可以看到菌核表皮脫落，表面布滿粉紅螺旋聚孢霉菌絲。但也有近30%的菌株寄生能力相對較弱，為1～2級（表1）。

2.2 粉紅螺旋聚孢霉β-1，3-葡聚糖酶活性

葡萄糖標準曲線方程為y=0.000 6x-0.029 3，R2=0.997 3（圖2），供試的粉紅螺旋聚孢霉菌株β-1，3-葡聚糖酶活性范圍在31.45～77.3 U/mL?？梢钥闯?，酶活性較高的菌株，如SHW-3-1、NHH-48-2、JLB-7-1、GS6-1和HN-56，寄生能力均為4級，而菌株NHH-42-1、ACCC37734、CBS100379和3.398 7

菌株的β-1，3-葡聚糖酶活性較低，其寄生能力也相

對較弱（圖3）。

2.3 粉紅螺旋聚孢霉幾丁質酶活性

N-乙酰氨基葡萄糖的標準曲線方程為y =0.001 1x-0.016 5，R2=0.991 9（圖4），產幾丁質酶活性范圍為2.69～10.39 U/mL，其中菌株GS6-1、GZH-1-1、GG-1-2、SHW-1-1和STG-21-1幾丁質酶活性較ACCC58676、YES-2-14和ACCC30190高，相應地，其寄生能力也相對較強（圖5）。

2.4 粉紅螺旋聚孢霉寄生能力與細胞壁降解酶的相關性

對粉紅螺旋聚孢霉寄生能力與幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶活性進行相關性分析，結果表明，菌寄生能力與幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性呈極顯著正相關，其中寄生能力達到4級的菌株，其活性大多高于其他級別菌株（表2），表明粉紅螺旋聚孢霉在寄生核盤菌過程中細胞壁降解酶發(fā)揮著極為重要的作用。

2.5 粉紅螺旋聚孢霉菌株對灰霉病菌的拮抗作用

平板對峙試驗結果表明，供試的粉紅螺旋聚孢霉菌株對番茄灰霉病菌都具有較為明顯的拮抗作用，但不同菌株間存在較大的差異，其中3.365 5、JXLS-1-1、HLD-1、GZH-1-1和54-1菌株作用較強，抑制率達70%以上，顯示出良好的生防潛力（圖6）。

2.6 粉紅螺旋聚孢霉菌株對番茄果實灰霉病的防治效果

7 d后只接種病原菌孢子懸浮液的番茄表面布滿灰霉菌菌絲，而采用粉紅螺旋聚孢霉菌懸液浸泡處理的番茄與對照相比病害明顯減輕，番茄表面病斑直徑較小，60%的菌株對番茄灰霉病防效達50%以上，其中，HN-56、STG-21-1和GS6-1等菌株的防效超過75%，與化學農藥50%腐霉利可濕性粉劑1 000倍稀釋液的防病效果相當（圖7～圖8）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的供試粉紅螺旋聚孢霉菌株都能夠在核盤菌菌核上寄生，其中超過70%的菌株寄生能力達到3級或4級，菌核被寄生后不能繼續(xù)萌發(fā)侵染寄主植物，從而有效降低了初侵染源。

在生防菌寄生過程中，幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶等細胞壁降解酶發(fā)揮了重要作用。葡聚糖和幾丁質是病原真菌細胞壁的主要成分，生防菌通過產生細胞壁降解酶破壞病原菌細胞壁結構，導致病原菌死亡[2426]。劉惠元[27]研究表明，綠黏帚霉Gliocladium virens和融黏帚霉G.deliquescens可以產生細胞壁降解酶，破壞核盤菌菌核。本研究也發(fā)現(xiàn)，粉紅螺旋聚孢霉寄生能力與β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶活性呈正相關，寄生能力強的菌株酶活性也較高，表明細胞壁降解酶活性的高低可以作為篩選高效菌株的一個重要指標。

拮抗作用是粉紅螺旋聚孢霉的一個重要生防機制。前期研究發(fā)現(xiàn)，粉紅螺旋聚孢霉對小麥赤霉病菌Fusarium graminicola、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum、蘋果腐爛病菌Valsa mali、楊樹潰瘍病菌Botryosphaeria dothidea等多種植物病原菌表現(xiàn)出強烈的抑制作用[14， 2829]。我們對篩選出的高致病性生防菌株進行對峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，這些菌株對番茄灰霉病菌都表現(xiàn)出較為明顯的拮抗作用，其中5個菌株抑制率達到70%以上，顯示出良好的生防潛力。

灰霉病是番茄生產中一種常見的真菌病害，也是番茄運輸貯存過程中的一個重要危害因子。通過生防菌劑噴施、浸果等處理防治番茄果實灰霉病已取得良好的效果。袁和奇等[30]將淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinus接種于番茄傷口處，有效減輕了灰霉病的發(fā)生。本研究采用粉紅螺旋聚孢霉孢子懸浮液浸果防治番茄果實灰霉病，結果表明，HN-56、STG-21-1等菌株防效達到75%以上，與常規(guī)化學農藥腐霉利的效果相當。推測可能是生防菌通過占據(jù)生態(tài)位點，直接作用于病原菌，抑制孢子的萌發(fā)和菌絲的生長，同時，通過與病原菌競爭空間和營養(yǎng)，使其能夠更有效地抑制病原菌的增殖，降低病害的發(fā)生和發(fā)展。本研究為防治番茄果實灰霉病及解決采摘后番茄儲存問題提供了一條有效可行的途徑。

本研究通過對不同來源的粉紅螺旋聚孢霉菌株寄生能力和細胞壁降解酶活性測定，以及對番茄灰霉病防治效果評價，獲得了GG-1-2、GZH-1-1和GS6-1等高效菌株，對這些菌株將進一步進行田間試驗和作用機制的研究。

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（責任編輯：楊明麗）