近零磁場(chǎng)下東方黏蟲轉(zhuǎn)錄組分析

閆蒙蒙 張蕾 程云霞 江幸福

摘要 ：為進(jìn)一步探究黏蟲的磁感應(yīng)機(jī)制，明確磁場(chǎng)強(qiáng)度變化對(duì)黏蟲相關(guān)基因表達(dá)的影響及相應(yīng)的分子機(jī)制，本研究利用亥姆霍茲線圈裝置產(chǎn)生近零磁場(chǎng)，使用Illumina技術(shù)，分別對(duì)近零磁場(chǎng)（小于500 nT）和地磁場(chǎng)（約54 000 nT）下飼養(yǎng)的黏蟲雌蛾和雄蛾進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果表明：相對(duì)于地磁場(chǎng)，近零磁場(chǎng)下雌、雄蛾分別鑒定出1 670和1 401個(gè)差異表達(dá)基因，其中雌蛾鑒定出614個(gè)上調(diào)基因，1 056個(gè)下調(diào)基因;雄蛾鑒定出545個(gè)上調(diào)基因，856個(gè)下調(diào)基因;雌、雄蛾共同差異表達(dá)基因274個(gè)。GO功能分析和pathway結(jié)果顯示近零磁場(chǎng)脅迫與離子結(jié)合、催化和代謝等關(guān)鍵過(guò)程密切相關(guān)。對(duì)選取的10個(gè)差異基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，證明了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本試驗(yàn)為深入探究遷飛性昆蟲的地磁定向機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ：近零磁場(chǎng); 地磁場(chǎng); 黏蟲; 轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)：

S 433.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020013

Transcriptome analysis of the oriental armyworm Mythimna separata in

a near-zero magnetic field

YAN Mengmeng， ZHANG Lei， CHENG Yunxia， JIANG Xingfu*

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

In order to further explore the mechanism of magnetoreception of Mythimna separata and clarify the effects of magnetic field changes on the expression of related genes， transcriptome analysis of M.separata in a near-zero magnetic field was carried out. In this study， Helmhortz coils were used to generate a near-zero magnetic field， and the Illumina technology was used to sequence the transcriptome of M.separata moths （female and male） raised in near-zero magnetic field （less than 500 nT） and normal geomagnetic field （about 54 000 nT）. The results showed that compared with geomagnetic field， 1 670 and 1 401 differentially expressed genes were identified in female and male adults under near-zero magnetic field， respectively， among which 614 up-regulated genes and 1 056 down-regulated genes were identified in female adults， and 545 up-regulated genes and 856 down-regulated genes were identified in male adults. There were 274 common differentially expressed genes in male and female adults. The gene ontology （GO） functional annotation and pathway enrichment analysis results showed that near-zero magnetic field was related to key biological processes， such as ion binding， catalysis activity and metabolism process. The results of qRT-PCR showed that the transcriptome was accurate and reliable. Our study provided a theoretical fundament for further study of the mechanism of magnetoreception in migratory insects.

Key words

near-zero magnetic field; geomagnetic field; Mythimna separata; transcriptome

與溫濕度、紫外線、CO2濃度一樣，磁場(chǎng)同樣是影響昆蟲生存的非生物因素之一[1]，然而卻極易被人們忽略。地磁場(chǎng)作為地球上最基本的物理因素，時(shí)刻影響著地球上生物的發(fā)育與進(jìn)化[2]。地磁場(chǎng)強(qiáng)度從赤道的約30 μT向兩極逐漸遞增到約65 μT，且其強(qiáng)度隨著時(shí)間和空間的變化而不斷變化。許多動(dòng)物如魚類、鳥類、昆蟲等動(dòng)物可依賴地球磁場(chǎng)進(jìn)行洄游及飛行定向[35]。磁場(chǎng)的極性、強(qiáng)度和傾角都可以幫助昆蟲確定目的地的地理位置進(jìn)而幫助昆蟲保持恒定航向[6]。磁場(chǎng)變化不僅會(huì)影響昆蟲的定向行為，還會(huì)對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，如磁場(chǎng)強(qiáng)度降低會(huì)延長(zhǎng)棉鈴蟲Helicoverpa armigera和褐飛虱Nilaparvata lugens生長(zhǎng)發(fā)育歷期，降低褐飛虱產(chǎn)卵量，影響其翅型分化等[78]。盡管近年來(lái)開展了許多磁感應(yīng)研究，然而關(guān)于生物磁效應(yīng)機(jī)制目前尚不明確[9]。

黏蟲Mythimna separata是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一，每年在我國(guó)南北往返季節(jié)性遷飛[1011]。其遷飛過(guò)程中，不僅濕度和溫度在逐漸變化，地磁場(chǎng)強(qiáng)度和方向也在不斷變化。前人研究表明，黏蟲雌、雄蛾在人工模擬的強(qiáng)磁場(chǎng)、近零磁場(chǎng)下均沒(méi)有顯著的群體共同定向行為，且野外不同地區(qū)遷飛性黏蟲的定向方向不同，表明黏蟲可能根據(jù)磁場(chǎng)進(jìn)行遷飛定向[1214]。因此，明確磁場(chǎng)變化對(duì)黏蟲的影響及黏蟲的地磁定向機(jī)制對(duì)黏蟲發(fā)生的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)具有重要意義。

近零磁場(chǎng)又稱為亞磁場(chǎng)，即屏蔽地磁場(chǎng)后產(chǎn)生的磁場(chǎng)強(qiáng)度接近零的磁場(chǎng)。近零磁場(chǎng)可用于揭示磁場(chǎng)強(qiáng)度降低對(duì)生物產(chǎn)生的影響及地磁場(chǎng)對(duì)生物的重要性[1516]。本研究通過(guò)直流電型亥姆霍茲線圈屏蔽地磁場(chǎng)，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探索黏蟲對(duì)近零磁場(chǎng)的分子響應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步挖掘磁感受相關(guān)基因，以期為深入研究遷飛性昆蟲的地磁定向機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)條件

以本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)繁殖多代的黏蟲為供試蟲源，室內(nèi)飼養(yǎng)條件為溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度（70±10）%，光周期L∥D=14 h∥10 h，幼蟲飼養(yǎng)密度為10頭/罐（罐直徑9 cm，高13 cm），以人工飼料飼喂，幼蟲老熟后置于含水量為15%的土壤中化蛹，成蟲羽化后飼喂5%的蜂蜜水，取羽化后48 h的雌、雄蛾供試，并設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 磁場(chǎng)發(fā)生裝置

磁場(chǎng)發(fā)生裝置由亥姆霍茲線圈和相連的兩個(gè)電源箱組成（中國(guó)科學(xué)院電工所制），亥姆霍茲線圈為正方體形，線框直徑為1 m，通過(guò)調(diào)節(jié)電源箱電流可在線圈中心區(qū)域（20 cm×20 cm×20 cm）內(nèi)產(chǎn)生低于500 nT的磁場(chǎng)（近零磁場(chǎng)）。兩個(gè)磁場(chǎng)發(fā)生裝置放置在同一房間內(nèi)（間隔3 m），一個(gè)用來(lái)產(chǎn)生近零磁場(chǎng)，另一個(gè)用來(lái)做假暴露以避免裝置帶來(lái)的誤差。每次試驗(yàn)前及過(guò)程中均使用磁強(qiáng)計(jì)（CH-330F，北京翠?？萍加邢薰荆z測(cè)磁場(chǎng)強(qiáng)度。

1.3 黏蟲成蟲RNA提取

供試黏蟲從卵至成蟲分別放置在近零磁場(chǎng)和正常地磁場(chǎng)中飼養(yǎng)。分別收集正常地磁場(chǎng)下和近零磁場(chǎng)下羽化48 h的雌、雄蛾蟲體。不同磁場(chǎng)下每個(gè)性別各3個(gè)重復(fù)，共12個(gè)樣品。每個(gè)樣品由3頭黏蟲混合組成，液氮處理后儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱中。以地磁場(chǎng)下黏蟲雌、雄蛾為對(duì)照，近零磁場(chǎng)下雌、雄蛾為處理組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，地磁場(chǎng)下雌、雄蛾樣品分別編號(hào)為GF1、GF2、GF3和GM1、GM2、GM3，近零磁場(chǎng)雌、雄蛾樣品分別編號(hào)為OF1、OF2、OF3和OM1、OM2、OM3。采用TRIzol法提取不同處理組樣品總RNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA是否降解或污染，超微量紫外分光光度計(jì)（凱奧，K5500）檢測(cè)RNA的純度，使用安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit（Agilent Technologies，CA， USA）檢測(cè)RNA樣品的完整性和濃度。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及信息注釋

檢測(cè)合格的RNA樣品在北京安諾優(yōu)達(dá)公司進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建以及Illumina平臺(tái)測(cè)序。測(cè)序完成后，通過(guò)去除低質(zhì)量序列、去接頭等過(guò)程完成數(shù)據(jù)處理，得到高質(zhì)量序列進(jìn)行組裝。選取| log2Ratio |≥1和q<0.05的基因作為差異顯著表達(dá)基因。

1.5 GO功能分析

根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥www.geneontology.org/），使用GO功能來(lái)分析差異基因（DEG）的主要功能。計(jì)算每個(gè)GO條目的差異基因數(shù)目，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。其計(jì)算公式為P=∑m-1i=0（Mi）（n-Mn-i）（Nn），其中N為所有基因中具GO功能注釋的基因數(shù)目;n為N中差異表達(dá)基因的數(shù)目;M為所有基因中注釋到某特定GO條目的基因數(shù)目;m為注釋到某特定GO條目的差異表達(dá)基因數(shù)目。計(jì)算得到的P值經(jīng)過(guò)校正后，以P<0.05為閾值，滿足P<0.05的GO條目為差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。

1.6 pathway 富集分析

根據(jù)京都基因和基因組百科全書（KEGG）（http：∥www.genome.jp/kegg/），使用pathway分析確定差異表達(dá)基因的主要通路。以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)KEGG中每個(gè)pathway應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，找出差異表達(dá)基因中顯著富集的pathway。

1.7 qPCR定量分析

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確性，從測(cè)序結(jié)果中隨機(jī)選擇10個(gè)差異表達(dá)基因采用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。使用Beacon Designer設(shè)計(jì)基因特異性引物（表1），并由生工生物工程（上海）有限公司合成，以β-actin和18S rRNA為內(nèi)參基因。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈;以合成的cDNA為模板，在Bio Rad 儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR：35個(gè)循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。繪制熔解曲線，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)試驗(yàn)用重復(fù)3次的樣品進(jìn)行qPCR分析。文中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）。均值用單因素方差分析作比較。當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果與質(zhì)量評(píng)估

經(jīng)檢測(cè)，樣品總RNA均滿足后續(xù)試驗(yàn)分析要求。不同磁場(chǎng)下雌、雄蛾共12個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。過(guò)濾后的reads數(shù)占總數(shù)的98%

以上。各樣本的Q30（序列中質(zhì)量大于30即錯(cuò)誤率小于0.1%的堿基數(shù)的比例）均在92%以上，各樣本GC含量均在40%左右，測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確度較高，可用于后續(xù)分析。

1） GF1、GF2、GF3為地磁場(chǎng)下雌蛾樣品， GM1、GM2、GM3為地磁場(chǎng)下雄蛾樣品， OF1、OF2、OF3為近零磁場(chǎng)下雌蛾樣品， OM1、OM2、OM3為近零磁場(chǎng)下雄蛾樣品。

GF1， GF2， GF3 indicate female moth under geomagnetic field. GM1， GM2， GM3 indicate male moth under geomagnetic field. OF1， OF2， OF3 indicate female moth under near-zero magnetic field， and OM1， OM2， OM3 indicate male moth under near-zero magnetic field.

2.2 差異表達(dá)基因分析

相對(duì)于地磁場(chǎng)，近零磁場(chǎng)下雌、雄蛾分別鑒定出1 670個(gè)和1 401個(gè)差異表達(dá)基因，其中雌、雄蛾分別鑒定出614、545個(gè)上調(diào)基因和1 056、856個(gè)下調(diào)基因（圖1～2）。其中雌、雄蛾共同差異表達(dá)基因274個(gè)。大部分差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)分布在1倍～10倍之間，少部分差異倍數(shù)達(dá)到10倍以上。

2.3 GO功能分析

GO功能分析結(jié)果顯示（圖3），生物過(guò)程中，不同磁場(chǎng)下黏蟲雌雄蛾差異基因主要集中在催化、合成和代謝過(guò)程;在分子功能中雌、雄蛾分別有53個(gè)和24個(gè)顯著富集條目，大多為聚合酶、內(nèi)切酶、水解酶、合成酶、核酸酶、還原酶和肽酶活性等;細(xì)胞組分中差異基因主要集中在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)組分。

2.4 KEGG通路分析

在pathway分析中，除人類疾病外，雌蛾中細(xì)胞黏附分子通路富集到的差異基因最多，其次為AMPK信號(hào)通路、脂肪酸合成通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體交互作用通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、嘌呤代謝、脂肪酸代謝、碳代謝、膽固醇代謝、神經(jīng)活性配體—受體相互作用途徑。雄蛾中雷帕霉素信號(hào)通路富集到的差異基因最多，其次為脂肪酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、AMPK信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、自噬、脂肪酸合成，神經(jīng)活性配體—受體相互作用途徑。

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證

從轉(zhuǎn)錄組中隨機(jī)挑選了10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明差異基因定量表達(dá)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致（圖4），其中7個(gè)基因表現(xiàn)為一致下調(diào)，3個(gè)基因表現(xiàn)為一致上調(diào)。說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

3 討論

自趨磁細(xì)菌發(fā)現(xiàn)以來(lái)，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注磁場(chǎng)的磁生物學(xué)效應(yīng)。地磁定向是遠(yuǎn)距離遷飛昆蟲的重要定向機(jī)制之一，也是目前生物磁效應(yīng)研究熱點(diǎn)[17]。目前，廣泛認(rèn)可的磁感應(yīng)機(jī)制有兩種，即依賴光的自由基對(duì)假說(shuō)和磁顆粒假說(shuō)，兩種假說(shuō)之間并不矛盾，兩者可能同時(shí)存在于生物體內(nèi)[1819]。

在依賴光的自由基對(duì)假說(shuō)中，藍(lán)光受體隱花色素CRYs被認(rèn)為是最可能的磁感應(yīng)受體。CRYs是紫外光和藍(lán)色光感受器，存在于植物和動(dòng)物中，含有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）發(fā)色團(tuán)，在光活化后形成自由基對(duì)[2021]。磁場(chǎng)還被認(rèn)為是一種授時(shí)因子[2126]，CRY作為核心生物鐘基因，被認(rèn)為參與了磁場(chǎng)影響果蠅晝夜節(jié)律的過(guò)程[27]，同時(shí)CRY還參與介導(dǎo)磁場(chǎng)對(duì)果蠅趨地性、趨光性，交配行為等的影響過(guò)程[2829]。Mo等對(duì)近零磁場(chǎng)下培養(yǎng)的人神經(jīng)瘤母細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選到CRY2在近零磁場(chǎng)下差異表達(dá)[30]，而在灰飛虱Laodelphax striatellus雌成蟲的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中，CRYs在地磁場(chǎng)和近零磁場(chǎng)下并不存在顯著差異表達(dá)[31]。在黏蟲雌雄蛾轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中也未篩選到CRYs基因在地磁場(chǎng)和近零磁場(chǎng)下差異表達(dá)，這可能與CRYs的調(diào)控時(shí)間和作用位置有關(guān)。萬(wàn)貴鈞研究表明白背飛虱Sogatella furcifera體內(nèi)CRY1和CRY2對(duì)近零磁場(chǎng)的響應(yīng)存在時(shí)間特異性，可能是CRYs的生物鐘功能和磁感受功能交互作用引起的[32]。

磁顆粒假說(shuō)認(rèn)為磁鐵礦物晶體存在于生物體內(nèi)，外界磁場(chǎng)對(duì)生物體內(nèi)鐵磁顆粒產(chǎn)生磁矩進(jìn)而改變生物膜上的離子通道開關(guān)影響神經(jīng)系統(tǒng)[19]。遷飛性昆蟲褐飛虱、鱗翅目昆蟲黑脈金斑蝶 Danaus plexippus體內(nèi)均已發(fā)現(xiàn)鐵磁性物質(zhì)[3334]。而黏蟲體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)存在鐵磁性物質(zhì)。Fitak等通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開展了虹鱒魚在基因水平對(duì)脈沖磁場(chǎng)的響應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)與鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的ferritin基因參與虹鱒魚的磁感受過(guò)程[35]。對(duì)近零磁場(chǎng)下培養(yǎng)的灰飛虱雌蟲的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與鐵吸收相關(guān)的MVL基因在灰飛虱雌成蟲中差異表達(dá)[31]。本研究發(fā)現(xiàn)黏蟲雄蛾體內(nèi)與Fe轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鐵硫結(jié)合相關(guān)基因差異表達(dá)，雌、雄蛾中分別篩選到17個(gè)和8個(gè)與鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合相關(guān)的差異表達(dá)基因，推測(cè)磁顆粒感受機(jī)制可能在黏蟲的磁響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用。

在GO功能分析中，不同磁場(chǎng)下黏蟲雌、雄蛾差異表達(dá)基因大多富集在離子結(jié)合、代謝和酶活過(guò)程，表明近零磁場(chǎng)對(duì)黏蟲的生長(zhǎng)發(fā)育也存在一定影響。這與前期研究發(fā)現(xiàn)近零磁場(chǎng)對(duì)黏蟲的生長(zhǎng)發(fā)育存在負(fù)面影響一致（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。本試驗(yàn)中，近零磁場(chǎng)下黏蟲雌、雄蛾下調(diào)基因數(shù)量都多于上調(diào)基因，與人神經(jīng)瘤母細(xì)胞的測(cè)序結(jié)果[30]相似，而近零磁場(chǎng)下的灰飛虱雌蟲轉(zhuǎn)錄測(cè)序得到數(shù)量相近的下調(diào)基因和上調(diào)基因[31]，這可能是由于不同物種對(duì)近零磁場(chǎng)的響應(yīng)存在特異性差異。近零磁場(chǎng)下雌、雄蛾轉(zhuǎn)錄組中，雌蛾比雄蛾多出269個(gè)差異基因，雌、雄蛾共同差異表達(dá)基因共274個(gè)，在GO功能分析的生物過(guò)程中，雌、雄蛾差異表達(dá)基因顯著富集到的生物途徑也有所不同，不同性別黏蟲可能對(duì)近零磁場(chǎng)的敏感性不同。

昆蟲的地磁定向機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不僅與地磁場(chǎng)強(qiáng)度有關(guān)，還可能與磁場(chǎng)的極性和磁傾角相關(guān)，而本試驗(yàn)僅考慮了磁場(chǎng)強(qiáng)度，并未涉及磁傾角的變化。昆蟲的地磁定向機(jī)制應(yīng)結(jié)合生物物理學(xué)、生態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、解剖學(xué)等多學(xué)科做進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）