液相色譜質(zhì)譜MRM-IDA-EPI模式靶向分析生姜中的代謝產(chǎn)物

李東芹

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室，武漢 430070)

生姜是多年生姜科植物姜的新鮮根莖，是世界上最廣泛使用的香辛調(diào)味料，也是中國傳統(tǒng)的藥食兩用型植物[1]。生姜中除了含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和多糖等營養(yǎng)物質(zhì)外，還有姜黃素、姜辣素及其衍生物等功能性活性成分[2]，這些活性成分具有抑菌消炎、抗氧化、抗血脂、抗腫瘤、改善阿爾茨海默癥等藥理作用[3-6]，因此生姜在食品、藥品、化妝品[7]等行業(yè)都具有良好的應(yīng)用前景和社會效益，而分析鑒定這些有效化學(xué)成分又是生姜開發(fā)利用的前提。隨著分析儀器的飛速發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)[8-11]逐漸取代了原有的紫外分光光度法[12]和液相色譜[13-14]分析方法?，F(xiàn)有的質(zhì)譜技術(shù)在生姜研究中的應(yīng)用[15-16]，都是針對一種或者幾種主要姜辣素物質(zhì)的定量分析，對生姜氨基酸、姜辣素衍生物等的研究非常少。因此，本試驗建立液相色譜質(zhì)譜靶向代謝組學(xué)分析方法，以期為生姜遺傳育種、品質(zhì)分析、醫(yī)藥應(yīng)用及保健品開發(fā)研究提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

生姜、仔姜、老姜（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場采購，產(chǎn)地為山東安丘）；6,8,10-姜酚、姜酮、姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素（以上標(biāo)品均為HPLC 級，純度≥98%。成都克洛瑪生物科技有限公司）；混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mL（sigma 公司）；Beta-煙酰胺單核苷酸（≥98%，質(zhì)譜級，醫(yī)恩醫(yī)療系統(tǒng)研發(fā)（上海）有限公司生產(chǎn)）。

1.2 儀器與試劑

4000 Qtrap 串聯(lián)三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）， LC-30AD 高效液相色譜儀（日本島津公司），Milli-pore 超純水儀（美國Millipore 公司），超聲波（寧波新芝），萬分之一天平（梅特勒公司），蠕動泵（Hamilton 公司），離心濃縮儀（Eppendorf 公司），甲醇（色譜純，默克公司），超純水，乙酸（色譜純），醋酸銨（色譜純），1 mL 醫(yī)用注射器，0.22 μm 微孔濾頭（上海安普）。

1.3 樣品制備

將生姜、老姜和仔姜切成5 mm 左右的碎片，分別稱取2 g 左右置于10 mL 的密封瓶內(nèi)，加入5 mL 80%甲醇水溶液，室溫過夜萃取[15]。用1 mL 針筒過濾器取上清，經(jīng)0.22 μm 濾頭過濾后加入進樣瓶，待用。

1.4 對照標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

準(zhǔn)確稱取姜黃素、6,8,10-姜酚、姜酮、脫甲氧基姜黃素、雙脫甲氧基姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 容量瓶內(nèi)，用甲醇定容后作為母液備用。

準(zhǔn)確移取50 μL 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液AAS18 到25 mL 容量瓶內(nèi)，并用超純水稀釋定容為氨基酸母液備用。

1.5 試驗條件

1.5.1 色譜條件 島津Shim-pack VP-ODS C18（150 L×2.0 mm，5 μm）色譜柱，樣品室溫度為室溫；流動相：A 為3 mmol·L-1的醋酸銨水溶液（V/V），B 為含0.1%乙酸的乙腈溶液（V/V）；流速為0.25 mL·min-1。梯度洗脫條件為：0～5 min，B 從5%升至50%，5.0～10 minB 從50%升至100%，20.0～15 min 為100%的B, 25.1～30 min 為5%的B。柱溫箱的溫度為40 ℃，進樣量為10 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧（ESI）離子源，選用MRM-IDA-EPI 掃描模式，正、負離子實時切換進行定性、定量分析。電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度：500 ℃；離子源輔助氣GS1/GS2 氣流均為50 L·h-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化

基于氨基酸、姜辣素和姜黃素類化合物都具有一定的極性，適合反相液相色譜分離模式。本研究選用島津ODS C18 色譜柱，考察了甲醇-水和乙腈-水體系的分離效果，乙腈-水作為流動相時代謝物的的分離度和信號強度優(yōu)于甲醇-水體系；由于姜辣素和姜黃素類化合物都含有酚羥基團，為了抑制色譜峰拖尾，需要在乙腈-水流動相中分別添加0.1%的乙酸和3 mmol·L-1的醋酸銨溶液；又因為生姜提取液中代謝產(chǎn)物較多，極性差異較大，選用梯度洗脫方式能達到更好的分離效果。故本文最終選擇1.5.1中描述的液相分離條件。

圖1 生姜代謝物的TIC 總離子流圖Figure 1 TIC chromatograms of the metabolites in ginger

圖2 6-姜烯酚色譜圖和二級質(zhì)譜圖Figure 2 Extracted ion chromatogram and product ion spectra of 6-shogaol

混合氨基酸、姜黃素、6, 8,10-姜酚、姜酮、脫甲氧基姜黃素、雙脫甲氧基姜黃素等有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物，通過針泵注射器進樣手動優(yōu)化其解簇電壓（DP）、入口電壓（EP）、碰撞能量（CE）和碰撞出口電壓（CXP）等質(zhì)譜參數(shù); 其他沒有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物，MRM 離子對（Q1/Q3）參考文獻［16］，DP、EP、CE、和CXP 參數(shù)是通過自動進樣器連續(xù)采集3 種生姜的混合提取液，不經(jīng)色譜柱分離，質(zhì)譜FIA 自動優(yōu)化模式優(yōu)化后得到。各化合物的詳細參數(shù)信息見表1。

在本研究優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，生姜代謝物在正負離子模式下都能得到很好的分離和質(zhì)譜響應(yīng)強度，正離子模式下各化合物的總離子流色譜圖如圖1 所示。

表1 生姜中目標(biāo)代謝物分析的MRM 轉(zhuǎn)換Table 1 MRM transitions for targeted metabolite analysis in ginger

續(xù)表1

2.2 生姜中氨基酸類、姜辣素類、姜黃素類代謝物的質(zhì)譜靶向分析

2.2.1 無對照品化合物的定性分析 采用4000 Qtrap質(zhì)譜儀特有的MRM-IDA-EPI 關(guān)聯(lián)掃描模式，一針進樣，不僅能得到用于定量分析的MRM 色譜圖，還可以同時得到該化合物的二級質(zhì)譜圖。對于沒有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物，二級質(zhì)譜圖主要用于定性確認(rèn)峰位置。因為姜辣素類化合物及其衍生物多為結(jié)構(gòu)類似的同系物，質(zhì)譜裂解比較有規(guī)律，有較多相同的碎片離子，MRM 色譜圖可能會出現(xiàn)一個以上不同保留時間的色譜峰。以姜烯酚類物質(zhì)為例，6-姜烯酚的MRM 色譜圖在9.07 min、11.62 min 出現(xiàn)兩個色譜峰（圖2(a)），2 個色譜峰對應(yīng)的二級質(zhì)譜圖分別為圖2 中的(b)和(c)。由二級質(zhì)譜圖(b)和(c)可以很容易判斷出(b)對應(yīng)的色譜峰為6-姜烯酚，而(c)是分子量為354.0 的化合物的二級質(zhì)譜圖，它恰好也可以裂解出質(zhì)量數(shù)為277 和137 的離子碎片。 所有代謝物的色譜保留時間信息見表1。

2.2.2 鮮姜、老姜和仔姜中氨基酸含量的差異分析3 種生姜都含有非常豐富的游離氨基酸。氨基酸總量和人體必需氨基酸總量都是老姜中最高，鮮姜次之，仔姜最低，具體見圖3(a)；3 種生姜氨基酸含量分布熱圖（圖3(b)）顯示，每種氨基酸在3 種生姜中含量差異明顯，大部分氨基酸在老姜、鮮姜和仔姜中的含量依次降低，賴氨酸的含量分布反而是依次升高；同一生姜中不同氨基酸含量分布也有明顯差異，仔姜中除了賴氨酸積累較多外，其他的氨基酸含量都相對較低；鮮姜中含量前3 位的依次是纈氨酸、賴氨酸和精氨酸；老姜中含量最高的是精氨酸，其次是芳香味氨基酸酪氨酸，含量最低的是谷氨酸。導(dǎo)致氨基酸代謝物種類和含量分布差異的原因還有待于進一步研究。

圖3 鮮姜、老姜和仔姜中氨基酸含量分布Figure 3 The distribution of different amino acids in fresh ginger, old ginger and tender ginger

2.2.3 鮮姜、老姜和仔姜中姜辣素類化合物的含量差異分析 姜辣素類化合物主要包括姜酚、姜烯酚、姜酮以及它們的甲基化和乙酰化衍生物。它們不僅是生姜的主要呈味物質(zhì)，也是其藥理作用的主要功能因子[16]，對姜辣素類物質(zhì)的定性和定量分析是生姜開發(fā)利用的前提。本研究主要對這幾類物質(zhì)進行含量差異分析。從3 種生姜姜辣素含量分布熱圖4可看出，衍生物1-脫氫-6-姜酮，在3 種生姜中含量都非常高，但品種間差異不太明顯；3 種生姜中姜酚、姜烯酚、姜酮及其甲基化衍生物含量分布規(guī)律是老姜中最高，仔姜中含量最低，這與他們風(fēng)味上的辛辣程度相符；而姜酚系列乙酰化衍生物的含量分布規(guī)律正好與之相反，都是仔姜中含量最高，老姜中含量最低。

圖4 鮮姜、老姜和仔姜中姜辣素類物質(zhì)含量分布熱圖的可視化分析Figure 4 Heat map visualization of the relative difference of gingerols in fresh ginger, old ginger and tender ginger

圖5 鮮姜、老姜和仔姜中姜黃素類物質(zhì)含量的差異分析Figure 5 Content distributions of curcuminoids in fresh ginger,old ginger and tender ginger

2.2.4 鮮姜、老姜和仔姜中姜黃素類物質(zhì)含量差異分析 現(xiàn)有研究結(jié)果表明，姜黃素類物質(zhì)具有抗腫瘤、消炎、抗氧化、降血脂等作用[17-18]。本研究可測定生姜中5 種姜黃素類物質(zhì)，其中四氫和六氫姜黃素在3 種生姜中都只有少量檢出，含量差異不明顯；姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素為生姜中最主要最常見的3 種姜黃素類物質(zhì)，它們在鮮姜、老姜和仔姜中的含量分布結(jié)果（圖5）表明：姜黃素在3 種生姜中的含量幾乎沒有差異，脫甲氧基姜黃素在老姜中含量最高，在仔姜中含量最低，而雙脫甲氧基姜黃素則是在仔姜中含量最高，在鮮姜中含量最低，導(dǎo)致其含量分布差異的生物學(xué)原因還不清楚。

3 結(jié)論

利用美國AB SCIEX 公司的4000 Qtrap 質(zhì)譜儀特有的離子阱富集功能，建立MRM－IDA—EPI 關(guān)聯(lián)掃描模式下正負離子實時切換的靶向代謝組學(xué)分析方法。該方法可在30 min 內(nèi)同時定性、定量檢測生姜中60 種代謝產(chǎn)物，具有一次性分析化合物更多、分析時間更短及靈敏度更高的優(yōu)點；該方法一針進樣可同時得到用于定量的MRM 色譜圖和用于定性的二級質(zhì)譜圖，能對未知化合物進行精確的定性、定量分析，可有效解決標(biāo)準(zhǔn)品昂貴或者買不到的現(xiàn)實問題。應(yīng)用該方法對鮮姜、老姜和仔姜中的代謝產(chǎn)物進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種生姜中氨基酸、姜辣素和姜黃素類化學(xué)物，在化合物種類及相對含量上都存在明顯差異，正是這些差異導(dǎo)致它們在風(fēng)味、藥效和生理作用上的差別。

本試驗旨在建立生姜代謝產(chǎn)物的檢測方法，未對造成這些代謝物差異的原因進行深入研究。深入研究這些代謝物的代謝路徑和含量差異原因，對生姜遺傳育種和改良研究有非常重要的意義。