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    滁菊多酚氧化酶的三相分離及其酶學(xué)特性分析

    2021-06-29 02:15:34苗文娟朱雙杰董藝凝
    關(guān)鍵詞:滁菊叔丁醇硫酸銨

    苗文娟,陳 強(qiáng),曾 妍,朱雙杰,董藝凝

    (滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,滁州 239000)

    滁菊又名“甘菊”、“白菊”,位列中國(guó)“四大藥菊”之一[1-2]。因富含多酚以及黃酮類活性成分[3-5],新鮮滁菊在采收、加工及貯藏過程中均易發(fā)生褐變,嚴(yán)重影響產(chǎn)品價(jià)值。有研究表明,多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)和過氧化物酶(Peroxidase,POD)是引起菊花褐變的關(guān)鍵酶[6],PPO 催化植物體內(nèi)的酚類底物氧化成醌,醌類物質(zhì)再相互聚合形成褐色化合物,導(dǎo)致植物組織褐變[7-8]。朱玉蕓[6]對(duì)亳菊的酶促褐變相關(guān)酶及其品質(zhì)影響進(jìn)行了研究,其結(jié)果表明酶促褐變導(dǎo)致亳菊酚酸類物質(zhì)含量顯著下降,降低了亳菊的抗氧化性,影響了亳菊的藥效和品質(zhì)。目前,尚無研究者開展關(guān)于滁菊酶促褐變的相關(guān)研究。

    在酶的分離純化方面,多采用鹽析、離子交換色譜以及凝膠過濾色譜等分離純化手段[9-11]。但由于這些方法在操作過程中涉及操作周期長(zhǎng)、提取率低、性能設(shè)備要求高等缺點(diǎn),近年來,有一些新型分離純化方法,如雙水相萃取法、三相分離法等開始應(yīng)用于酶的分離純化[12-14]。三相分離法通過在提取液中加入無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑,可以選擇性地將需要的酶分配到其中一相,蛋白質(zhì)和油脂等其他雜質(zhì)分配到其他相中,從而實(shí)現(xiàn)酶的純化目的[15-16]。三相分離是一種簡(jiǎn)單、快速和易于放大的分離純化酶的方法,不需要硫酸銨鹽析時(shí)的多次分級(jí)沉淀[16],也比柱層析法更加經(jīng)濟(jì)綠色環(huán)保。羅磊等[17]使用三相分離法對(duì)金銀花POD 進(jìn)行了分離純化,發(fā)現(xiàn)經(jīng)三相分離后金銀花POD 純化倍數(shù)達(dá)到5.849;Vetal等[18]的研究表明三相分離法是一種提取和部分純化桔皮POD 的理想方法;Gagaoua 等[19]采用三相分離法從無花果樹中純化蛋白酶,其研究表明三相分離法是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快捷的純化蛋白酶的方法。但目前尚鮮見關(guān)于利用三相法分離純化滁菊PPO的研究報(bào)道。鑒于此,本研究采用三相分離法純化滁菊PPO,并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行分析,以期為滁菊采后褐變的控制提供一些理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    滁菊,2019 年10 月采自滁州市金玉滁菊生態(tài)科技有限公司種植基地;鄰苯二酚(化學(xué)純),南京化學(xué)試劑股份有限公司;考馬斯亮藍(lán)G250,牛血清白蛋白,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸、氨水、叔丁醇,均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸銨,分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    L3S 型紫外可見分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;BSA124S-CW 型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;超聲波清洗器,寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司;HHS 型恒溫水浴鍋,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;TGL-16M 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;PHS-3C 型pH 計(jì),上海越平科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 滁菊PPO粗酶液的提取 稱取新鮮滁菊10 g置于研缽中,加入20 mL 預(yù)冷的0.1 mol·L-1,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液,快速研磨后用絹布過濾,濾渣重新加入pH 6.5 磷酸鹽緩沖液重復(fù)上述操作,合并2次濾液于4 ℃、9 000 r·min-1條件下離心15 min,上清液轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶并定容,分析粗酶液中PPO 酶活性和蛋白質(zhì)含量。

    1.3.2 滁菊PPO 三相分離純化 參照 Gagaoua[19]與羅磊[17]等的方法進(jìn)行三相分離純化并稍作修改。取一定體積滁菊PPO 粗酶液至50 mL 離心管中,加入一定量的硫酸銨,快速渦旋振蕩溶解,調(diào)節(jié)溶液至一定pH 值,然后按照一定體積比加入叔丁醇,渦旋混合后室溫靜置一定時(shí)間,4 000 r·min-1離心10 min 以促進(jìn)三相分離。吸除上層有機(jī)相和下層水相,中間沉淀層用0.1 mol·L-1、pH 6.5 的磷酸鹽緩沖液溶解,透析除鹽后定容至10 mL,對(duì)其酶活和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。分別考察三相分離純化體系的硫酸銨添加量、pH 值和提取液與叔丁醇的體積比和三相分離時(shí)間對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響。

    (1)pH 值。取10 mL 滁菊PPO 粗酶液,添加3.0 g 硫酸銨,固定提取液與叔丁醇的體積比為1:1,三相分離靜置時(shí)間1 h,考察三相分離pH 值(pH 3 ~ 8)對(duì)滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。

    (2)硫酸銨添加量。在最優(yōu)的pH 條件下,固定提取液與叔丁醇的體積比為1:1,三相分離靜置時(shí)間1 h,考察硫酸銨的添加量(0.20 ~ 0.60 g·mL-1)對(duì)滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。

    (3)體積比。在最優(yōu)pH 值及硫酸銨添加量條件下,考察提取液與叔丁醇的體積比(1:0.5、1:1、1:1.5、1:2 和1: 2.5)對(duì)滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。

    (4)三相分離時(shí)間。在最優(yōu)pH 值、硫酸銨添加量和提取液與叔丁醇的體積比條件下,考察三相分離時(shí)間(5 ~ 80 min)對(duì)滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。

    1.3.3 滁菊PPO 酶活測(cè)定 參照何軍忠等[20]的方法并加以修改:取2.0 mL 磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1,pH 6.5)于比色皿中,加入0.3 mL 鄰苯二酚底物溶液(0.35 mol·L-1),加入0.2 mL PPO 酶提取液后迅速混勻,立即放入分光光度計(jì)于420 nm 處測(cè)定吸光值(動(dòng)力學(xué)測(cè)量模式),從0 s 開始每20 s讀數(shù)1 次,計(jì)時(shí)1 min。每組平行測(cè)定3 次并作空白對(duì)照。滁菊PPO 酶活力定義為:每分鐘每克滁菊鮮樣吸光值增加0.01 為一個(gè)酶活力單位(U·g-1)。

    1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G 250比色法測(cè)定滁菊PPO 粗酶提取液和純化后樣品中蛋白質(zhì)含量,并計(jì)算純化前后滁菊PPO 酶的比活力、純化倍數(shù)和回收率。

    1.3.5 滁菊PPO 酶學(xué)特性分析 (1)pH 對(duì)滁菊PPO 活性的影響:配制0.1mol·L-1、pH 4.0 ~ 9.5 范圍內(nèi)的磷酸鹽緩沖液,按照1.3.3 的方法測(cè)定PPO活力,考察pH 對(duì)滁菊PPO 活性的影響。

    (2)溫度對(duì)滁菊PPO 活性的影響:取適量磷酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1,pH 6.5)和鄰苯二酚溶液(0.35 mol·L-1)分別置于試管中,在20 ~ 70℃下水浴保溫,迅速轉(zhuǎn)移到比色皿中混合均勻,立即加入0.2 mL 粗酶提取液,按照1.3.3 方法測(cè)定PPO 活力,考察溫度對(duì)滁菊PPO 活性的影響。

    (3)底物濃度對(duì)滁菊PPO 活性影響:在最適pH 值條件下,分別以不同濃度的鄰苯二酚(0.10~0.50 mol·L-1)作為底物,按照1.3.3 方法測(cè)定PPO活力,考察底物濃度對(duì)滁菊PPO 活性的影響。根據(jù)Lineweaver-Burk 作圖法計(jì)算米氏常數(shù)和最大酶促反應(yīng)速率。

    (4)滁菊PPO 的熱穩(wěn)定性:將滁菊PPO 粗酶液分別在50、60 和70 ℃水浴中保溫1~ 25 min 后取出,待粗酶液冷卻至25 ℃后,按照1.3.3 方法測(cè)定滁菊PPO 活力,以25 ℃所測(cè)酶活力為100%,考察溫度和保溫時(shí)間對(duì)滁菊PPO 活性的影響。

    1.3.6 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次,采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,Origin 2019軟件繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pH 值對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響

    pH 值是三相分離純化過程的一個(gè)重要參數(shù)[15],蛋白質(zhì)鹽析的效率取決于反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)所帶的凈電荷,而凈電荷高度依賴pH 值,因此實(shí)驗(yàn)研究了pH 值對(duì)滁菊PPO 三相分離純化效果的影響。由圖1 可以看出,在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的pH 梯度中,PPO 酶活回收率和純化倍數(shù)整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。pH 值在3 ~ 6 時(shí),滁菊PPO 酶活回收率和純化倍數(shù)均呈上升趨勢(shì),且在pH 值等于6 時(shí),酶活回收率和純化倍數(shù)達(dá)到最大,達(dá)到最佳純化效果。

    圖1 pH 值對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響Figure 1 Effect of pH on purification effect of Chuju PPO

    2.2 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響

    硫酸銨濃度在三相分離純化過程起著重要作用[21-22],因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的溶解度受到溶液離子強(qiáng)度的影響,在較高的鹽濃度下,水分子受到鹽離子的吸引,導(dǎo)致蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互聚集沉淀。在PPO粗酶液與叔丁醇的體積比為1:1 時(shí),考察硫酸銨的添加量(0.20 ~ 0.60 g·mL-1)對(duì)滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。由圖2 可見,滁菊PPO 的酶活回收率和純化倍數(shù)隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增加整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),硫酸銨濃度在0.40 g·mL-1時(shí),酶活回收率和純化倍數(shù)達(dá)到最大值。隨著硫酸銨質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加,酶蛋白的純化效果反而降低,這可能是因?yàn)殡S著硫酸銨質(zhì)量濃度增大,過高的離子強(qiáng)度會(huì)結(jié)合大量的水分子,產(chǎn)生強(qiáng)烈的鹽析效應(yīng),使雜蛋白疏水沉淀[17,23]。因此,以質(zhì)量濃度0.40 g·mL-1的硫酸銨進(jìn)行滁菊PPO 純化最佳。

    圖2 硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響Figure 2 Effect of ammonium sulfate concentration on the purification effect of Chuju PPO

    圖3 提取液與叔丁醇體積比對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響Figure 3 Effect of the volume ratio of extract to t-butanol on the purification of Chuju PPO

    2.3 提取液與叔丁醇體積比對(duì)滁菊PPO純化效果的影響

    由于叔丁醇具有合適的分子大小和支鏈結(jié)構(gòu),因此它不容易滲透到蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而引起蛋白質(zhì)變性,多篇文獻(xiàn)報(bào)道了叔丁醇是三相分離純化的最佳有機(jī)溶劑[24-25]。叔丁醇作為一種常見的有機(jī)溶劑,與硫酸銨一起相互增強(qiáng)離子強(qiáng)度、滲透壓和排它效應(yīng)等物理化學(xué)效應(yīng),使蛋白質(zhì)作為中間層在水相和有機(jī)相之間分配[26]。因此,本試驗(yàn)以叔丁醇作為三相分離純化的有機(jī)相,考察提取液與叔丁醇的體積比(1: 0.5、1:1、1:1.5、1:2 和1:2.5)對(duì)滁菊PPO回收率和純化倍數(shù)的影響。

    由圖3 可知,滁菊PPO 酶活回收率和純化倍數(shù)隨著叔丁醇和提取液體積比的提高先上升后下降,當(dāng)提取液與叔丁醇體積比為1:1.5 時(shí),滁菊PPO 酶活回收率和純化倍數(shù)最高。這可能是因?yàn)殡S著叔丁醇加入量的提高,可以從水相中吸收更多的水,從而導(dǎo)致水相中硫酸銨鹽濃度增加,提高蛋白質(zhì)在兩相界面處的分離,當(dāng)達(dá)到合適的體積比時(shí),蛋白質(zhì)回收率和純化倍數(shù)都達(dá)到最大;當(dāng)叔丁醇加入量過多時(shí),提取液介電常數(shù)降低導(dǎo)致雜蛋白也沉淀,同時(shí)過量的叔丁醇破壞了蛋白質(zhì)表面的水化層結(jié)構(gòu),部分酶變性失活,純化效果降低。所以酶蛋白純化效果隨著提取液與叔丁醇體積比增大先上升后下降。

    因此,采用三相法提取滁菊PPO 時(shí),使用的叔丁醇體積應(yīng)是酶粗提液的1.5 倍,在此條件下滁菊PPO 能夠達(dá)到最佳純化效果。

    2.4 三相分離時(shí)間對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響

    在加入叔丁醇后,體系會(huì)形成三相,但中間沉淀層富含蛋白容易發(fā)生乳化現(xiàn)象?,F(xiàn)考察三相分離的靜置時(shí)間對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響,結(jié)果(表1)表明,三相分離過程中靜置時(shí)間對(duì)滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)沒有促進(jìn)作用,經(jīng)靜置5 ~ 80 min后離心,中間相均可形成一層薄薄的蛋白沉淀層,經(jīng)回收后測(cè)定其酶活回收率在79.2% ~ 87.7%之間,純化倍數(shù)在3.1 ~ 4.2 倍之間。由此可見,在三相分離純化蛋白質(zhì)過程中,在加入叔丁醇混勻后即開始離心分離,可以縮短三相分離的時(shí)間。

    表1 三相分離時(shí)間對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響Table 1 Effect of three-phase separation time on the purification of Chuju PPO

    綜上,從回收率和純化倍數(shù)兩個(gè)方面對(duì)滁菊PPO 的三相分離條件進(jìn)行了分析,結(jié)果表明在三相分離過程中,硫酸銨濃度、pH、提取液和叔丁醇的體積比均對(duì)三相分離的結(jié)果有影響,三相分離靜置時(shí)間對(duì)其影響不大。經(jīng)三相分離后,滁菊PPO 酶的平均純化倍數(shù)達(dá)到4.3 倍。王劍鋒等[27]采用三相分離和凝膠色譜對(duì)α-半乳糖苷酶進(jìn)行純化,其結(jié)果顯示α-半乳糖苷酶經(jīng)三相分離后純化倍數(shù)達(dá)到21.6,經(jīng)Sephadex G-100 凝膠過濾色譜分離后純化倍數(shù)達(dá)到54.8,但經(jīng)凝膠過濾色譜分離后回收率僅為27.3%;Nkya 等[9]對(duì)菊科植物茼蒿(Chrysanthemum coronariumL.)中的PPO 進(jìn)行了分離純化,采用硫酸銨分級(jí)分離、離子交換色譜、疏水色譜和凝膠過濾色譜分離后,茼蒿PPO 的純化倍數(shù)為32,回收率為16%。由此可見三相分離對(duì)酶的純化屬于初級(jí)純化,純化倍數(shù)不高,但該法回收率高,具有經(jīng)濟(jì)、快速的優(yōu)點(diǎn),可以大規(guī)模使用。

    2.5 滁菊PPO 酶學(xué)特性分析

    2.5.1 pH 值對(duì)滁菊PPO 活性的影響 由圖4 可見,滁菊PPO 對(duì)pH 值的變化較敏感,在實(shí)驗(yàn)分析的pH值5.0 ~ 9.0范圍內(nèi),滁菊PPO 的活性先增大后減小,pH 值為6.5 時(shí),滁菊PPO 活性最強(qiáng)。當(dāng)pH>7 以后,滁菊PPO 酶活顯著下降;在pH 9.0 時(shí),滁菊PPO 的殘存酶活降低至24%。由此可見,當(dāng)以鄰苯二酚為底物時(shí),其反應(yīng)的最適pH 值為6.5,與紅果枸杞PPO[28]最適pH 值一致。葡萄[29]PPO 的最適pH值為5.0,亳菊[6]和八角蓮[20]PPO 的最適pH 值均為7.0,說明不同來源的原材料的最適反應(yīng)pH 有較大差異,根據(jù)滁菊PPO 的性質(zhì)特點(diǎn),可以加入抗壞血酸等有機(jī)酸抑制PPO 引起的酶促褐變。

    圖4 pH 值對(duì)滁菊PPO 酶活性的影響Figure 4 Effect of pH on enzyme activity of Chuju PPO

    2.5.2 溫度對(duì)滁菊PPO 活性的影響 由圖5 可知,在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的溫度范圍內(nèi)(20 ~ 80 ℃),滁菊PPO活力總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。在30 ℃時(shí)酶活最大,為787 U·g-1;當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí),酶活開始下降,當(dāng)反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí),滁菊PPO 活性僅為30 ℃時(shí)的18.96%。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因是因?yàn)闇囟葘?duì)酶的雙重作用,適當(dāng)?shù)纳郎厥狗肿娱g運(yùn)動(dòng)加劇,加快反應(yīng)速率,促進(jìn)酶促反應(yīng),但溫度過高會(huì)使酶活性部位構(gòu)象變化從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活。因此,滁菊PPO 的最適反應(yīng)溫度是30 ℃,與八角蓮PPO[20]等一致,與紅果枸杞[28](36 ~ 40 ℃)、水蜜桃[30](40 ℃)、蓮子[31](20 ℃)等最適反應(yīng)溫度有一定差異。

    圖5 溫度對(duì)滁菊PPO 酶活性的影響Figure 5 Effect of temperature on enzyme activity of Chuju PPO

    2.5.3 底物濃度對(duì)滁菊PPO 的影響 PPO 酶促褐變形成的物質(zhì)基礎(chǔ)有底物(酚類)、酶蛋白和氧氣。多項(xiàng)研究表明,鄰苯二酚是PPO 的最適底物。在本試驗(yàn)中,研究了鄰苯二酚底物濃度變化對(duì)滁菊PPO活性的影響。由圖6 可知,當(dāng)滁菊PPO 濃度一定時(shí),底物濃度小于0.35 mol·L-1時(shí),PPO 催化酶活隨著底物濃度的增加而升高,反應(yīng)速率與底物濃度正相關(guān);當(dāng)濃度高于0.35 mol·L-1,PPO 活性不增加反而有緩慢降低的趨勢(shì)。其原因可能是當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí),酶蛋白只有其中的一小部分參加酶促反應(yīng),隨著底物濃度的增加,酶與底物的結(jié)合率提高;在底物濃度達(dá)到一定值后,所有酶分子的活性部位都與底物結(jié)合,此時(shí)酶分子被底物飽和,繼續(xù)增加底物濃度也不能提高酶的活性,這時(shí)的反應(yīng)速率達(dá)到最大值。

    圖6 底物濃度對(duì)滁菊PPO 活性的影響Figure 6 Effect of substrate concentration on enzyme activity of Chuju PPO

    依據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程,對(duì)滁菊PPO反應(yīng)初速度和酶活性用雙倒數(shù)作圖法作圖,可以得到一擬合曲線(圖7)。由圖7 可知,以鄰苯二酚作為滁菊PPO 的反應(yīng)底物時(shí),其反應(yīng)符合米氏方程,根據(jù)圖中直線斜率和縱軸截距,求得底物的Km和酶的最大反應(yīng)速率Vmax分別為0.174 9 mol·L-1和961.538 5 U·min-1。

    圖7 以鄰苯二酚為底物時(shí)雙倒數(shù)曲線Figure 7 Lineweaver-Burk curve of PPO using catechol as the substrate

    圖8 滁菊PPO 的熱穩(wěn)定性Figure 8 Thermal stability of Chuju PPO

    2.5.4 滁菊PPO 的熱穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了在50 ~ 70 ℃條件下處理1 ~ 25 min 后滁菊PPO 的熱穩(wěn)定性。由圖8 可知,在各加熱溫度下,隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),滁菊PPO 活性均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。相對(duì)于60 和70 ℃,滁菊PPO 在50 ℃時(shí)較為穩(wěn)定,該溫度下加熱25 min 仍能保持30.93%的酶活力;同樣加熱25 min,60 和70 ℃的滁菊PPO 相對(duì)活力分別為15.99%和4.54%;在70 ℃加熱條件下滁菊PPO活性顯著減小,在70 ℃條件下加熱3 min,酶活力僅剩25%,加熱10 min,酶活力僅剩7.29%。該結(jié)果為滁菊褐變的抑制提供了理論依據(jù),在滁菊采收后可以用高于60 ℃的溫度對(duì)滁菊進(jìn)行殺青處理,此時(shí)滁菊PPO 的活性會(huì)顯著下降,從而達(dá)到減輕褐變的目的。

    3 結(jié)論

    三相分離法是一種從粗酶提取液中直接分離目標(biāo)蛋白酶的有效方法。以酶活回收率和純化倍數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo),探究三相分離過程中不同pH、硫酸銨質(zhì)量濃度、提取液與叔丁醇的體積比等因素對(duì)滁菊PPO 純化效果的影響。三相分離純化滁菊PPO 的較優(yōu)工藝參數(shù)為:硫酸銨質(zhì)量濃度0.40 g·mL-1,pH 值6.0,粗提液與叔丁醇的體積比為1:1.5。在優(yōu)化工藝條件下,滁菊PPO 酶的純化倍數(shù)為4.3,酶活回收率為83.2%。從酶的熱穩(wěn)定性等方面對(duì)滁菊PPO 酶學(xué)特性進(jìn)行研究,結(jié)果表明,以鄰苯二酚為底物,其反應(yīng)的最適pH值為6.50,最適反應(yīng)溫度為30 ℃,底物最適濃度為0.35 mol·L-1,底物Km和Vmax分別為0.174 9 mol·L-1和961.538 5 U·min-1。滁菊PPO對(duì)pH 值和溫度的變化都比較敏感,在pH 值為9的條件下殘存酶活僅剩24%;70 ℃加熱3 min,殘存酶活僅剩25%,加熱10 min 殘存酶活僅剩7.29%。

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