鎘脅迫下蚯蚓(Eisenia fetida)生物標(biāo)志物的應(yīng)激響應(yīng)研究

曹志凡，冷 欣，張靖華，呂 喆，楊吉強(qiáng)，安樹青

(南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210046)

采礦、工業(yè)作業(yè)、農(nóng)業(yè)施肥和垃圾處理等人為活動(dòng)造成日益嚴(yán)重重金屬污染現(xiàn)狀[1]。2014 年的全國(guó)土壤狀況調(diào)查公報(bào)顯示鎘的點(diǎn)位超標(biāo)率位居所調(diào)查的8 種重金屬第一位，且耕地、林地、草地等多種土地利用類型土壤中的主要污染物均包含鎘在內(nèi)[2]。由于鎘具有不易代謝、不可逆、難以監(jiān)測(cè)和表面聚集的特性，通過(guò)食物鏈鎘逐步在生物體內(nèi)富集。富集的鎘破壞生物體細(xì)胞結(jié)構(gòu)并造成氧化應(yīng)激[3]，具有致突變性和致癌性[4]，還干擾細(xì)胞正常的DNA 的修復(fù)機(jī)制[5]。近年來(lái)，國(guó)際組織和國(guó)內(nèi)環(huán)境保護(hù)部門已達(dá)成共識(shí)，僅監(jiān)測(cè)重金屬含量并不能預(yù)測(cè)有害物質(zhì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的實(shí)際影響，因此關(guān)于污染土壤生態(tài)安全評(píng)價(jià)與風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的研究在世界范圍廣受關(guān)注，建立土壤生物預(yù)警風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)體系具有重要的意義[6]。

作為自然界中最古老的生物之一，蚯蚓已經(jīng)存在了6 億年。大多數(shù)陸地環(huán)境中，蚯蚓在維持土壤的基本特性以及肥力和生產(chǎn)力方面起著至關(guān)重要的作用。蚯蚓生活在食物鏈的底部，對(duì)污染物具有一定的耐受性[7]，由于與土壤的強(qiáng)相互作用以及對(duì)大多數(shù)污染物的敏感性，蚯蚓被廣泛用作陸地生態(tài)毒理學(xué)研究，并已被視為受污染土壤的指示動(dòng)物[8]。

近年來(lái)，眾多學(xué)者使用細(xì)胞和分子水平的生物標(biāo)志物作為污染物暴露和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)的重要評(píng)估指標(biāo)，并建立了各種類型的參數(shù)模型，用以整合不同層次上的生物標(biāo)記物信息[9]。IBR 和BRI 是其中兩類代表性的模型[4,9]。IBR 方法基于星狀圖，其可靠性高度依賴于生物標(biāo)志物的選擇和排列順序。由于不需要絕對(duì)控制或參照組，IBR 方法常用于野外調(diào)研[10]。BRI 依賴于對(duì)照控制，通過(guò)計(jì)算處理組生物標(biāo)志物的偏離程度來(lái)實(shí)現(xiàn)模型構(gòu)建[11]。為了比較分析兩種模型的優(yōu)缺點(diǎn)及各自的適用性，本實(shí)驗(yàn)將其用于鎘污染下蚯蚓的生態(tài)毒理研究。

實(shí)驗(yàn)中，蚯蚓(Eisenia fetida)暴露于添加重金屬鎘的人工土壤中30 d。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)算表征蚯蚓種群生長(zhǎng)繁殖指標(biāo)的日增重倍數(shù)和日增殖倍數(shù)，并測(cè)定多種生化指標(biāo)，主要包括能源有機(jī)物（糖原和可溶性蛋白含量），抗氧化酶（過(guò)氧化氫酶，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活性），脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物（丙二醛含量），金屬結(jié)合蛋白（金屬硫蛋白含量）。研究目的如下：（1）分析鎘脅迫下蚯蚓各種生物標(biāo)志物的響應(yīng)規(guī)律；（2）建立綜合指數(shù)模型，整合生物標(biāo)志物信息，綜合評(píng)價(jià)土壤污染狀況和環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。（3）比較BRI 及IBR 兩類模型，分析優(yōu)缺點(diǎn)及各自適用范圍，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)想利用生物標(biāo)志物進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

供試試劑：CdCl2·5H2O 試劑，分析純規(guī)格；泥炭土；高嶺土（Al2(Si2O5)(OH)4），分析純規(guī)格；石英砂（主要成分為SiO2）。

供試蚯蚓：蚯蚓選取OECD 在蚯蚓毒性實(shí)驗(yàn)和繁殖實(shí)驗(yàn)中使用的赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)[12-13]。購(gòu)買的蚯蚓在人工土壤中預(yù)培養(yǎng)一周以適應(yīng)室內(nèi)環(huán)境，培養(yǎng)室溫度25 ℃，培養(yǎng)土含水率40%。選取健康成熟、環(huán)帶明顯、蟲齡2 個(gè)月以上且體重超200 mg的蚯蚓為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

供試土壤：人工土壤按照OECD 制定的準(zhǔn)則配制，包含以下成分：10%泥炭土（風(fēng)干，2 mm 篩分，無(wú)肉眼可見植物殘?bào)w）；20%高嶺土（高嶺石含量在30 %以上）；70%石英砂（風(fēng)干200 目篩分；混合均勻后，用CaCO3調(diào)節(jié)pH 至6 左右）[12-13]。使用去離子水將人工土壤的含水量調(diào)節(jié)到約40%。

1.2 微宇宙實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)開始前，用去離子水清洗蚯蚓，放置在浸濕的濾紙上，黑暗條件下清腸24 h，清除腸道內(nèi)的雜物。將經(jīng)過(guò)腸道清潔處理的蚯蚓清洗干凈，并用濾紙擦干后挑取實(shí)驗(yàn)蚯蚓用于人工土壤微宇宙實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB 15618-2018）》[14]將微宇宙實(shí)驗(yàn)中重金屬Cd2+濃度梯度設(shè)定為0 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1, 1 mg·kg-1和10 mg·kg-1。所選的培養(yǎng)箱為的圓柱形玻璃器皿（40 cm×90 cm），每個(gè)培養(yǎng)箱中加入1 kg 的人工土壤，將CdCl2·5H2O 用去離子水溶解后均勻噴灑到人工土壤中，達(dá)到預(yù)設(shè)濃度，在室溫下放置48 h 以上，待金屬溶液完全浸入土壤中，向人工土壤中加入少量的去離子水，使土壤含水率達(dá)到40%左右。選擇30 條經(jīng)過(guò)清腸處理的蚯蚓，用分析天平稱重，然后置于培養(yǎng)箱中人工土壤表面，待其主動(dòng)進(jìn)入土壤。將培養(yǎng)箱放置在恒溫培養(yǎng)室（25 ℃）中30 d，在此期間通過(guò)添加去離子水保持土壤含水率在40%左右。為每種重金屬處理濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.2.2 樣品采集與生物標(biāo)志物測(cè)定 培養(yǎng)30 d 后，取出蚯蚓，觀察蚯蚓生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)各處理組中蚯蚓數(shù)量。清腸后，用分析天平稱重各處理組的蚯蚓，計(jì)算蚯蚓的日增重倍數(shù)和日增殖倍數(shù)[15]：

日增重倍數(shù)=(培養(yǎng)一段時(shí)間后蚯蚓生物量－初始蚯蚓生物量)/(初始蚯蚓生物量×培養(yǎng)時(shí)間)（a）

日增殖倍數(shù)=(培養(yǎng)一段時(shí)間后蚯蚓總數(shù)量－初始蚯蚓數(shù)量)/(初始蚯蚓數(shù)量×培養(yǎng)時(shí)間)（b）

樣本儲(chǔ)存于—70 ℃冰箱中以待測(cè)。測(cè)定時(shí)，各處理組樣品分別加入100 mL PBS緩沖液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 1.54 g，蒸餾水定容至100 mL），樣品在冰水浴條件下人工充分研磨成勻漿液， 4 ℃、3 000 r·min-1離心20 min 后，取上清液，生化指標(biāo)的測(cè)定方法如表1 所示。

表1 生化指標(biāo)測(cè)定方法Table 1 Determination methods of biochemical indexes

1.3 綜合指數(shù)模型

為了更好地解釋重金屬脅迫下蚯蚓生物標(biāo)志物信息，使用Hagger 等建立的生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)及Beliaeff 等建立的綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)不同濃度重金屬鎘下生物所受的環(huán)境污染壓力[11,23]。

1.3.1 生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù) BRI 具體的計(jì)算方法如下：

首先定義一個(gè)數(shù)值R表示實(shí)驗(yàn)組中生物標(biāo)志物與對(duì)照組的偏離度，當(dāng)有輕微改變（R＜20%）、中等改變（20%≤R＜50%）、較大改變（50%≤R＜100%）、嚴(yán)重改變（R≥100%）時(shí)，指定值為4、3、2、1；同時(shí)，生物標(biāo)志物根據(jù)其組織生理水平及重要性，賦予相應(yīng)權(quán)重（W）。根據(jù)Piva 等人的建議[24]，并結(jié)合Hagger 等在不同生物組織水平上對(duì)生物標(biāo)志物的賦值[11]，通常將1.0 的權(quán)重分配給因污染暴露而直接響應(yīng)的生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物不一定表征毒性反應(yīng)的開始，包括MT、抗氧化酶（SOD、CAT、GST）和能量指標(biāo)（Gn、SP）；將1.2 的權(quán)重分配給生物體受脅迫下的有害代謝產(chǎn)物，包括MDA；將3.0 的權(quán)重分配給生理終點(diǎn)指標(biāo)，如生長(zhǎng)繁殖（日增重倍數(shù)、日增殖倍數(shù)）。然后根據(jù)下面的公式計(jì)算BRI，得到的BRI值在0～4 之間，對(duì)應(yīng)的生物健康狀態(tài)等級(jí)如表2 所示。

其中:Bt和Bc分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的生物標(biāo)志物的活性或者含量，Si和Wi分別為第i種生物標(biāo)志物的指定值和權(quán)重。

1.3.2 綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù) 綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)的計(jì)算方法如下：

（1）均一化。對(duì)于每一種生物標(biāo)志物，首先計(jì)算其在各實(shí)驗(yàn)組測(cè)定結(jié)果的平均值mi，以及該種生物標(biāo)志物的在所有組中總的平均值M與標(biāo)準(zhǔn)差S。然后對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的mi按下式進(jìn)行均一化處理，式中Yi為mi經(jīng)過(guò)均一化處理后的數(shù)值。

表2 基于生物標(biāo)記物響應(yīng)指數(shù)的生物脅迫等級(jí)劃分[11]Table 2 Classification of biological stress levels based on biomarker response index

（2）賦值。定義數(shù)值Zi，如果與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組的生物標(biāo)志物被激活，則Zi=Yi，反之Zi= -Yi。定義 |Ymin| 為 所有實(shí)驗(yàn)組中均一化數(shù)值最小值的絕對(duì)值，則每一實(shí)驗(yàn)組該種生物標(biāo)志物的得分Bi如下：

（3）繪制IBR 星狀圖并計(jì)算面積。繪制正九邊形星狀圖，將各實(shí)驗(yàn)組中9 種生物標(biāo)志物的得分Bi以星狀圖中輻射線的長(zhǎng)度來(lái)表示，連接九條輻射線末端所圍成的面積即IBR的數(shù)值，設(shè)相鄰兩條輻射線所圍成的三角形的面積為Ai，則：

由于9 種生物標(biāo)志物在星狀圖中的排列順序會(huì)影響IBR的計(jì)算結(jié)果，因此本研究中考慮了9 種生物標(biāo)志物的全部排序，并計(jì)算20 160 種IBR 值的平均值作為最終值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SigmaPlot 12.5 軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表處理，采取單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan 多重比較法對(duì)不同處理間的差異性進(jìn)行顯著性分析（R 3.5.1），以P＜0.05 作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 日增殖倍數(shù)和日增重倍數(shù)

隨著重金屬鎘濃度的增加，各處理組蚯蚓的生長(zhǎng)繁殖指標(biāo)均受到抑制（圖1）。在鎘濃度為0.1 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓的日增重倍數(shù)顯著降低（P＜0.05），而鎘濃度為1 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓的日增殖倍數(shù)才發(fā)生顯著改變（P＜0.05），表明鎘對(duì)蚯蚓繁殖的抑制作用滯后于對(duì)蚯蚓生長(zhǎng)的抑制作用。當(dāng)鎘濃度為10 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓的日增殖倍數(shù)和日增重倍數(shù)均最低，此時(shí)蚯蚓的日增重倍數(shù)接近于0，表明蚯蚓種群在一定程度的重金屬環(huán)境壓力下已停止增重。

圖1 蚯蚓的日增殖倍數(shù)和日增重倍數(shù)Figure 1 Daily proliferation rate and daily weight increment rate of earthworm

圖2 蚯蚓的各種生化指標(biāo)Figure 2 Biochemical indexes of earthworm

圖3 生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)及綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)Figure 3 Biomarker response index and integrated biomarker response index

2.2 生化指標(biāo)

圖2 顯示了測(cè)定的各種生化指標(biāo)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的糖原含量顯著降低（P＜0.05），可溶性蛋白質(zhì)的含量顯著增加（P＜0.05）；隨著鎘濃度的升高，蚯蚓體內(nèi)SOD 酶的活性先升高后降低，在0.1 mg·kg-1的鎘濃度下達(dá)到最大值（P＜0.05）；而MDA的含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在10 mg·kg-1鎘處理的實(shí)驗(yàn)組中達(dá)到最大值（P＜0.05），CAT 酶、GST 酶的活性和MT 的含量隨鎘濃度升高均顯著提升（P＜0.05）。

2.3 綜合指數(shù)模型

隨著鎘暴露濃度的增加，BRI 呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。當(dāng)鎘濃度為0.1 mg·kg-1、1 mg·kg-1和10 mg·kg-1時(shí)，BRI 分別為3.39、2.70 和2.33，表明蚯蚓在不同重金屬濃度下分別面臨著輕度脅迫、較大脅迫和嚴(yán)重脅迫。

圖3（a）中輻射線的長(zhǎng)度反映各種生物標(biāo)志物在實(shí)驗(yàn)組間的差異，在各實(shí)驗(yàn)組間差異較大的生物標(biāo)志物有日增殖倍數(shù)、CAT、GST 和MT。星狀圖的面積即IBR 數(shù)值與生物體所受的污染壓力正相關(guān)[9,23,25]。隨著鎘暴露濃度的增加，IBR 呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。當(dāng)鎘濃度為0.1、1 和10 mg·kg-1時(shí)，IBR分別為3.71、7.94 和13.41，表明環(huán)境脅迫效應(yīng)隨著鎘濃度增加而加強(qiáng)（圖3（b））。

3 討論與結(jié)論

蚯蚓攝取有機(jī)物后，通過(guò)腸道與土壤中的污染物接觸。重金屬被攝入后經(jīng)過(guò)擴(kuò)散、遷移、轉(zhuǎn)化和排泄等復(fù)雜的代謝解毒途徑排出體外。然而，相當(dāng)一部分的重金屬仍然在體內(nèi)積累，造成多層級(jí)的生物毒性效應(yīng)。蚯蚓的生物毒性效應(yīng)首先發(fā)生在分子水平，通過(guò)級(jí)聯(lián)模式逐步體現(xiàn)在組織、器官、個(gè)體及種群等水平[26-27]。

3.1 日增殖倍數(shù)和日增重倍數(shù)

蚯蚓的生長(zhǎng)和繁殖指標(biāo)對(duì)重金屬脅迫非常敏感[28]，研究這些指標(biāo)有助于評(píng)價(jià)重金屬的毒性作用。日增重倍數(shù)和日增殖倍數(shù)可以分別表征蚯蚓種群的生長(zhǎng)和繁殖指標(biāo)[15]。研究發(fā)現(xiàn)在高濃度重金屬的脅迫下，蚯蚓種群的生長(zhǎng)繁殖顯著減緩。而隨著重金屬濃度的上升，蚯蚓的生長(zhǎng)指標(biāo)表現(xiàn)出了更高的敏感性，當(dāng)鎘濃度為10 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓生長(zhǎng)趨于停滯。在高濃度鎘的影響下，蚯蚓的多個(gè)生殖器官如環(huán)帶可能受到損傷，進(jìn)而降低其繁殖水平。研究表明多種有機(jī)污染物和重金屬都能造成蚯蚓生殖器官不同程度的損傷，從而影響蚯蚓的存活率、性發(fā)育、孵化率、產(chǎn)卵率和種群密度[28-30]；蚯蚓生長(zhǎng)率的降低可能與其在污染脅迫下的生存策略有關(guān)，即通過(guò)減少食物攝入來(lái)避免攝入物質(zhì)的毒性作用[31]，或者通過(guò)節(jié)約生長(zhǎng)所需的能量來(lái)抵抗外部環(huán)境壓力[32]。

3.2 生化指標(biāo)

重金屬被蚯蚓吸收富集后，導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子失活，影響蚯蚓正常的生理生化代謝。通過(guò)測(cè)定蚯蚓生物體的能量指標(biāo)，可以準(zhǔn)確反映蚯蚓在重金屬脅迫下的代謝活動(dòng)。Beaumelle 等人的研究表明，能量調(diào)節(jié)和調(diào)度是蚯蚓對(duì)污染壓力的一種重要抵抗機(jī)制，蚯蚓在不同的重金屬條件下會(huì)采取差異化的應(yīng)對(duì)策略[9]。本研究的結(jié)果表明鎘脅迫抑制蚯蚓的糖原指標(biāo)，促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)。糖原是生物體主要的能量來(lái)源，在高濃度鎘脅迫下，蚯蚓可能會(huì)加強(qiáng)糖原的代謝，以獲得抵御毒性作用所需的能量[33-34]；可溶性蛋白質(zhì)是滲透調(diào)節(jié)和營(yíng)養(yǎng)大分子，其含量的增加有助于蚯蚓在壓力環(huán)境中維持正常的生理平衡。高濃度鎘可能誘導(dǎo)一些功能性蛋白質(zhì)的合成，這些功能性蛋白可以結(jié)合或代謝重金屬以降低鎘的毒性作用[7,35]。

當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)起到清除過(guò)量自由基的作用，避免應(yīng)激因素對(duì)機(jī)體的過(guò)度損傷。GST、SOD 和CAT 是抗氧化酶系統(tǒng)中的3種關(guān)鍵性酶，廣泛分布于生物體內(nèi)。它們的活性指標(biāo)常被用作指示土壤污染的生物標(biāo)志物[36-37]。SOD是首先與活性氧自由基反應(yīng)的特效酶，生成H2O2中間產(chǎn)物，CAT 可以催化H2O2生成無(wú)毒的H2O，從而降低氧化應(yīng)激壓力[38]。GST 能清除細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化物和活性氧，其所攜帶的谷胱甘肽可與多種自由基和重金屬離子結(jié)合，在抗氧化過(guò)程中起著重要作用[36,39]。在低濃度鎘暴露下，SOD 活性顯著升高，表明鎘誘導(dǎo)蚯蚓機(jī)體產(chǎn)生活性氧自由基，觸發(fā)SOD 的抗氧化防御機(jī)制[35]，然而，隨著鎘暴露濃度升高，脅迫進(jìn)一步加強(qiáng)，SOD 活性降低，這可能是由于毒性反應(yīng)積累的大量活性自由基導(dǎo)致細(xì)胞正常代謝紊亂，從而抑制了SOD 的活性，該假設(shè)也在多篇文獻(xiàn)中得到了證實(shí)[37,39-41]；在實(shí)驗(yàn)組中，CAT和GST 都表現(xiàn)出較大的偏離度，其活性隨著重金屬濃度的升高顯著增強(qiáng)，是抗氧化酶體系中最敏感的生物標(biāo)志物。結(jié)果表明，在重金屬的脅迫下，細(xì)胞產(chǎn)生的自由基導(dǎo)致了中間產(chǎn)物過(guò)氧化氫和過(guò)氧化脂質(zhì)的積累，誘導(dǎo)CAT 和GST 的活性增強(qiáng)[25-42]；生物標(biāo)志物MDA 可以顯示脂質(zhì)過(guò)氧化水平。作為自由基作用于脂質(zhì)過(guò)氧化的次生代謝物，其含量反映蚯蚓在逆境中的氧化應(yīng)激程度[38-39]。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鎘暴露下（0.1 mg·kg-1，1 mg·kg-1）MDA 的含量較對(duì)照組下降，這可能是由于低濃度的鎘誘導(dǎo)金屬硫蛋白和抗氧化酶等表達(dá)，這些關(guān)鍵功能蛋白可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基的攻擊，使其維持低脂質(zhì)過(guò)氧化水平[36]，鎘濃度升高至10 mg·kg-1，MDA 含量高于對(duì)照組，表明應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的自由基超已出蚯蚓自身的代謝能力，導(dǎo)致生物膜的過(guò)氧化[43]。MT是一種富含巰基、低分子量的金屬結(jié)合蛋白，能螯合重金屬并將其排出體外，保持體內(nèi)重金屬含量的穩(wěn)定[44]。鎘暴露可誘導(dǎo)MT 合成，隨著鎘暴露濃度的提高，蚯蚓體內(nèi)MT 含量有所上升，與對(duì)照組的偏離度逐漸增加，表明MT 是蚯蚓抵抗重金屬毒害作用的重要蛋白，同時(shí)也是一種能指示環(huán)境重金屬壓力的敏感生物標(biāo)志物。

3.3 綜合指數(shù)模型

蚯蚓的多種生理指標(biāo)對(duì)重金屬有復(fù)雜的響應(yīng)，其中一些指標(biāo)表現(xiàn)出不規(guī)則的變化趨勢(shì)，綜合指數(shù)模型的構(gòu)建避免了單一生物標(biāo)志物波動(dòng)的不可預(yù)見性，綜合評(píng)價(jià)3 種重金屬濃度下蚯蚓所面臨的環(huán)境壓力[11,23]。BRI 和IBR 的計(jì)算結(jié)果均顯示，環(huán)境脅迫效應(yīng)隨著鎘濃度增加而加強(qiáng)。BRI 還反映在3 種不同濃度的鎘暴露下蚯蚓分別面臨著輕度脅迫、較大脅迫和嚴(yán)重脅迫。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種指數(shù)可以有效地將復(fù)雜的生物標(biāo)志物響應(yīng)整合成單一的生物健康和環(huán)境評(píng)價(jià)質(zhì)量參數(shù)。早期的研究大多僅使用以生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)的綜合指數(shù)評(píng)估野外環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[45]，而本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新地將兩者應(yīng)用在指示生物的室內(nèi)生態(tài)毒理研究中。然而相較于BRI，IBR 在本實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)出了如下缺點(diǎn)：（1）IBR 的計(jì)算方法比較復(fù)雜，星狀圖構(gòu)建高度依賴于各種生物標(biāo)志物的排序，9 種生物標(biāo)志物的在星狀圖上的排序有20 160 種之多，而BRI 直觀簡(jiǎn)單，不需要考慮生物標(biāo)志物的排序；（2）IBR 不對(duì)各類生物標(biāo)志物分配權(quán)重，鑒于星狀圖面積的運(yùn)算方法，當(dāng)生物標(biāo)志物的數(shù)量較少時(shí)，個(gè)別生物標(biāo)志物的波動(dòng)會(huì)給IBR 的計(jì)算值帶來(lái)很大的影響。而BRI 可以通過(guò)給敏感性生物標(biāo)志物分配較高的權(quán)重，避免生物標(biāo)志物種類較少時(shí)的評(píng)估偏差；（3）IBR 運(yùn)算過(guò)程中不考慮對(duì)照組的參照作用，無(wú)法實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組之間的橫向比較，因此IBR 更適用于野外環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。BRI 實(shí)現(xiàn)了對(duì)照控制，通過(guò)室內(nèi)對(duì)照組及野外清潔站點(diǎn)的設(shè)置可以推廣其適用范圍。此外BRI 還對(duì)污染風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行了定性劃分，便于歸類環(huán)境脅迫等級(jí)。通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)比較不同污染類型下生物標(biāo)志物的敏感程度，從而篩選監(jiān)測(cè)該種污染物的理想生物標(biāo)志物類型并合理分配權(quán)重，BRI可以直觀、準(zhǔn)確地評(píng)估生物體在個(gè)體、生理生化、分子等不同層級(jí)上對(duì)污染壓力的響應(yīng)，建立生物標(biāo)志物與污染脅迫的對(duì)應(yīng)關(guān)系[46]。

綜上所述，本研究通過(guò)室內(nèi)微宇宙實(shí)驗(yàn)分析多項(xiàng)生物標(biāo)志物在重金屬脅迫下的響應(yīng)規(guī)律，利用綜合指數(shù)模型整合生物標(biāo)志物信息，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果、結(jié)論為環(huán)境土壤鎘污染的早期預(yù)警和后期評(píng)估提供理論基礎(chǔ)。在兩類綜合指數(shù)模型中， BRI 有著更為突出的優(yōu)勢(shì)和更廣的適用范圍。隨著研究的深入，未來(lái)可篩選單一及復(fù)合污染下的敏感生物標(biāo)志物，并嘗試確定各污染情境下的理想生物標(biāo)志物類型及其權(quán)重，細(xì)化脅迫等級(jí)的劃分，建立一個(gè)更為精確的生物標(biāo)志物—污染脅迫程度對(duì)應(yīng)模型，指示野外土壤環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。

鎘對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)繁殖具有顯著的抑制作用，作用效果因重金屬濃度的提升而加劇，且生物量增長(zhǎng)指標(biāo)更為敏感。

隨著環(huán)境中鎘濃度的升高， SP、CAT、MT 和GST 的含量或活性顯著提升，而MDA、Gn 的含量先增后減，SOD 的活性先升后降，表現(xiàn)出不規(guī)則的變化趨勢(shì)。綜合指數(shù)模型BRI 和IBR 均表明環(huán)境脅迫效應(yīng)隨著鎘濃度的增加而提升，此外，BRI 顯示重金屬鎘濃度為0.1、1 和10 mg·kg-1時(shí)，蚯蚓分別面臨著輕度脅迫、較大脅迫和嚴(yán)重脅迫。