棘孢木霉M45a 的定殖能力及其對水稻促生作用研究

張 屹，何 英，肖姬玲，魏 林，田 云，梁志懷*

(1. 湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，長沙 410125；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；3. 湖南省植物保護(hù)研究所，長沙 410125)

木霉菌（Trichodermaspp.）能廣泛存在于土壤和植物組織中，具有適應(yīng)性強、生長繁殖快等特點[1]，能和植物體形成共生，具有誘導(dǎo)植物抗性和促進(jìn)植物生長的作用[2-3]。因此，許多木霉菌已被成功開發(fā)為微生物肥料和微生物農(nóng)藥，形成巨大的市場應(yīng)用前景[4]。

目前，木霉菌已經(jīng)被證明對玉米、小麥、黃瓜和花生等旱地栽培作物的生長具有明顯促進(jìn)作用，對作物根系的促生效果更為顯著[5-9]。水稻作為重要的糧食作物，李松鵬等[2]報道哈茨木霉菌株3S1-13和4S2-46 發(fā)酵液處理后的水稻種子發(fā)芽率和幼苗的根系、鮮重均顯著高于對照，顯示出有利于促進(jìn)種子發(fā)芽與生長的作用。同時大量研究也表明，木霉菌具有很強的根際定殖能力，在土壤及根系表面快速生長，并能伴隨根系的生長而拓展[10-11]。而李進(jìn)一等[12]利用植物組織培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)短密木霉新菌株BF06 可以迅速附著定殖于黃瓜根部表面，顯著地促進(jìn)幼苗黃瓜側(cè)根的形成和生長。

雖然關(guān)于高效生防與促生的木霉菌劑及其機制報道比較多，但是木霉菌在水稻根系中的定殖規(guī)律及田間施用促生效果還鮮見報道。前期實驗室通過EMS 誘變技術(shù)獲得一株具有惡霉靈耐性和拮抗作用的棘孢木霉（Trichoderma asperellumM45a）M45a，研究表明其分生孢子懸浮液對水稻幼苗有顯著的促生長作用。因此，本研究利用棘孢木霉M45a對水稻的處理以及定殖效果，進(jìn)一步驗證其對水稻田間的促生作用，指導(dǎo)木霉菌劑產(chǎn)業(yè)化和制定科學(xué)田間施用技術(shù)，以期為開發(fā)棘孢木霉菌肥及減少水稻種植中化肥施用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株與水稻品種 供試菌株棘孢木霉M45a 以及含GFP 基因標(biāo)記菌株M45a-GFP，由湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供；供試水稻種子Y 兩優(yōu)2 號，由國家雜交水稻研究中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基包括新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g 和水1 L，pH 自然；PD 液體培養(yǎng)基為不加瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 棘孢木霉M45a 孢子懸浮液的制備 將保存的棘孢木霉菌株活化，PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，在無菌條件下，加無菌水制成分生孢子懸浮液原液，4層滅菌的擦鏡紙過濾并渦旋震蕩，血球計數(shù)板計數(shù)調(diào)整濃度為1×105cfu·mL-1孢子液。

1.2.2 棘孢木霉M45a 在水稻根系的定殖 采用浸種處理方式接種GFP 標(biāo)記菌株M45a-GFP，出芽后播種于滅菌沙土中，28 ℃，14 h 光照和25 ℃，10 h 黑暗交替培養(yǎng)。其中移栽7 d 期間，每隔 24 h 取水稻根系組織，徒手切片，以激光共聚焦掃描顯微鏡觀察菌株在水稻根系中的定殖情況。

1.2.3 棘孢木霉M45a 的盆栽促生效果 選取150粒飽滿一致的水稻種子置于55℃溫水中浸泡18 h，置于1×105cfu·mL-1M45a 的孢子懸浮液或者清水溶液中浸泡5 h；將浸種后的種子，用蒸餾水沖洗3次后，均勻置于墊有3 層濾紙的培養(yǎng)皿中（直徑10 cm），5 mL 上述M45a 孢懸液或者清水噴撒種子。28℃條件下催芽后，播于含15 kg 水稻田土壤移栽盆中，每盆30 粒，30 d 后取苗，測量其株高、根長、分蘗數(shù)、總株鮮質(zhì)量和總株干質(zhì)量，3 次重復(fù)。具體處理如表1。

1.2.4 棘孢木霉M45a 浸種對水稻田間促生效果

（1） 研究區(qū)域概況。試驗于2019 年在湖南省黃興鎮(zhèn)試驗田進(jìn)行。試驗地點屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，年平均氣溫 17.7°C，無霜期為 282 d，全年平均雨量 1 587 mm，最高和最低月平均氣溫分別為7 月（29.8°C）和 1 月（5.1°C）。

表1 水稻種子不同處理方式情況Table 1 Different treatments of rice seeds

（2）試驗設(shè)計。試驗共設(shè)2 個處理，其中浸種處理參照1.2.3 方案，以清水為空白對照，采取水稻種子直播方式撒播于小區(qū)地，每個處理設(shè)置 3 次重復(fù)，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積 20 m2；各小區(qū)間使用隔水板隔開，隔水板置于泥土底下深埋高度為 40 cm，置于地面起壟高度為20 cm，以達(dá)到小區(qū)相對獨立的環(huán)境；另外，田間小區(qū)的水分、植保、施肥等管理措施與當(dāng)?shù)剞r(nóng)民習(xí)慣保持一致。

（3）植物樣品采集與測定。利用5 點取樣法分別取水稻分蘗期（生長30 d、40 d 和50 d）10 株成苗和根際土壤樣品，測量其株高、地上部分鮮（干）質(zhì)量和根際土壤氮含量；對成熟期水稻測量其單株穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量等產(chǎn)量指標(biāo)。

土壤總氮含量采用重鉻酸鉀-硫酸消化法測定[13]，土壤硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量分別采用酚二磺酸比色法、 KCl 浸提-靛酚藍(lán)比色法測定[14]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007 進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計算；采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌M45a 在水稻根系中的定殖

通過取樣切片熒光顯微觀察，在接種M45a-GFP 后的1 d，M45a-GFP 的孢子能穩(wěn)定聚集在根表皮，見圖 1（a）；3 d 后，GFP 標(biāo)記菌株孢子萌發(fā)菌絲，附著于水稻根表皮，見圖 1（b），同時部分菌絲穿透皮層細(xì)胞在主根韌皮部定殖，見圖1（c）；7 d 后，侵入側(cè)根表層，進(jìn)入維管束和細(xì)胞間隙，并能在水稻根系中定殖、產(chǎn)孢，見圖1（d）。從15 d 到30 d 后，水稻根系組織中仍然可以觀察到綠色熒光菌絲。上述結(jié)果表明，通過水稻浸種接種，GFP 標(biāo)記的木霉菌株能夠在水稻根系組織中定殖。

圖1 GFP 標(biāo)記菌株M45a-GFP 在水稻根系中的定殖Figure 1 Colonization of the GFP labelled strain M45a-GFP in the rice roots

2.2 M45a 不同施用方式對盆栽水稻苗期的影響

由表1 可知，不同處理的植株均健康生長，接種M45a 的水稻植株生物量高于清水處理（對照）。與對照相比，經(jīng)過M45a 浸種處理的水稻植株，其根長、株高、分蘗數(shù)、總株鮮質(zhì)量和總株干質(zhì)量分別增加了 29.3%、16.5%、160.36%、114.29%和140.7%，呈差異顯著；而棘孢木霉M45a 拌種處理的水稻植株與對照沒有形成顯著性差異。因此，選擇M45a 孢子濃度 1×105cfu·mL-1浸種為水稻合適的處理方式。

2.3 M45a 浸種對大田水稻生長的影響

進(jìn)一步分析M45a 浸種對大田水稻生長的影響（圖2），結(jié)果顯示，在不同生長時期， M45a 浸種處理的水稻植株生物量稍高于空白對照；特別是在水稻生長50 d （T3）時，與對照相比，M45a 浸種處理的水稻植株在株高、地上部鮮質(zhì)量及地上部干質(zhì)量方面分別增加8.1%、23.3%和10.0%。因此，說明接種M45a 水稻植株與對照相比，在生長的各方面都有顯著的促生優(yōu)勢。

2.4 M45a 浸種對大田水稻根際土壤氮含量的影響

與對照比較，M45a 對水稻根際土壤氮含量及氮轉(zhuǎn)化有著一定促進(jìn)作用。在水稻播種40 d（T2），水稻根際土壤中總氮含量和硝態(tài)氮含量達(dá)到了顯著差異，分別提高了16.8%和25.75%，為水稻分蘗最為旺盛的前中期提供足夠的氮素；而到分蘗后期（T3），M45a 水稻根際土壤中總氮含量和硝態(tài)氮分別提高了14.92%和22.34%，依然保持較高的土壤氮素含量，持續(xù)誘導(dǎo)分蘗產(chǎn)生（圖3）。

表2 不同處理下棘孢木霉對水稻幼苗生長的影響Table 2 The growth of rice in seedling under different treatments of Trichoderma asperellum

圖2 M45a 浸種對大田水稻生長的影響Figure 2 The rice growth of germinated seeds by M45a in field

圖3 M45a 浸種對水稻根際土壤氮含量的影響Figure 3 The nitrogen contents of rhizosphere soil of germinated seeds by M45a in field

表3 M45a 浸種對大田水稻產(chǎn)量指標(biāo)的影響Table 3 Effect of rice yield index of germinated seeds by M45a in field

2.5 M45a 浸種對大田水稻產(chǎn)量指標(biāo)的影響

從表 3 可看出，M45a 浸種顯著提高了水稻單穗穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量，但有效穗數(shù)的差異不顯著。與CK 處理相比，穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量促進(jìn)率分別在9.88%和5.15%以上。本試驗利用棘孢木霉M45a 浸種處理提高了每穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量；與此同時也提高根際土壤氮含量在一定程度上影響水稻的產(chǎn)量指標(biāo)。

3 討論

木霉菌（Trichodermaspp.）是國際上應(yīng)用非常普遍的生防真菌，除用于防治各類植物的土傳病害和部分葉部和穗部病害，增強植物抗逆性和修復(fù)農(nóng)化污染的環(huán)境。目前，國內(nèi)在木霉菌對植物促生作用方面的研究比較多，哈茨木霉[15]、長枝木霉[16]和鉤狀木霉[17]等均對作物有一定的促生作用。前期研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉TUV-13 能在水稻秧苗的根、莖和葉中穩(wěn)定定殖和提高水稻抗紋枯病作用[18]。因此，本研究進(jìn)一步利用篩選出耐藥性好的生防棘孢木霉M45a 以探討對水稻的促生效應(yīng)，結(jié)果顯示M45a 浸種水稻種子的幼苗促生效果明顯優(yōu)于拌種和對照，可以有效應(yīng)用于水稻大田生產(chǎn)中，實現(xiàn)菌肥和化肥優(yōu)勢互補，減少化肥的用量。

在自然環(huán)境下，生防微生物能否穩(wěn)定生存并有效定殖于作物各組織中是發(fā)揮其生物防效的重要條件[19]。通過綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）標(biāo)記技術(shù)能夠?qū)崟r、動態(tài)地研究微生物的空間定位、微生物與環(huán)境及宿主之間的互作[20]。已有研究報道，木霉菌能定殖于植株根部與植株共生，促進(jìn)植株生長和抗病性[21]。本研究所選用的GFP 標(biāo)記的木霉菌株M45a-GFP 能侵入水稻根系內(nèi)部并穩(wěn)定定殖，經(jīng)過7 d 后，木霉菌菌絲在水稻根系表面和組織內(nèi)部形成類網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，部分菌絲開始產(chǎn)孢。而且第30 天后仍然能看到帶綠色熒光的菌絲分布于根系周圍，這與趙興麗等[17]、田程等[22]的研究結(jié)果相一致。這說明M45a-GFP 在水稻根系組織有很好的生存能力，為棘孢木霉M45a 對生防促生作用提供了支撐。

氮肥作為僅次于水的重要影響因素，對水稻產(chǎn)量有著巨大影響。然而，有益微生物在植物根際定殖后，其分泌的次級代謝物質(zhì)可以增加其固氮、解磷和溶鉀的能力，進(jìn)而促進(jìn)植物根系生長[23]。研究表明，木霉菌通過分泌多種植物生長激素（IAA、CTK、GA3）、提高土壤養(yǎng)分利用率、增強根際定殖能力等機制來發(fā)揮促生作用[24]。其中，哈茨木霉H-13 除了可以促進(jìn)植物對N 的吸收外，還可以顯著地促進(jìn)植物對K 的吸收[25]。本研究利用M45a 浸種處理水稻種子后發(fā)現(xiàn)，水稻根際土壤中的總氮和硝態(tài)氮含量顯著提升。究其原因，初步認(rèn)為是M45a在水稻根系組織定殖后，分泌了次級代謝產(chǎn)物促進(jìn)了土壤中有機質(zhì)的分解和水稻生長，并為水稻分蘗期提供大量的速效氮源，提高水稻的生物量和產(chǎn)量。這些結(jié)果充分肯定了對棘孢木霉M45a 在水稻生產(chǎn)應(yīng)用的可行性，也為木霉菌與水稻之間的互作機制研究奠定了基礎(chǔ)。