五味子對(duì)禽源大腸桿菌臨床分離株抗生素敏感性的影響

陶 婭，江 蘇，胡婧婧，魏思敏，伯若楠*，劉明江，李金貴*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

抗生素作為飼料添加劑被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)，其在預(yù)防和治療細(xì)菌性傳染病方面發(fā)揮了巨大作用。但如今，抗生素的不合理使用使細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的問(wèn)題日益顯著[1]，并且長(zhǎng)期依靠抗生素維持畜禽健康狀態(tài)，容易引起環(huán)境和動(dòng)物性食品中出現(xiàn)抗生素殘留，從而進(jìn)一步威脅食品安全和人類(lèi)健康[2]。2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號(hào)》[3]公告，將全面禁止促生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加，因此尋找新的途徑解決細(xì)菌耐藥性變得更加迫切，越來(lái)越多的目光聚焦于中草藥。研究表明，中藥及其有效成分具有抗菌作用、毒副作用小和來(lái)源廣泛等特點(diǎn)[4]。中國(guó)藥典記載，五味子分為木蘭科五味子（Schisandra chinensisBaill.）和華中五味子（Schisandra sphenantheraRehd. et Wils.），前者稱(chēng)為北五味子，后者稱(chēng)為南五味子[5]。研究表明五味子具有抗菌、抗氧化和抗炎等多種藥理活性，對(duì)多重耐藥菌株也具有抑制作用[6-7]。本研究通過(guò)微量肉湯稀釋法檢測(cè)南北五味子水煎液?jiǎn)为?dú)或聯(lián)合抗生素對(duì)禽源臨床分離大腸桿菌（Escherichia coli）耐藥株的體外抑菌活性，明確五味子對(duì)何種抗生素具有增效抑菌作用，為五味子的臨床開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 南五味子購(gòu)自于安徽省亳州市，北五味購(gòu)自于河北省安國(guó)市，所有藥材均經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院李金貴教授鑒定。6 種畜禽常用抗生素購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司，包括恩諾沙星（enrofloxacin、ENR）、氨芐西林（ampicillin、AMP）、鏈霉素（streptomycin，STR）、頭孢噻呋（ ceftiofur，CEF）、卡那霉素（kanamycin、KAN）和多西環(huán)素（doxycycline，DOX）。細(xì)菌培養(yǎng)基均購(gòu)于青島高科園海博科技有限公司，按通用組方配制成Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基、Luria-Bertani 瓊脂培養(yǎng)基、Mueller-Hinton（MH）液體培養(yǎng)基以及麥康凱培養(yǎng)基。

1.1.2 菌株 禽源大腸桿菌臨床分離株分別命名為：E. coli0220E1-1、0313E1-1、0322J1-1、0 503J1-1、0503J4-2、0513J2-2，以上菌株由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院畜禽門(mén)診部王彥紅博士提供。標(biāo)準(zhǔn)菌株E. coliATCC 25 922 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

將E. coli從-80 ℃取出于LB 液體培養(yǎng)基復(fù)壯并增菌培養(yǎng)2～3 代，吸取菌液接種于麥康凱培養(yǎng)基保存，挑取單個(gè)菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基，在37 ℃ 搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.1.3 南、北五味子水煎液及抗生素母液的制備分別稱(chēng)取南、北五味子粗粉各100 g，加蒸餾水1 000 mL，浸泡1 h 后，加熱沸騰后持續(xù)30 min，提取3次，合并煎煮液，使用6 層紗布過(guò)濾。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200 mL，即得到生藥量0.5 g·mL-1的南五味子水煎液（SRD）和北五味子水煎液（SCFD），裝入試管中，置于-20℃冰箱保存，備用。精確稱(chēng)取各種抗生素，用各自對(duì)應(yīng)的緩沖液將抗生素配制成濃度為20 480 μg·mL-1的母液，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）的測(cè)定 采用96 孔板微量肉湯稀釋法分別測(cè)定SRD、SCD 和6 種抗生素對(duì)E. coli0220E1-1、0313E1-1、0322J1-1、0503J1-1、0503J4-2、0513J2-2以及ATCC 25922 的MIC 值。取無(wú)菌96 孔板，每孔加入MH 培養(yǎng)基和待測(cè)藥液進(jìn)行連續(xù)二倍稀釋?zhuān)谙♂尯蟮目字屑尤腩A(yù)先搖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并稀釋至每毫升1.0×105菌落總數(shù)（colony-forming unit，CFU）的菌液100 μL[8]。每個(gè)96 孔板設(shè)置藥物陰性對(duì)照、MH 陰性對(duì)照和菌液陽(yáng)性對(duì)照。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h 后，為避免SRD 和SCD 顏色對(duì)MIC 結(jié)果的干擾，將96 孔板每孔吸取10 μL 滴于LB 瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，最小無(wú)菌生長(zhǎng)的濃度即為MIC。質(zhì)控菌株選用E. coliATCC 25922 標(biāo)準(zhǔn)菌株，所有抗生素和培養(yǎng)基均在質(zhì)控范圍內(nèi)。

1.2.2 抗生素與SCD 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 通過(guò)微量棋盤(pán)稀釋法測(cè)定SCD 與ENR、AMP、STR、CEF、KAN和DOX 這6 種抗生素聯(lián)合使用時(shí)的分級(jí)抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）來(lái)判定其相互作用。將SCD 和抗生素在MH 肉湯培養(yǎng)基內(nèi)梯度稀釋為 2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 和1/16MIC，于稀釋后的孔中加入預(yù)先搖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并稀釋至每mL1.0×105CFU 的菌液，并設(shè)置藥物陰性對(duì)照、MH 陰性對(duì)照和菌液陽(yáng)性對(duì)照。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h 后，將96 孔板每孔吸取10 μL 滴于LB 瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基置于37 ℃ 18～24 h 后讀取結(jié)果，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為聯(lián)用MIC。通過(guò)公式計(jì)算FICI，進(jìn)而判斷五味子水煎液與其他抗生素聯(lián)用的作用效果。

FICI 判讀結(jié)果如下：FICI≤0.5，協(xié)同作用；0.5＜FICI≤1，相加作用；1＜FICI≤2，無(wú)關(guān)作用；FICI＞2，拮抗作用[9]。

1.2.4 SCD 與CEF 聯(lián)合使用對(duì)E. coli生長(zhǎng)的影響將E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922 活化后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān){(diào)整菌液濃度至每毫升105CFU，以1%接種量接種于MH 培養(yǎng)液中。分為以下4 個(gè)組：對(duì)照組、1/4MIC SCD、1/4MIC CEF和1/4MIC SCD+1/4MIC CEF。37 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)24 h，在0、2、4、6、8 和24 h 無(wú)菌取樣，采用平板計(jì)數(shù)法，將菌液逐級(jí)稀釋混勻，取100 μL 涂平板，37 ℃培養(yǎng)18 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)涂布3 塊平板，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下細(xì)菌菌落數(shù)并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRD、SCD 與抗生素的MIC

SRD、SCD 與6 種抗生素對(duì)6 株臨床分離E. coli的MIC 結(jié)果見(jiàn)表1、表2。結(jié)果表明臨床分離的6種E. coli對(duì)本試驗(yàn)采用的6 種抗生素至少出現(xiàn)2 種及以上的耐藥。6 株臨床分離株SCD 的MIC 均為64 mg·mL-1；除0503J4-2的MIC 大于128 mg·mL-1外，其余5 株臨床分離株SRD 的MIC 均為128 mg·mL-1。結(jié)果表明SCD 與SRD 均具有抑菌活性，SCD 抑菌活性高于SRD。因此后續(xù)試驗(yàn)采用SCD 進(jìn)行。

表1 抗生素對(duì)6 株臨床分離E. coli 的MICTable 1 MICs of different antibiotics for 6 clinical E. coli isolates

表2 五味子水煎液對(duì)6 株臨床分離E. coli 的MICTable 2 MICs of SCD and SRD for 6 clinical E. coli isolates

2.2 抗生素與SCD 聯(lián)合體外抗E. coli 活性

采用微量棋盤(pán)稀釋法，將SCD 和6 種不同的抗生素對(duì)臨床分離的5株耐藥E. coli進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。由表3 可知SCD 與KAN聯(lián)合使用，4 株耐藥菌株中有1 株呈現(xiàn)相加作用；3株為無(wú)關(guān)作用。SCD 與STR 聯(lián)合使用，6 株耐藥菌株中有1 株呈現(xiàn)相加作用；5 株呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用。SCD與DOX 聯(lián)合使用，6 株耐藥菌株均呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用。SCD 與ENR 聯(lián)合使用，6 株耐藥菌株均呈現(xiàn)拮抗作用。SCD 與CEF 聯(lián)合使用，5 株耐藥菌株均呈現(xiàn)協(xié)同作用。結(jié)果表明SCD 能有效增強(qiáng)體外CEF 的抗E. coli的活性。

由表4 可知0220E1-1、0313E1-1、0503J1-1、0503J4-2和0513J2-2在SCD 與CEF 聯(lián)合使用時(shí)FIC 分別為0.25、0.375、0.5、0.5 和0.312 5，均呈現(xiàn)協(xié)同作用。

2.3 SCD 對(duì)E. coli 生長(zhǎng)的影響

采用平板計(jì)數(shù)法繪制E. coli標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922 生長(zhǎng)曲線(xiàn)，分析SCD 對(duì)E. coli生長(zhǎng)的影響。由圖1 可知SCD 對(duì)ATCC 25922 有較強(qiáng)的抑菌活性，SCD 處理過(guò)的E. coli標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922其生長(zhǎng)受到明顯抑制，且抑制效果呈濃度依賴(lài)性。同樣說(shuō)明SCD 對(duì)E. coli具有抑菌活性。

表3 抗生素聯(lián)合SCD 對(duì)臨床耐藥菌株的FIC 分析Table 3 Results of antibiotics in combination with SCD for drug resistance of E. coli

表4 SCD 與CEF 聯(lián)合試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of CEF in combination with SCD for drug resistance of E. coli

圖1 SCD 對(duì)ATCC 25922 生長(zhǎng)的影響Figure 1 Growth curve of ATCC 25922 treated with SCD

圖2 SCD 與CEF 聯(lián)合對(duì)ATCC 25922 生長(zhǎng)的影響Figure 2 Growth curve of ATCC 25922 treated with SCD combined with CEF

2.4 SCD 與CEF 聯(lián)合使用對(duì)E. coli 生長(zhǎng)的影

采用平板計(jì)數(shù)法繪制E. coli標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922 生長(zhǎng)曲線(xiàn)，分析SCD 與CEF 聯(lián)用對(duì)E.coli生長(zhǎng)的影響。由圖2 可知經(jīng)1/4MIC SCD 和1/4MIC CEF 聯(lián)合處理后的ATCC25922 相較于1/4MIC SCD和1/4MIC CEF單獨(dú)處理的生長(zhǎng)受到明顯抑制，ATCC25922 增長(zhǎng)量維持在一個(gè)較低水平，其生長(zhǎng)被抑制。說(shuō)明SCD 能增強(qiáng)臨床分離耐藥E.coli對(duì)CFE 的敏感性。

3 討論

細(xì)菌性疾病嚴(yán)重危害人類(lèi)和動(dòng)物健康，尤其是畜禽養(yǎng)殖業(yè)。目前，抗生素仍然是防治細(xì)菌病的首選藥物。但由于細(xì)菌對(duì)臨床使用的多種抗生素均產(chǎn)生了耐藥，且耐藥譜不斷增加，可用于治療的抗生素選擇性越來(lái)越有限，而新型抗菌藥物的研發(fā)仍處于滯后狀態(tài)[10-11]。故越來(lái)越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向耐藥菌自身，如提高耐藥菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性、逆轉(zhuǎn)耐藥性等[12]。

從中草藥中提取抗菌活性物質(zhì)應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一，研究表明五倍子、黃連、大黃、厚樸、丁香、蒲公英和五味子等具有抑菌活性[13-14]，其中五味子提取物具有抗氧化、抗哮喘和提高智力等活性[15-16]，其水提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌等多種細(xì)菌均具有抑制活性[17]。五味子中的主要化學(xué)成分包括木脂素類(lèi)、揮發(fā)油和有機(jī)酸等，其中發(fā)揮主要活性作用的為木脂素類(lèi)，約占總量的8%[18]，研究表明木脂素具有肝保護(hù)、抗炎、抗菌和抗HIV-1 等生物學(xué)活性[19]。按結(jié)構(gòu)分可將木脂素分為聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)（A型）、螺苯駢呋喃型聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)（B 型）、4-芳基四氫萘類(lèi)（C 型）、2, 3-二甲基-1, 4-二芳基丁烷類(lèi)（D型）和2, 5-二芳基四氫呋喃類(lèi)（E 型）五大類(lèi)[20]。有研究表明SCD 中木脂素類(lèi)化合物含量由明顯高于SRD[21]，本試驗(yàn)結(jié)果顯示SCD 抑菌活性強(qiáng)于SRD，該差異是否由木脂素類(lèi)含量導(dǎo)致，需要進(jìn)一步探究。由于南北五味子價(jià)格相近，且SCD 的抑菌活性強(qiáng)于SRD，故選擇SCD 與抗生素聯(lián)用開(kāi)展抑菌試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCD 與ENR 聯(lián)合呈現(xiàn)拮抗作用，與CEF 聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同作用。這表明SCD 可與CEF聯(lián)合使用，可考慮用于增強(qiáng)臨床耐藥株對(duì)CEF 的敏感性，提升耐藥菌感染的治療效果并降低藥物用量；而SCD 與ENR 聯(lián)合使用表現(xiàn)為拮抗作用，故臨床使用時(shí)需要特別注意。時(shí)間-殺傷曲線(xiàn)進(jìn)一步證明了SCD 能夠劑量依賴(lài)性地抑制耐藥E. coli菌株生長(zhǎng)，其與CEF 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用更明顯，也表現(xiàn)為協(xié)同抑菌作用，但其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。