森林草莓FvCAX 基因家族的鑒定及生物學(xué)功能分析

閆慧清，劉艷晶,2，黃 絨，孫貴連，黃小龍,2*

(1. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州師范大學(xué), 植物生理與發(fā)育調(diào)控貴州省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550025)

Ca2+是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中非常重要的營(yíng)養(yǎng)元素，是構(gòu)成細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)的必需物質(zhì)[1]，能夠維護(hù)細(xì)胞膜與膜結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性，減少或延緩膜的損傷[2]。 CAX (Ca2+/H+exchanger antiporter)是一類重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在調(diào)節(jié)植物鈣含量的變化和植物內(nèi)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)上起著極其重要的作用[3]。利用生物信息學(xué)方法鑒定森林草莓CAX基因家族的成員，研究其染色體分布、進(jìn)化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)以及啟動(dòng)子的元件分析等，對(duì)于研究薔薇科物種中CAX基因的功能具有重要的意義。

CAX是存在于細(xì)胞質(zhì)膜或液泡膜上的多基因家族成員[4]。前人利用免疫雜交和煙草免疫顯色得到AtCAX1～AtCAX4 均定位于擬南芥的液泡膜上[5]。在擬南芥中已通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證了 AtCAX1～AtCAX4 的功能，其中，AtCAX1 參與許多生物學(xué)過(guò)程，如鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)，鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)等[5]。AtCAX2 和AtCAX4 能夠增強(qiáng)植物向液泡區(qū)儲(chǔ)存重金屬的能力，具有轉(zhuǎn)運(yùn)多種陽(yáng)離子的功能，增強(qiáng)植物體內(nèi)Ca2+、Cd2+和Mn2+的累積能力，從而提高植物對(duì)重金屬脅迫的耐性[4]。AtCAX3 能維持Na+和Li+穩(wěn)態(tài)并增強(qiáng)對(duì)低pH 的高度敏感性。AtCAX3 與AtCAX1的氨基酸序列相似度高達(dá)77%，但是不同成員之間的表達(dá)量存在組織特異性，其中AtCAX1在擬南芥的根、莖、葉和花的組織中均有表達(dá)，但在葉中高度表達(dá)；AtCAX2在維管組織的薄壁細(xì)胞、花以及幼嫩的頂端分生組織中表達(dá)量高[6]；AtCAX3在根和花的組織中表達(dá)量高，而AtCAX4只有在根中表達(dá)[7]。添加Ca2+可誘導(dǎo)擬南芥AtCAX1、水稻OsCAX1a和棉花GhCAX3的基因表達(dá)[8-9]。蘋果MdCAX共有8個(gè)成員，其基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，定量分析結(jié)果表明MdCAX對(duì)不同鹽離子脅迫具有不同的表達(dá)模式[10]。油菜BnaCAXs家族共含有17個(gè)成員，每個(gè)成員包含8 ～ 11 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，進(jìn)化樹(shù)表明其與十字花科的擬南芥結(jié)構(gòu)相似。啟動(dòng)子分析表明，油菜BnaCAXs的啟動(dòng)子中，Dof、MYB 以及W-BOX 是主要順式作用元件，能夠參與脅迫反應(yīng)；定量分析結(jié)果表明BnaCAXs主要在地下部表達(dá)，其核心家族成員為BnaC04g07160D和BnaC03g37860D[11]。

森林草莓Fragaria vesca(2n= 2x= 14)為多年生草本植物，其基因組約為206 Mb，易于遺傳轉(zhuǎn)化，是重要的薔薇科模式植物。CAX 是重要的植物轉(zhuǎn)化蛋白，同時(shí)還能增強(qiáng)對(duì)重金屬脅迫的耐性，對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性具有重要功能，但迄今為止，其在森林草莓基因組中的成員、表達(dá)及其調(diào)控尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)分析方法，分析森林草莓CAX基因家族的成員、理化特征、染色體定位、進(jìn)化、表達(dá)及其調(diào)控，旨在進(jìn)一步研究FvCAX基因家族的生物功能及了解其在森林草莓對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素吸收中的作用，為研究森林草莓CAX基因家族的功能提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 森林草莓FvCAX 基因家族的鑒定

從擬南芥基因組 (https://www.arabidopsis.org/)中獲得6 個(gè)AtCAX 的蛋白序列。利用TBtools 將擬南芥中獲得CAX 家族成員序列與森林草莓基因組的序列NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)進(jìn)行同源比較(e=1×10-5)。去除冗余序列后，獲得初步的FvCAX家族的核酸和蛋白質(zhì)序列，并再通過(guò)NCBI 中保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫(kù)(Conserved domain database, CDD)去除不含有CAX 保守結(jié)構(gòu)域的基因，最終確定FvCAX的家族成員。Gene ID 來(lái)源于Fragaria_vesca_v4.0.a2. transcripts 文件，轉(zhuǎn)錄本來(lái)源于 NCBI。利用 ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)獲得FvCAX家族成員的氨基酸理化性質(zhì)，如分子量、等電點(diǎn)和平均親水系數(shù)。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi)獲得FvCAX家族成員的亞細(xì)胞定位信息。

1.2 FvCAX 基因家族的系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建及蛋白序列分析

利用Clustal W 對(duì)森林草莓FvCAX 蛋白序列與擬南芥(Arabidopsis thaliana)以及NCBI 中收錄的水稻(Oryza sativa)、月季(Rosa cultivars)、蘋果(Malus domestica)的CAX 蛋白序列進(jìn)行多重比較，通過(guò)Mega7 軟件中鄰接算法Neighbor-Joining Tree 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，其中Bootstrap 重復(fù)值為1 000 次。MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線分析Motif 結(jié)構(gòu)。利用TBtools 軟件(Redraw Gene Structure)構(gòu)建基因結(jié)構(gòu)圖。

1.3 FvCAX 基因家族的染色體定位分析

利用NCBI 中森林草莓基因組提供的染色體注釋信息，得到并利用R 軟件對(duì)FvCAX 家族成員的染色體定位進(jìn)行可視化。根據(jù)家族成員在染色體上的位置由低到高進(jìn)行命名。

1.4 FvCAX 在野草莓發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析

通過(guò)森林草莓轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析FvCAX家族成員在植株發(fā)育的整個(gè)時(shí)期表達(dá)模式[12]，包括有種子(子房壁、胚、胚乳和種皮組織)、幼苗(種子萌發(fā)后10 d的植株)、成熟葉片和花中不同組織(花粉、心皮、花托內(nèi)部的髓、瘦果下面的肉質(zhì)組織)，并將不同的組織劃分為不同的階段[13]。該數(shù)據(jù)已提交到SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(SRA065786)，使用RPKM 法表示FvCAX家族成員的基因表達(dá)量。最后通過(guò)R 軟件對(duì)FvCAX家族成員的表達(dá)量進(jìn)行聚類。

1.5 FvCAX 的啟動(dòng)子分析

為了闡明調(diào)控FvCAX基因家族可能的分子機(jī)制，對(duì)其啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件的分析。首先通過(guò)NCBI 獲得FvCAX基因起始密碼子(ATG)上游2 000 bp 基因組DNA 序列，并用NEW PLACE(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 森林草莓FvCAX 家族的鑒定及特性分析

通過(guò)對(duì)森林草莓的基因組注釋序列和CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選分析，共獲得了森林草莓FvCAX家族包含有7 個(gè)成員(表1)。根據(jù)其在染色體上的位置(圖1)，對(duì)其成員進(jìn)行編號(hào)為FvCAX1～FvCAX7。由圖1 得到森林草莓共有7 條染色體，其中FvCAX1(Chr3:12773449—12777622)、FvCAX2(Chr3:22613312 — 22617539) 位于3 號(hào)染色體；FvCAX3(Chr6:7635361—7644208)、FvCAX4(Chr6:7649624-7652926) 、FvCAX5(Chr6:26474172—26479381)、FvCAX6(Chr6:26479432—26484248)和FvCAX7(Chr6:27461045—27466466)位于第6 號(hào)染色體上，形成了基因簇。

圖1 森林草莓FvCAX 基因家族中7 個(gè)成員的染色體定位Figure 1 Chromosome location of seven FvCAX genes

通過(guò)對(duì)FvCAX家族中蛋白質(zhì)成員的理化性質(zhì)分析得到，森林草莓FvCAX基因家族蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量差異較小，位于47.02 ～ 59.41 kDa 之間，其中FvCAX6 的分子質(zhì)量最大，為59.41 kDa，而FvCAX3最小，為47.02 kDa，等電點(diǎn)在4.90 ～ 5.81 之間，表明森林草莓中Ca2+/H+跨膜蛋白均為酸性。由表1 可知，F(xiàn)vCAX基因家族的蛋白質(zhì)的平均親水系數(shù)(GRAVY, grand average of hydropathicity)值為0.345 ～0.645，表明所有的成員均為疏水蛋白，且疏水程度存在差異。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明森林草莓FvCAX基因家族中有4 個(gè)成員定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，其余3 個(gè)基因定位在葉綠體類囊體膜上，表明不同成員對(duì)細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中Ca2+的運(yùn)輸有不同的分工。

表1 森林草莓FvCAX 基因的理化分析Table 1 The physical and chemical analysis of FvCAX gene family in Fragaria vesca

2.2 森林草莓FvCAX 家族的進(jìn)化關(guān)系及模體分析

通過(guò)搜索得到擬南芥(AtCAX1～AtCAX6)、月季(RcCAX1～RcCAX9)和蘋果(MdCAX1～MdCAX8)的CAX序列，并將得到的序列與森林草莓構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖2)。由圖2 可知，7 個(gè)FvCAX 蛋白與擬南芥、月季和蘋果的CAX 形成獨(dú)立的四大分支，而且草莓的每個(gè)FvCAX 蛋白全部都與月季的親緣關(guān)系最近，其次是蘋果和擬南芥。這些結(jié)果表明森林草莓中不同的FvCAX 之間存在差異，且每個(gè)FvCAX 都能與月季中的RcCAX 功能相似。

圖2 森林草莓FvCAXs 與其他物種CAXs 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of the amino acid sequences of FvCAXs and CAXs in other species

圖3 森林草莓FvCAX 基因中7 個(gè)成員的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Figure 3 Gene structure and protein conserved domains of seven FvCAX genes

利用森林草莓FvCAX的基因組序列和開(kāi)放閱讀框(Open reading frame)，確定了森林草莓FvCAX基因的UTR (Untranslated region)、CDS (Coding sequence)和內(nèi)含子的分布，F(xiàn)vCAX基因家族各成員之間的進(jìn)化關(guān)系如圖3A，內(nèi)含子數(shù)量在10 ～ 11 個(gè)且內(nèi)含子在0、1 和2 相位均有出現(xiàn)(圖3B)。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)森林草莓CAX基因家族的motif 序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明：森林草莓7 個(gè)FvCAX基因家族共含有5 個(gè)保守的motif(圖3C)；將motif 的一致序列列出，結(jié)果如表2 所示。

此分析結(jié)果可以說(shuō)明FvCAX基因家族中7個(gè)基因都是FvCAX基因家族具有差異功能的基因，有助于預(yù)測(cè)FvCAX基因家族的生物功能。

表2 森林草莓FvCAX 蛋白的預(yù)測(cè)motifTable 2 The sequences of motif consensus of FvCAX protein

圖4 森林草莓FvCAX 基因家族在不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式(括號(hào)中的數(shù)字表示發(fā)育階段)Figure 4 Expression patterns of seven FvCAX genes in various tissues and development (The number in the bracket indicates the developmental stages)

圖5 森林草莓FvCAX 基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的與脅迫相關(guān)順式作用元件分析Figure 5 Identification of cis-acting regulatory elements related to stresses in the promoter region of the FvCAX gene family

根據(jù)保守motif 的結(jié)構(gòu)，所得的結(jié)果如表2 所示。其中motif 1 (MFAMKDKLDITLGVAIGSSTQISMFV IPFCVVVGWIMGIPMDLNFQLFET)和motif 3 (FGWL CIMTIWISWLSEYVVDTIEGASDSWNIPVAFISVIL LPIVGNAAEH)都具有運(yùn)輸Ca2+的功能。motif 5 的蛋白具有跨膜功能。

2.3 森林草莓FvCAX 家族的表達(dá)分析

FvCAX家族中5 個(gè)成員在不同的組織及同一組織的不同發(fā)育階段具有不同的表達(dá)量，表明這些成員發(fā)揮不同的功能，具體如圖4 所示。根據(jù)其表達(dá)模式的變化，可以將基因表達(dá)情況分為兩大類，第一類基因包括FvCAX1～3 和FvCAX5，在整個(gè)植株發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較低，僅有部分基因在花發(fā)育的部分時(shí)期有表達(dá)量；第二類基因在所有組織及其發(fā)育階段具有顯著的表達(dá)量，尤其是FvCAX6和FvCAX7，在苗期、葉片、花的發(fā)育過(guò)程和種子的形成過(guò)程中表達(dá)量都顯著性增加，表明這兩個(gè)基因?qū)ι植葺l(fā)育過(guò)程中Ca2+的吸收具有重要的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)FvCAX7在同一個(gè)組織的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量存在差異，F(xiàn)vCAX7在花藥發(fā)育的第10 階段含量最高，在第11 和12 階段表達(dá)量降低，表明森林草莓不同發(fā)育階段對(duì)Ca2+的需求存在差異。

2.4 森林草莓FvCAX 家族的啟動(dòng)子分析

轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到FvCAX啟動(dòng)子的順式作用元件上，對(duì)調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)起到重要作用。為了研究森林草莓CAX家族基因啟動(dòng)子區(qū)域所能結(jié)合的順式作用元件，我們利用PLACE (Plant cis-acting regulatory DNA elements)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)FvCAXs基因啟動(dòng)子進(jìn)行了分析。有34 個(gè)順式作用元件能結(jié)合到FvCAX家族基因的啟動(dòng)子上，其中有22 個(gè)元件均能結(jié)合到7 個(gè)家族成員中，除了常見(jiàn)的啟動(dòng)子，如TATA box 和CAAT box 之外，其中豐度較大的主要有MYB、Dof (AAAG)、WRKY、W-box 和MBS (圖5A)。這些元件在調(diào)控植物基因響應(yīng)外界脅迫發(fā)揮了重要作用，結(jié)果如圖5B 所示。其中最大的為MYB (31%)，其次為DOF (24%)和WRKY (23%)。

3 討論與結(jié)論

CAX 是含有多個(gè)基因的基因家族，其中水稻有6 個(gè)，蘋果含有8 個(gè)，油菜有17 個(gè)[14]。通過(guò)同源搜索，在森林草莓基因組中鑒定出7 個(gè)CAX基因。在不同的物種中，F(xiàn)vCAX 的理化性質(zhì)存在差異，如甘藍(lán)類中CAX 等電點(diǎn)變化范圍是4.71～ 6.67，蘋果的CAX 等電點(diǎn)為4.97 ～ 6.67[10-11]，本研究結(jié)果指出草莓的等電點(diǎn)介于4.90 ～ 5.81。此外，作為膜的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，CAX 定位于質(zhì)膜、液泡膜、葉綠體類囊膜和線粒體膜上[15]，但在不同物種中存在差異。前人報(bào)道擬南芥的6 個(gè)CAX 成員主要定位在液泡膜和細(xì)胞膜上[16]，蘋果的CAXs 定位于質(zhì)膜上或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[17]。本研究中，對(duì)野草莓的CAXs 定位于質(zhì)膜、液泡膜和葉綠體類囊膜，表明可能野草莓的植物細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)和葉綠體內(nèi)Ca 需求較多，且對(duì)于基質(zhì)和葉綠體內(nèi)陽(yáng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮重要的作用。

FvCAXs具有組織特異表達(dá)特征，表明家族中不同成員存在功能差異，可能存在不同的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能。FvCAX1～3 僅在花發(fā)育時(shí)期有表達(dá)；FvCAX6和FvCAX7在植株整個(gè)發(fā)育期都有表達(dá)，尤其是在苗期(種子萌發(fā)后10 d)和成熟的葉片中。根據(jù)其表達(dá)模式的高低，我們確定了FvCAXs家族的核心基因?yàn)镕vCAX6和FvCAX7。蘋果MdCAXs在不同的營(yíng)養(yǎng)器官中，如根、莖和葉中的表達(dá)模式也不同，且受相同的外界重金屬脅迫處理后，成員表現(xiàn)出不同變化量的改變，表明MdCAXs呈現(xiàn)出特異性應(yīng)答反應(yīng)[10]。棉花GhCAX表達(dá)豐度和模式均有所差異，其中GhCAX3主要在葉、莖、柱頭、花瓣和胚珠中表達(dá)，在根和纖維組織中的表達(dá)量較少[18]。在煙草中過(guò)表達(dá)AtCAX4能顯著提高植物根部Cd2+累積[19]。同時(shí)，在Cd2+脅迫條件下，AtCAX4的表達(dá)顯著提高[20]。甘藍(lán)型油菜BnaCAX家族中的兩個(gè)主效基因同樣受到Cd2+脅迫的誘導(dǎo)。關(guān)于森林草莓FvCAX基因家族在Cd2+脅迫下的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。

啟動(dòng)子所包含的順式調(diào)控元件能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因的表達(dá)。水稻OsCAX4基因表達(dá)量在鹽脅迫條件下顯著上升[21]；在煙草和大豆中過(guò)表達(dá)CAX1提高了植物對(duì)鹽脅迫的耐受性[12]。此外，GhCAX3對(duì)于棉花適應(yīng)低溫條件必不可少[22]。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到共有22 個(gè)順式作用元件均結(jié)合到FvCAX家族基因的啟動(dòng)子，豐度較大的包括MYB、Dof (AAAG)、WRKY、W-box 和MBS (圖5B)，這些元件在調(diào)控基因響應(yīng)逆境脅迫中均發(fā)揮了重要作用。如水稻和擬南芥的WRKY受到高低溫、鹽堿、干旱和營(yíng)養(yǎng)缺素等逆境脅迫因子而被誘導(dǎo)表達(dá)[23]。水稻OsDof13受低氮脅迫后呈現(xiàn)先下降再升高的表達(dá)變化[24]，表明FvCAX基因表達(dá)量能夠在不同環(huán)境脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)。因此，前人研究表明CAX家族在調(diào)控植物應(yīng)對(duì)脅迫逆境發(fā)揮重要作用，與MYB、Dof (AAAG)、WRKY、W-box 和MBS 順式作用元件有關(guān)。本研究基于基因組序列共鑒定出7個(gè)森林草莓FvCAX家族成員，并且與月季的親緣關(guān)系最近，通過(guò)分析結(jié)構(gòu)域和MEME 蛋白基序表明，F(xiàn)vCAX是保守的，并結(jié)合不同組織和發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到該家族成員的基因表達(dá)模式。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究草莓FvCAX 蛋白家族功能提供理論依據(jù)，為研究森林草莓中CAX基因家族的功能提供理論基礎(chǔ)。