早中期股骨頭壞死樣本的骨微結(jié)構(gòu)分析

李 獲，孟昊業(yè)，馬海洋，高健明，廖思達(dá)，趙 軍，王 鵬,，黃 波,，王 皓,，趙金娟，魯曉波，彭 江,

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 骨與關(guān)節(jié)外科，四川瀘州 646000；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 骨科研究所，骨科再生醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，全軍骨科戰(zhàn)創(chuàng)傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100853

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)又稱股骨頭缺血性壞死或無菌性壞死，是骨科常見的導(dǎo)致嚴(yán)重后果的疾病。ONFH的病理特點(diǎn)之一是軟骨下血管微循環(huán)，尤其是較小的支持血管受損，隨后導(dǎo)致骨壞死、股骨頭內(nèi)微骨折的發(fā)生，最終會發(fā)生軟骨下骨塌陷。臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹股溝區(qū)疼痛，部分患者髖關(guān)節(jié)活動受限，少數(shù)患者伴有膝關(guān)節(jié)疼痛[1-2]。該疾病的全球流行病學(xué)情況尚不清楚，據(jù)統(tǒng)計我國非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者累積已達(dá)812萬，男性患者顯著多于女性，糖皮質(zhì)激素、飲酒、高血脂、肥胖、高危職業(yè)(潛水員)、吸煙、糖尿病等均為非創(chuàng)傷性骨壞死的風(fēng)險因素[3]。當(dāng)前的治療方案主要包括手術(shù)和非手術(shù)治療，非手術(shù)治療主要包括減輕負(fù)重、使用抗凝劑、血管擴(kuò)張劑、中藥、雙膦酸鹽和各種非侵入性生物物理方法(如電磁刺激、體外沖擊波治療和高壓氧)等。但非手術(shù)治療不適用于已經(jīng)發(fā)生軟骨下塌陷的ONFH。手術(shù)治療包括髓心減壓、截骨術(shù)、血管化或非血管化腓骨移植等。全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)是終末期股骨頭骨壞死的治療方法[4]。大部分ONFH患者處于青壯年，一旦患病，絕大多數(shù)患者將會發(fā)生股骨頭塌陷，最終不得不行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)。對ONFH病理生理學(xué)的認(rèn)識將有助于我們選擇更好的治療方法?，F(xiàn)有的研究多集中于國際骨循環(huán)研究學(xué)會(ARCO)Ⅲ～Ⅳ期的骨壞死，此時的股骨頭已發(fā)生軟骨下骨折，股骨頭塌陷，同時伴有骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)間隙狹窄，這對于早期股骨頭壞死的防治與塌陷的預(yù)防效果有限。因此，我們的研究旨在分析早中期ONFH標(biāo)本微觀結(jié)構(gòu)變化及其原因，探索早中期骨壞死標(biāo)本中不同區(qū)域內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，探討股骨頭骨壞死不同區(qū)域結(jié)構(gòu)改變及成骨能力的變化，尋找可能的塌陷原因及可能的預(yù)防方法。

材料與方法

1標(biāo)本來源 收集2019年3月-2020年1月，于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者切除的股骨頭10例 (男性5例，女性5例)，年齡41～66歲，平均52歲。術(shù)前起病時間3～24個月，平均9.5個月。病因與激素使用相關(guān)。所有病例ARCO分期均為Ⅱ期。

2顯微CT 將臨床收集的行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的股骨頭骨壞死標(biāo)本在電鋸下沿冠狀位切開，切片厚度5mm，之后所有股骨頭標(biāo)本均行顯微CT(GE Explore Locus，USA)掃描，掃描分辨率為45μm，掃描電壓為80kV電流為450μA，曝光時間為400ms。在顯微CT掃描圖像中，將股骨頭分為壞死區(qū)、硬化區(qū)和健康區(qū)。從這些區(qū)域選取感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，大小0.5cm×0.5cm×1cm進(jìn)行三維重建分析，分析骨礦密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁間隙(trabecula space，Tb.Sp)、骨小梁數(shù)(trabecula number，Tb.N)和骨小梁厚度(trabecula thickness，Tb.Th)。

3標(biāo)本處理 股骨頭壞死標(biāo)本行micro-CT掃描之后，用4%多聚甲醛固定，脫鈣、脫水、包埋、切片，行蘇木精伊紅(HE)及Goldner三色染色，并觀察其結(jié)構(gòu)變化。每個分區(qū)隨機(jī)選取5個視野統(tǒng)計血管面積，取平均值作為該區(qū)域血管面積。

4統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計軟件為SPSS20.0。所有數(shù)據(jù)均為計量資料，以表示。組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1大體觀察 在冠狀位切面(圖1A)可見關(guān)節(jié)軟骨連續(xù)，厚度正常。股骨頭內(nèi)黃色壞死區(qū)與周圍分界清楚，不同標(biāo)本壞死區(qū)位置及范圍分布不一。

2影像學(xué)評價 X線片顯示，股骨頭表面光滑，無新月征出現(xiàn)，股骨頭內(nèi)部未見明顯壞死區(qū)、囊性變及硬化區(qū)，關(guān)節(jié)間隙正常(圖1B)。切片高分辨率X線片(圖1C)顯示股骨頭形狀結(jié)構(gòu)完整，壞死區(qū)骨小梁數(shù)目稍有降低，其中存在骨吸收區(qū)，壞死區(qū)周圍可見明顯硬化帶形成。正常區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)及連續(xù)性較好。micro-CT圖像中(圖1D、圖2)，軟骨下骨、壞死區(qū)、硬化區(qū)和健康區(qū)的骨小梁排列和結(jié)構(gòu)特征明顯不同。軟骨下骨骨小梁連續(xù)、完整，壞死區(qū)骨小梁不完整、斷裂，可見明顯骨折線。硬化區(qū)位于壞死區(qū)與正常區(qū)交界，骨小梁厚度明顯增加。健康區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)相對正常。骨計量參數(shù)分析表明，硬化區(qū)BMD均數(shù)以及BV/TV高于壞死區(qū)和健康區(qū)(P< 0.05)，Tb.Th在硬化區(qū)明顯降低，與健康區(qū)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，而各區(qū)域Tb.N、Tb.Sp差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1、圖3)。

圖3 骨計量學(xué)分析及血管面積 (aP < 0.05, vs healthy region)A：骨礦密度；B：骨體積分?jǐn)?shù)；C：骨小梁數(shù)目；D：骨小梁間隙；E：骨小梁厚度；F：不同分區(qū)血管面積Fig.3 Comparisons of trabecular parameters and vessel areas between different groups (aP < 0.05, vs healthy region)A: bone mineral density (BMD); B: bone volume fraction (BV/TV); C: trabecula number (Tb. N); D: trabecula space (Tb. Sp);E: trabecula thickness (Tb. Th); F: vascular area

表1 不同分區(qū)骨分析參數(shù)(n=10)Tab. 1 Bone analysis parameters of different regions in ONFH ( n=10)

圖1 股骨頭壞死標(biāo)本切片 A：大體；B：X線片；C：高精度X線片；D：顯微-CTFig.1 Two-dimensional images of ONFH A: section of ONFH; B: X-ray; C: X-ray high-definition; D: micro-CT

圖2 股骨頭壞死標(biāo)本micro-CT三維重建圖(a：壞死區(qū)；b：硬化區(qū)；c：健康區(qū))Fig.2 Two-dimensional micro-CT images of ONFH and reconstructed three-dimensional image (a: necrotic region; b: sclerotic region; c:healthy region)

3HE染色 在病理組織切片中發(fā)現(xiàn)，股骨頭外形結(jié)構(gòu)完整。軟骨厚度正常，表面光滑，軟骨下骨結(jié)構(gòu)基本完整，無軟骨下骨折，潮線連續(xù)。軟骨下骨小梁未出現(xiàn)明顯變細(xì)、部分骨小梁出現(xiàn)斷裂，壞死骨小梁內(nèi)出現(xiàn)空骨陷窩，同時部分區(qū)域可見軟骨下血管侵入軟骨層(圖4)。壞死區(qū)骨小梁骨陷窩中骨細(xì)胞消失，骨髓腔細(xì)胞壞死。壞死區(qū)與健康區(qū)及硬化帶分界明顯。壞死區(qū)骨小梁變細(xì)，組織結(jié)構(gòu)紊亂，失去原有結(jié)構(gòu)和連續(xù)性、排列散亂，小梁周圍可見多核破骨細(xì)胞。硬化區(qū)骨小梁呈骨性增生，排列緊密、規(guī)則，與健康區(qū)骨小梁相比，硬化區(qū)原有骨小梁存在大量空骨陷窩，而表面存在大量新生骨小梁，小梁周圍可見成骨細(xì)胞，硬化區(qū)骨小梁明顯增粗，小梁間隙變窄，排列致密規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整(圖4)。修復(fù)反應(yīng)區(qū)骨小梁存在大量空骨陷窩，周圍可見明顯炎癥細(xì)胞聚集，大量肉芽組織出現(xiàn)，血管較其他區(qū)域明顯增加(圖4)，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤，部分可見肥大細(xì)胞。骨髓腔內(nèi)大量纖維結(jié)締組織增生包裹骨小梁碎片。健康區(qū)骨小梁排列正常，結(jié)構(gòu)較完整，厚度均勻，骨髓腔造血組織、脂肪細(xì)胞及骨細(xì)胞相對正常(圖4)。

圖4 股骨頭壞死標(biāo)本不同區(qū)域HE染色Fig.4 HE staining images of a paraffin section of different regions

4Goldner染色 goldner三色染色顯示軟骨厚度正常，表面較光滑，壞死區(qū)骨小梁、結(jié)構(gòu)紊亂，連續(xù)性消失，小梁內(nèi)骨細(xì)胞死亡，小梁表面大多數(shù)為紅色的成熟骨，少量綠染的類骨質(zhì)分布于小梁周圍。與健康區(qū)骨小梁相比，硬化區(qū)骨小梁表面大量綠染的新生類骨質(zhì)，健康區(qū)骨小梁排列結(jié)構(gòu)正常，類骨質(zhì)在小梁表面均勻分布(圖5)。

圖5 股骨頭壞死標(biāo)本不同區(qū)域Goldner染色Fig.5 goldner staining images of a paraffin section of the subchondral bone

討 論

股骨頭壞死病理過程包括壞死和修復(fù)，大部分病例最終會出現(xiàn)塌陷。目前股骨頭骨壞死的治療方法對于逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)生過程作用有限。糖皮質(zhì)激素相關(guān)性骨壞死的病理改變主要包括骨細(xì)胞的凋亡以及骨細(xì)胞生成和死亡的失衡[5]。

本研究通過micro-CT及病理切片染色，對早中期激素性股骨頭骨壞死標(biāo)本進(jìn)行內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)早中期股骨頭壞死標(biāo)本軟骨下骨區(qū)結(jié)構(gòu)基本完整，但部分區(qū)域出現(xiàn)血管侵入軟骨層，正常生理?xiàng)l件下，人類軟骨既不含血管，也不含神經(jīng)，同時具有抵抗血管侵入的能力，有研究認(rèn)為在骨-軟骨交界處的血管生成主要與軟骨下骨和非鈣化骨之間通道形成有關(guān)[6]。Pesesse等[7]認(rèn)為當(dāng)骨-軟骨連接處存在微骨折現(xiàn)象，就會形成軟骨下板至非鈣化軟骨的通道，于是關(guān)節(jié)軟骨下的液體、細(xì)胞及細(xì)胞因子持續(xù)增加，導(dǎo)致軟骨下骨不正常的血管新生。這與我們的研究結(jié)果一致。既往的研究多關(guān)注中晚期的股骨頭壞死標(biāo)本，此時軟骨下骨已經(jīng)發(fā)生塌陷，這對于評價軟骨下骨塌陷過程作用有限。我們通過觀察早中期股骨頭壞死樣本發(fā)現(xiàn)，盡管早中期骨壞死患者X線片和CT未見明顯軟骨下骨骨折線，但軟骨下骨已經(jīng)發(fā)生微骨折，這可能是早中期股骨頭壞死軟骨下骨特征性改變之一，這種改變導(dǎo)致了骨與軟骨之間的屏障消失，不能繼續(xù)維持軟骨的生理微環(huán)境穩(wěn)定，這可能與股骨頭壞死導(dǎo)致的關(guān)節(jié)炎有密切的聯(lián)系。軟骨下骨改變后將會進(jìn)展為軟骨下骨折，在X線片表現(xiàn)為新月征的形成，并最終導(dǎo)致塌陷的發(fā)生。這種跨過骨-軟骨交界的新生血管長入非鈣化軟骨層時，會導(dǎo)致軟骨內(nèi)骨化[7]。不正常的骨生長破壞了關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，將會導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)促血管新生因子不僅能促進(jìn)血管新生，可能也會促進(jìn)神經(jīng)生長，并且血管細(xì)胞產(chǎn)生的分子也會刺激和誘導(dǎo)神經(jīng)生長。感覺神經(jīng)隨著新生血管長入關(guān)節(jié)，最終進(jìn)入非骨化關(guān)節(jié)軟骨[6]。因此這種血管新生不僅導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的破壞，還有可能是早期骨壞死患者發(fā)生疼痛的原因。

壞死區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)完整性消失，小梁表面新生骨較少，內(nèi)部存在大量空骨陷窩。Plenk等[8]曾提出三種骨壞死修復(fù)方式：有限修復(fù)、破壞性修復(fù)以及重建性修復(fù)。我們認(rèn)為，股骨頭骨壞死修復(fù)過程中存在兩種骨修復(fù)方式，在壞死區(qū)，出現(xiàn)大范圍的骨小梁結(jié)構(gòu)改變，原有的骨小梁被破骨細(xì)胞所吸收，此處破骨快于成骨，我們稱之為破骨性骨修復(fù)。股骨頭壞死的骨吸收區(qū)容易出現(xiàn)微骨折，從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)，有報道認(rèn)為骨壞死的吸收區(qū)對于股骨頭壞死的塌陷過程有著非常重要作用[9-11]。Gao等[9]提出激素性股骨頭骨壞死塌陷與股骨頭內(nèi)骨量減少和骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，認(rèn)為強(qiáng)度降低的骨小梁在持續(xù)的應(yīng)力作用下產(chǎn)生微骨折，修復(fù)過程被激活，微骨折和修復(fù)過程反復(fù)發(fā)生，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷，其中塌陷的骨小梁被再吸收并被非骨組織取代。CT骨計量參數(shù)顯示，BMD、BV/TV、Tb.Th出現(xiàn)明顯變化，而Tb.N、Tb.Sp未見明顯變化，由此可見早中期股骨頭骨壞死區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)基本正常，因此我們提出保持壞死區(qū)原有骨小梁結(jié)構(gòu)，這對于維持其正常力學(xué)結(jié)構(gòu)相當(dāng)重要。

而在硬化區(qū)，骨小梁厚度明顯增加，在原有的骨小梁表面有大量的新生類骨質(zhì)，新生骨小梁包繞原有骨小梁生長，此處成骨明顯強(qiáng)于破骨，我們稱之為成骨性骨修復(fù)。我們的研究發(fā)現(xiàn)硬化區(qū)骨小梁厚度明顯增加，新生類骨質(zhì)較多，這表明硬化區(qū)成骨相當(dāng)活躍。我們前期的研究中采用無水乙醇局部注射制備的鴯鹋的股骨頭骨壞死模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原有骨小梁結(jié)構(gòu)保持完整，在小梁間隙之間存在大量新生骨質(zhì)，與原有骨小梁整合在一起共同持重，表現(xiàn)為成骨性骨修復(fù)[12]。因此我們推測通過干預(yù)手段將壞死區(qū)的破骨性骨修復(fù)轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒切怨切迯?fù)，從而減緩甚至逆轉(zhuǎn)股骨頭骨壞死塌陷，這將是我們下一步的研究方向。

Li等[13]在修復(fù)反應(yīng)區(qū)觀察到有明顯的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達(dá)，而VEGF除了參與血管生成，還能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的募集并影響其活性。Fessel[5]發(fā)現(xiàn)在早期的非創(chuàng)傷性骨壞死標(biāo)本中，VEGF和成纖維細(xì)胞生長因子-2呈中等或強(qiáng)染色，這表明這些因子在早期骨壞死標(biāo)本中表達(dá)升高。我們通過研究骨頭骨壞死早中期標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)修復(fù)反應(yīng)區(qū)血管較其他部位明顯增加，這與之前的研究結(jié)果一致。血管生成與骨的修復(fù)過程密切相關(guān)，在股骨頭壞死患者中，盡管破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收被認(rèn)為是股骨頭塌陷的結(jié)果，但具體的修復(fù)過程仍不是特別清楚。血管生成是股骨頭壞死修復(fù)反應(yīng)的重要組成部分[14]。有文獻(xiàn)指出促血管生成因子能夠刺激骨細(xì)胞，促進(jìn)骨修復(fù)[15]。而骨折部位的血管減少或異常與骨形成和骨量減少密切相關(guān)[16-17]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在修復(fù)反應(yīng)區(qū)不論是早期還是中期骨壞死標(biāo)本都存在大量纖維肉芽組織，且血管數(shù)量較其他區(qū)域明顯增加，大量新生的血管帶來大量肉芽組織和炎癥細(xì)胞，這是股骨頭骨壞死修復(fù)的重要因素。VEGF能增加破骨細(xì)胞生成和吸收活性[18-19]。堿性成纖維細(xì)胞生長因子也能在刺激血管生成的部位刺激破骨細(xì)胞對骨的吸收[20]。早期骨壞死標(biāo)本的修復(fù)反應(yīng)區(qū)可見大量空骨陷窩的骨小梁結(jié)構(gòu)，而我們前期的研究發(fā)現(xiàn)中期和晚期骨壞死標(biāo)本，其修復(fù)反應(yīng)區(qū)充滿大量纖維結(jié)締組織和炎癥細(xì)胞，很少或幾乎不能見到骨小梁結(jié)構(gòu)，我們推測這可能與大量的新生血管使得修復(fù)反應(yīng)區(qū)破骨活動增加有關(guān)。生成具有良好力學(xué)特性的新骨往往經(jīng)歷成骨細(xì)胞的增殖與分化、類骨質(zhì)形成、骨質(zhì)礦化等一系列過程，時間需要近3個月，而破骨細(xì)胞僅需約3周就會顯著影響骨小梁的力學(xué)強(qiáng)度。

本研究發(fā)現(xiàn)在股骨頭骨壞死的初期，壞死區(qū)骨小梁本身的結(jié)構(gòu)并無明顯改變，但修復(fù)過程啟動以后，新生血管長入，破骨激活要對死骨進(jìn)行破骨活動，然后再在此基礎(chǔ)上進(jìn)行成骨活動，正是因?yàn)榍耙浑A段的破骨活動，導(dǎo)致了骨小梁的力學(xué)強(qiáng)度降低，最終導(dǎo)致微骨折出現(xiàn)。這與我們之前的研究結(jié)果一致[21]。

有文獻(xiàn)指出，血管內(nèi)皮細(xì)胞能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞系方向分化，并且骨內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性與參與骨改建的細(xì)胞活性關(guān)系密切。血管內(nèi)皮細(xì)胞在受到相關(guān)刺激后能釋放調(diào)節(jié)成破骨相關(guān)因子，可以抑制破骨細(xì)胞活性，同時刺激成骨細(xì)胞增殖，大量的新生血管在幫助修復(fù)的同時可能也同時加速了壞死區(qū)的骨吸收反應(yīng)。因此，我們設(shè)想如果對修復(fù)反應(yīng)區(qū)進(jìn)行干預(yù)，讓骨修復(fù)反應(yīng)進(jìn)行的同時，減少骨吸收反應(yīng)，也許能夠改善股骨頭壞死塌陷的病理過程。

綜上所述，當(dāng)股骨頭壞死發(fā)生時，整個股骨頭不同位置結(jié)構(gòu)的微觀變化過程并不相同，因此對于股骨頭壞死的治療應(yīng)該有針對性。對于軟骨下骨區(qū)，保護(hù)好骨-軟骨連接，維持骨與軟骨之間的屏障，使其能夠繼續(xù)維持軟骨的生理微環(huán)境穩(wěn)定從而防止新生血管的長入，預(yù)防軟骨下骨折的發(fā)生，保護(hù)關(guān)節(jié)面完整性。對壞死區(qū)死骨進(jìn)行保留，改變成骨方式，轉(zhuǎn)破骨性骨修復(fù)為成骨性骨修復(fù)，從而增加支撐強(qiáng)度，避免塌陷的發(fā)生，如Belfrage等[22]通過大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)雙磷酸鹽能夠減緩大鼠體內(nèi)異體骨的吸收，同時可在異體骨表面直接生成新的骨小梁結(jié)構(gòu)。對于修復(fù)反應(yīng)區(qū)，在保證成骨能力的同時抑制破骨細(xì)胞的活性。對于股骨頭骨壞死標(biāo)本的研究能夠?yàn)镺NFH患者股骨頭的塌陷預(yù)防和治療提供更好的服務(wù)。我們下一步的研究將著力于收集更多早期骨壞死標(biāo)本，對早期骨壞死標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)病理和力學(xué)分析，因?yàn)殡S著病程的進(jìn)展，壞死修復(fù)過程可能存在較大差異，還有可能使得相關(guān)的力學(xué)因素隨之發(fā)生改變，這需要進(jìn)一步擴(kuò)大早期骨壞死樣本進(jìn)行研究。同時，樣本在進(jìn)行組織學(xué)處理時已經(jīng)歷較長的手術(shù)過程，相關(guān)的組織結(jié)構(gòu)可能已經(jīng)發(fā)生一些改變，這些問題是我們下一步研究的方向。