貯存時間對沼液理化性質(zhì)及白三葉種子萌發(fā)的影響

劉 敬， 吳 健 ， 梁文華， 習彥花， 方 楠， 程輝彩， 康文懷

(1河北科技大學 生物科學與工程學院， 河北 石家莊 050018； 2. 河北省科學院生物研究所， 河北 石家莊 050081)

頭孢菌素是目前應用最為廣泛的廣譜抗生素之一，頭孢菌素C是頭孢菌素類產(chǎn)品的前體，頭孢菌素C發(fā)酵產(chǎn)生大量的抗生素菌渣，每生產(chǎn)1 t抗生素大約產(chǎn)生8～10 t濕菌渣[1]，經(jīng)提取處理的菌渣仍含有少量的抗生素，直接排放污染環(huán)境破壞生態(tài)。目前企業(yè)處理抗生素菌渣所采取的技術(shù)以焚燒為主[2]，但該技術(shù)存在能耗高、嚴重污染環(huán)境等弊端，而厭氧消化可以有效避免該問題。菌渣厭氧發(fā)酵在將低品質(zhì)的生物質(zhì)能轉(zhuǎn)換為清潔能源沼氣的同時，可以顯著降低能耗、減輕環(huán)境污染，但厭氧發(fā)酵過程會產(chǎn)生大量沼液，沼液安全處理是解決厭氧發(fā)酵產(chǎn)業(yè)鏈正常運行的關(guān)鍵問題之一。

沼液中含有豐富的氮磷鉀等營養(yǎng)物質(zhì)[3]，農(nóng)用可以促進植物生長，并改善土壤環(huán)境[4-5]，減少化肥使用量。例如沼液對番茄、辣椒和水稻等作物的致病菌有明顯的抑制作用[6-7]和促進早熟禾種子萌發(fā)[8]。由于厭氧發(fā)酵存在發(fā)酵周期短，進出料時間不規(guī)范等問題，造成很多營養(yǎng)物質(zhì)無法被完全利用[9]，未完全發(fā)酵的沼液直接施入農(nóng)田會對環(huán)境和植物產(chǎn)生損害，因此需將沼液進一步貯存使營養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)分解完全，從而達到合理資源化利用頭孢菌素C菌渣的目的。目前對于牛糞等畜禽糞污沼液和秸稈類物質(zhì)的沼液應用以及貯存過程研究較多，以頭孢菌素C菌渣為原料的厭氧發(fā)酵沼液應用和貯存期間理化性質(zhì)變化文獻比較少，因此本研究為抗生素菌渣厭氧發(fā)酵沼液的無害化開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

白三葉(Trifoliumrepens)種子：購于某種業(yè)公司；沼液：取自實驗室連續(xù)運行的頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵罐，水力停留時間20 d。

1.2 方法

1.2.1 沼液理化性質(zhì)測定實驗方法

將沼液置于2 L塑料桶中，室溫、避光、密閉保存，每個月定時取一定量的沼液檢測相關(guān)理化性質(zhì)。將沼液貯存時間1～6個月分別編號為T1，T2，T3，T4，T5和T6。

1.2.2 沼液對白三葉種子萌發(fā)及生長的影響實驗方法

選擇顆粒飽滿的白三葉種子并用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的KMnO4溶液消毒30 min，用去離子水清洗干凈后用濾紙吸去表面水分備用。

用直徑為90 mm的平板平鋪3層濾紙作為發(fā)芽床，每個平板放置50粒種子，將其均勻放置。將貯存時間為1和6個月的頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵沼液經(jīng)過3層紗布過濾后逐步稀釋，稀釋倍數(shù)為0，10，20，40，60，80，100，200，300，400，500倍。以去離子水處理組作為對照，每個處理設置3個平行，在第3、7天統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)，在白三葉種子萌發(fā)的第7天，測量其根長、芽長、鮮重、干重。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 沼液理化性質(zhì)測定指標及方法

在不同貯存時間測其pH值，電導率，VFA，TIC，SCOD，總磷，氨氮等。VFA和TIC：Nordmann滴定法[10]。SCOD和氨氮：8000 rpm離心10 min后取上清，用連華試劑盒測定。全磷：鉬酸銨分光光度法[11]。

1.3.2 沼液對白三葉種子萌發(fā)及生長的影響測定指標及方法

統(tǒng)計白三葉生長發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長、根長、活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽勢=(發(fā)芽初期(3天內(nèi)發(fā)芽種子數(shù))/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率=(第7天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)；

式中：Gt為處理t日的發(fā)芽數(shù);Dt為相應的發(fā)芽天數(shù)； 活力指數(shù)=(根長+芽長)×發(fā)芽指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用spss10.0對實驗進行方差分析(One-way ANOVA)，用DPS7.05進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析(Duncan法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯存時間對沼液理化性質(zhì)的影響

為確定貯存時間對沼液理化性質(zhì)的影響，在不同貯存時間(半年內(nèi))，分別對頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵沼液進行定期取樣，測定其pH值，電導率，VFA/TIC，SCOD，總?cè)芙庑粤?、氨氮等理化指標?/p>

2.1.1 貯存時間對沼液pH值和電導率的影響

沼液貯存過程中pH值和電導率變化如圖1所示，結(jié)果表明，pH值在7.05～8.36范圍內(nèi)，貯存期間pH值呈弱堿性，隨著貯存時間延長，沼液的pH值和電導率均呈逐漸升高趨勢；電導率主要受自由移動的離子影響，電導率范圍在25.9 ～28.55 ms·cm-1，隨著貯存時間延長，沼液電導率呈逐漸增加的趨勢，保證植物生長的EC值應該0.2～0.6 ms·cm-1范圍內(nèi)[12]，遠超于種子發(fā)芽最適電導率，因此沼液原液對種子發(fā)芽有很強抑制作用，不能直接使用。

圖1 不同貯存時間對沼液pH值和電導率的影響

2.1.2 貯存時間對沼液VFA，TIC和SCOD的影響

SCOD(可溶性有機物)值由13560 mg·L-1降至2350 mg·L-1，降低了84.6%，說明在起始沼液中存在大量有機物，發(fā)酵不完全。在沼液貯存過程中，隨著沼液中微生物對有機物的降解，SCOD水平顯著下降，而在貯存第6個月時，由于大部分有機物已經(jīng)降解，導致微生物活動較緩慢，從而SCOD值變化較小。如圖2和圖3所示。沼液在貯存0～6個月內(nèi)迅速下降后趨于平緩，SCOD維持在2400 mg·L-1，也證明了發(fā)酵越完全的沼液SCOD值越低，更適用于農(nóng)田作為肥料，按照國家《蔬菜灌溉水質(zhì)標準》要求化學需氧量≤150 mg·L-1，因此沼液農(nóng)田應用時應該稀釋相應的倍數(shù)才能將其用于灌溉。

圖2 不同貯存時間對沼液VFA和TIC的影響

圖3 不同貯存時間對沼液SCOD的影響

隨著貯存時間延長，VFA(揮發(fā)性酸)在貯存6個月含量逐漸降低，由10549 mg·L-1降至1307.5 mg·L-1，降低了87.6%，之后趨于平緩。揮發(fā)性酸是由發(fā)酵產(chǎn)酸菌利用小分子化合物產(chǎn)生，甲烷菌主要利用小分子VFA形成甲烷，在貯存0～3個月，微生物發(fā)酵導致VFA消耗較快，貯存4～6個月之間趨于平緩，這與SCOD的變化趨勢類似，表明貯存過程延續(xù)了厭氧發(fā)酵，隨著剩余可利用的有機物含量及VFA的進一步消耗，發(fā)酵基本結(jié)束。TIC(碳酸氫鹽堿度)值顯著升高后維持不變。TIC值由6400 mg·L-1增至15900 mg·L-1，增加了148.4%。而VFA/TIC是衡量厭氧發(fā)酵過程中發(fā)酵液性質(zhì)穩(wěn)定的一個重要指標[13]，由圖2可知，在沼液貯存6個月期間系統(tǒng)的VFA/TIC值由1.65降至0.082，貯存末期的發(fā)酵趨于穩(wěn)定。

2.1.3 貯存時間對沼液總磷、氨氮的影響

沼液中的總磷和氨氮都是保證植物生長所必要的營養(yǎng)元素，沼液中TP(總磷)的含量隨著貯存時間的增長顯著降低，TP由114.4 mg·L-1降至77.4 mg·L-1，降低了32.3%，并且在貯存初期總磷含量降低較緩慢，后期下降較快速，沼液中的氮主要是以氨態(tài)氮形式存在[14]，沼液中氨氮含量隨著貯存時間的增長無顯著變化，在3700 mg·L-1左右浮動(見圖4)。氨氮是由含氮有機物分解產(chǎn)生，在體系中的分解、揮發(fā)、吸附沉淀和硝化作用以及被甲烷菌等微生物利用的過程中達到并維持動態(tài)平衡狀態(tài)[15]。

圖4 貯存時間對沼液總磷、氨氮的影響

2.2 貯存時間沼液對白三葉萌發(fā)和幼苗生長的影響

根據(jù)上述研究結(jié)果，由于發(fā)酵中新出的沼液有機質(zhì)含量較高毒性較強，對植物影響較大，為了探究不同貯存時間對白三葉萌發(fā)的影響，分別選取了貯存時間為1和6個月的沼液，進行種子萌發(fā)試驗，觀察不同貯存時間對白三葉種子萌發(fā)和生長指標的影響。

2.2.1 貯存時間沼液對白三葉種子萌發(fā)參數(shù)影響

發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是描述種子萌發(fā)以及長勢的指標。由表1所示，沼液原液無法使白三葉萌發(fā)，但是隨著沼液稀釋倍數(shù)的增大，發(fā)芽率和發(fā)芽勢在抑制解除后與對照無顯著差異，沼液對發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)高濃度抑制，低濃度促進。

表1 貯存時間對白三葉種子萌發(fā)的影響

T1在沼液稀釋20倍以下三葉草不萌發(fā)，稀釋200倍時，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)與對照無顯著差異，解除抑制作用；發(fā)芽指數(shù)在稀釋60倍時與對照無顯著差異，并且在稀釋300倍時相比對照提高了37.5%；活力指數(shù)在稀釋400倍時相比對照提高了10.9%。T6在沼液稀釋10倍以下三葉草基本不萌發(fā)，在沼液稀釋60倍時，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與對照無顯著差異，解除抑制作用；沼液稀釋100倍時，發(fā)芽指數(shù)相比對照提高了37.4%；活力指數(shù)相比對照提高了16.4%。也表明了高濃度沼液對種子有顯著的抑制作用和毒害作用，沼液稀釋一定倍數(shù)后抑制作用解除，綜合考慮T1在稀釋300倍時效果最好，而T6在稀釋100倍時效果最好，也說明了抗生素沼液貯存一定時間可以減少毒害作用，并且稀釋相應倍數(shù)可以促進白三葉的萌發(fā)。

2.2.2 沼液貯存時間對白三葉幼苗生長的影響

根長、芽長、鮮重和干重是衡量幼苗生長情況的指標。由圖5～圖8可知，采用不同濃度沼液對幼苗生長有不同影響，沼液對根長和芽長有不同程度促進作用，沼液高濃度抑制白三葉根、芽生長，低濃度促進。T1對根長有顯著的抑制作用，在沼液稀釋400倍時，根長達到最長；芽長、干重和鮮重分別在沼液稀釋200倍、100倍、100倍與CK相比無顯著差異，芽長在稀釋400倍時相比CK提高了10.7%，鮮重在稀釋400倍時相比對照提高了10.6%。T6隨著沼液稀釋倍數(shù)的增大，出現(xiàn)先抑制后促進的現(xiàn)象，根長在沼液稀釋100倍時與對照無顯著差異，芽長、鮮重和干重分別在沼液稀釋80倍時解除抑制，根長在稀釋300倍時相比對照增加了17.1%，芽長在稀釋100倍時相比對照提高了9.3%，在稀釋100倍時相比對照增加了14.9%。也說明了沼液在稀釋一定的倍數(shù)可以促進幼苗的生長和發(fā)育，綜合考慮幼苗生長指標的影響，T1在沼液稀釋400倍時幼苗生長最好，而T6在稀釋100倍時幼苗生長最好。

圖5 不同貯存時間對白三葉芽長的影響

圖6 不同貯存時間對白三葉根長的影響

圖7 不同貯存時間對白三葉鮮重的影響

圖8 不同貯存時間對白三葉干重的影響

3 討論

3.1 貯存時間對沼液理化性質(zhì)的影響

目前針對沼液農(nóng)用、畜禽糞污和農(nóng)作物秸稈沼液貯存期間理化性質(zhì)變化等方面的研究相對較多，但是對抗生素菌渣厭氧發(fā)酵沼液貯存變化特征未見相關(guān)報道。沼液中的成分較為復雜，而不同原料之間也存在很大差異，甚至同一豬場產(chǎn)生沼液都有很大不同[16]。本試驗將沼液貯存6個月，觀察理化性質(zhì)的變化，表明抗生素菌渣厭氧發(fā)酵沼液貯存一定時間，pH值和電導率均呈上升趨勢，這一結(jié)果與黃丹丹[17]等和對豬糞沼液貯存46天內(nèi)pH值緩慢上升結(jié)論一致。pH值越大，電導率也隨之增大，堿性條件有助于SCOD和溶解性蛋白質(zhì)和部分磷的溶出[18]，堿性條件下電導率會增加。在沼液貯存過程中SCOD值顯著降低，與張麗萍[19]等對豬糞沼液貯存維持11天化學需氧量也呈逐漸減小并趨于平穩(wěn)的趨勢結(jié)果相一致，其整體下降了69%以上，本試驗為貯存時間0～6個月降低了84.6%，可能是由于厭氧發(fā)酵原料不同導致貯存周期變長。

總磷和氨氮作為營養(yǎng)物質(zhì)，是植物生長所需要的必要營養(yǎng)元素，沼液在貯存過程中氨氮濃度相對比較穩(wěn)定。此結(jié)論與劉慶玉[20]等對沼液貯存結(jié)論不同，貯存時間為30天，氨氮含量在遮光、厭氧條件下會上升，在光照、自然貯存會降低，但本試驗得到氨氮與貯存時間無顯著差別的結(jié)論，可能與貯存方式不同有關(guān)?？偭自谫A存過程中有下降趨勢，而這與李曉娟[21]對不同貯存方式貯存玉米秸稈沼液總磷下降了51%以上，而在貯存環(huán)境30℃，遮光耗氧條件下總磷含量下降最快，總磷變化一致?？偭缀肯陆翟蚩赡苁橇姿犷愇镔|(zhì)被孔隙度較大的物質(zhì)吸附，或者與其他物質(zhì)發(fā)生化學反應不斷沉降到沼渣中所造成，同時沼液貯存過程中受季節(jié)的環(huán)境溫度不同而影響到的微生物活性，物質(zhì)利用速率隨之受到影響。

各項理化指標變化進一步說明在初始階段沼液尚未發(fā)酵完全，還有大量未發(fā)酵的有機物，直接施用會對植物和土壤造成損害，需要將沼液貯存一定時間再施用。

3.2 不同貯存時間沼液對白三葉萌發(fā)和幼苗生長的影響

高濃度沼液對白三葉種子萌發(fā)和生長有顯著的抑制作用，尤其沼液原液無法使白三葉萌發(fā)，隨著稀釋倍數(shù)的增加，抑制效果會逐漸降低，而沼液低濃度會促進白三葉種子的萌發(fā)和生長。T1在稀釋200倍時白三葉萌發(fā)的各項指標與CK無顯著差異，解除抑制，低濃度沼液對白三葉萌發(fā)無顯著影響，但是對幼苗生長影響較大，綜合各項指標其最適稀釋倍數(shù)為400倍，T6在稀釋60倍時白三葉萌發(fā)的各項指標基本解除抑制，而綜合各項指標其最適稀釋濃度為100倍，這一結(jié)果與唐才祿[22]等對沼液對生姜催芽效果在適宜濃度上有差異，可能是由于厭氧發(fā)酵原料和沼液組成不同導致的。

T6與T1相比，白三葉種子萌發(fā)和幼苗生長的各項參數(shù)解除抑制的沼液稀釋倍數(shù)要低，但是隨著沼液稀釋倍數(shù)的增大，就會造成各項參數(shù)(除根長)都要顯著低于貯存6個月的沼液，這證明了隨著貯存時間的增長，沼液毒性會降低，但是營養(yǎng)物質(zhì)也隨之降低。T1根長遠低于T6根長，但是芽長兩者在適宜的濃度都會促進其生長，也說明了白三葉根和芽對于毒性的敏感性不同，根要比芽敏感。沼液可用于農(nóng)用，但是將其直接作用于農(nóng)田有一定風險[23]。將沼液貯存一段時間，貯存期間還可以將降低銅、鋅和砷等重金屬的含量以及大腸桿菌數(shù)量[24]，將其用于農(nóng)用也會減少重金屬富集和有害微生物風險，并且本試驗也表明了沼液貯存一定時間，對種子毒性減小，將其利用時稀釋倍數(shù)也逐漸減小。綜上所述，頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵沼液貯存一定時間，毒性和對植物傷害會降低，稀釋到適宜的倍數(shù)，會促進白三葉種子的萌發(fā)和幼苗生長。

4 結(jié)論

(1)頭孢菌素C菌渣厭氧發(fā)酵沼液隨貯存時間延長，VFA和SCOD顯著下降，TIC顯著上升，pH值，電導率和總磷呈下降趨勢，氨氮濃度相對比較穩(wěn)定。

(2)高濃度沼液顯著抑制種子萌發(fā)、根和芽的生長。貯存6個月的沼液，稀釋60倍以上解除抑制作用，并且在適宜濃度還顯著促進種子萌發(fā)、根、芽的生長。

(3)貯存1個月的沼液稀釋300倍時，發(fā)芽指數(shù)達到最大，增長了37.5%，沼液稀釋400倍時，活力指數(shù)、芽長和鮮重分別提高10.9%，10.7%和10.6%。貯存6個月的沼液稀釋300倍時，根長達到最大，相比CK增大9.3%，沼液稀釋100倍時，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長和鮮重分別提高37.4%，16.4%，9.3%，14.9%。