外源GABA對西伯利亞白刺幼苗鹽脅迫傷害緩解效應(yīng)

劉 威，王 賀，王 驍，趙 野，鄭曌鈺，肖雅楠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

土壤鹽分是全球農(nóng)業(yè)主要非生物脅迫[1]，鹽脅迫導(dǎo)致滲透脅迫和離子毒害，影響植物正常生長發(fā)育。鹽脅迫對植物的危害存在于各方面，包括對種子萌發(fā)[2]、光合作用[3]、離子積累及抗氧化系統(tǒng)[4]等方面。植物為應(yīng)對鹽脅迫已形成許多復(fù)雜生理機(jī)制，如調(diào)控體內(nèi)鹽分分配、滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除等。除此之外，激素調(diào)節(jié)、多胺及植物體信號物質(zhì)也參與抵御鹽脅迫過程。

γ-氨基丁酸（GABA）是一種在植物體內(nèi)天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，更是一種重要的胞內(nèi)信號分子，參與植物體內(nèi)與脅迫相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控[5]。GABA在植物體內(nèi)由谷氨酸脫酸酶（GAD）催化L-谷氨酸脫羧和多胺降解兩條途徑生成；GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）是代謝關(guān)鍵酶，促使其分解代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA）。正常情況下，植物組織中GABA含量較低，在植物受到逆境脅迫時，刺激GAD活性提升，誘導(dǎo)GABA迅速積累，防止細(xì)胞酸中毒，從而對植物起到保護(hù)作用。此外，在GABA分解過程中可通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)pH、誘導(dǎo)激素合成（如乙烯等）和滲透調(diào)節(jié)等方式提高植物適應(yīng)性，增強(qiáng)植物抗逆性[6]。外源施用GABA顯著增強(qiáng)植物對各種非生物脅迫耐受性，據(jù)報道，外源GA?BA應(yīng)用通過促進(jìn)與次級代謝相關(guān)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累提高匍匐剪股穎抗旱能力[7]，也通過改善光合作用保護(hù)玉米幼苗免受鹽分傷害[8]。

西伯利亞白刺（Nitraria sibiricaPall.）為蒺藜科白刺屬（NitrariaL.）落葉具刺灌木，因其具有較強(qiáng)耐鹽能力，成為改良鹽堿化土壤主要造林樹種。當(dāng)前國內(nèi)外對西伯利亞白刺響應(yīng)鹽脅迫研究主要集中于鹽脅迫下西伯利亞白刺種子萌發(fā)[9]、光合特性[4]、離子平衡[10]及轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等方面。鹽分對白刺的影響與濃度相關(guān)，研究表明，低濃度NaCl（200 mmol·L-1）處理使西伯利亞白刺幼苗Na+含量顯著增加并降低根中K+/Na+[10]；中度NaCl脅迫（300 mmol·L-1）影響唐古特白刺光合作用能力[11]；高鹽度NaC（l400 mmol·L-1）抑制白刺生長[9]。此外，鹽脅迫還影響白刺氮代謝關(guān)鍵酶活性，抑制谷氨酰胺合成，從而降低白刺氮代謝速率，對白刺生長發(fā)育造成傷害[11]。

然而，鮮有報道外源GABA對鹽脅迫下西伯利亞白刺幼苗生長特性及GABA支路的影響。本試驗通過研究200 mmol·L-1NaCl脅迫下，施加不同濃度外源GABA對西伯利亞白刺幼苗生理特性和GABA代謝支路中代謝物和關(guān)鍵酶活性的影響，探究外源GABA提高白刺耐鹽性作用機(jī)理，為外源應(yīng)用GABA減輕植物鹽脅迫傷害和提高植物抗鹽性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西伯利亞白刺種子由吉林白城市林業(yè)科學(xué)院提供。挑選籽粒飽滿，大小均一種子，用體積分?jǐn)?shù)10%NaClO溶液消毒5 min，流水和蒸餾水分別沖洗5次后，置于光照培養(yǎng)箱中。待其長至4~5片真葉時定植于花盆中，挑選長勢一致一年生實生苗，移植于純凈河沙花盆中，1/2 Hoagland全營養(yǎng)液澆灌培養(yǎng)。緩苗后對幼苗進(jìn)行鹽處理，試驗處理如表1所示，每個處理3次重復(fù)，共18盆。每天同一時間噴施5、10 mmol·L-1GABA溶液，以全部葉片濕潤，但無過量GABA溶液滴下為標(biāo)準(zhǔn)，7 d后取樣并測定相關(guān)指標(biāo)。

表1 試驗處理Table 1 Experimental treatments

1.2 試驗設(shè)計

試驗于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗站開展。試驗設(shè)置鹽分（NaCl分析純，0、200 mmol·L-1），GABA（Sigma，0、5、10 mmol·L-1）兩因素隨機(jī)組合，設(shè)置6個處理（見表1），3次重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

測量不同處理下西伯利亞白刺幼苗鮮重和干重，通過計算得出根莖比和葉片肉質(zhì)化程度。公式如下：根莖比（%）=（地下根部分干重/地上莖部分干重）×100；葉片肉質(zhì)化程度（%）=（葉鮮重/葉干重）×100；測定不同處理下西伯利亞白刺株高；參照李合生方法測定相對含水量、葉片葉綠素含量、電解質(zhì)外滲率、丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量[12]；考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白含量；參照Zhang和Bown方法測定內(nèi)源GABA含量[13]；參照Bartyzel等方法測定GAD活性[14]；利用ELISA試劑盒測定GABA-T活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

GraphPad Prism 7.0軟件處理數(shù)據(jù)并繪圖，運(yùn)用SPSS25.0軟件分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GABA對鹽脅迫下西伯利亞白刺幼苗生理特性的影響

如表2所示，外源噴施不同濃度GABA對西伯利亞白刺幼苗株高和根莖比有抑制作用，隨GABA濃度升高，株高和根莖比呈降低趨勢。鹽脅迫（T3）下西伯利亞白刺幼苗株高和根莖比與對照差異顯著，對西伯利亞白刺株高產(chǎn)生抑制作用，株高下降23%。但對西伯利亞白刺幼苗根莖比有顯著促進(jìn)作用，因西伯利亞白刺為一種鹽生植物，200 mmol·L-1NaCl導(dǎo)致地下部分生長活躍。在NaCl脅迫下施用5 mmol·L-1GABA（T4）顯著增加西伯利亞白刺株高，其高度較NaCl處理（T3）增加17.9%，且5 mmol·L-（1T4）與10 mmol·L-1（T5）GABA對鹽脅迫下西伯利亞白刺株高降低的緩解作用無顯著差異。但T4和T5處理顯著降低根莖比，隨外源GABA濃度升高對鹽脅迫下根莖比的影響表現(xiàn)為先降后升。說明鹽脅迫下適宜濃度外源GABA促進(jìn)西伯利亞白刺幼苗生長且對莖的促進(jìn)作用大于根。

表2 NaCl脅迫下不同濃度GABA對西伯利亞白刺幼苗生理特性的影響Table2 Effectsof different concentrationsof GABA on physiological characteristicsof N.siberia seedlingsunder NaCl stress

外源噴施不同濃度GABA溶液，西伯利亞白刺幼苗葉片相對含水量呈先增后降趨勢，最大值時GABA濃度為5 mmol·L-（1T1），而隨GABA濃度升高，葉綠素含量下降，與對照組差異顯著。鹽脅迫（T3）導(dǎo)致西伯利亞白刺幼苗相對含水量和葉綠素含量顯著下降（P<0.05），分別比對照降低6.15%和32.9%。鹽脅迫下噴施不同濃度外源GABA，葉片相對含水量呈增加趨勢，與鹽脅迫（T3）差異顯著，說明外源GABA對鹽脅迫西伯利亞白刺幼苗滲透脅迫有緩解作用。不同濃度外源GABA對西伯利亞白刺幼苗在鹽濃度為200 mmol·L-1下葉綠素合成具有一定促進(jìn)作用，當(dāng)GABA濃度為5 mmol·L-1（T4）時，對西伯利亞白刺幼苗中葉綠素含量增加效果最明顯，相比于T3增加39.2%，差異顯著（P<0.05）。雖然T5高于T4但差異不明顯，可以看出，隨GABA濃度增加葉綠素含量在不斷積累但變化趨于穩(wěn)定。

正常栽培條件下施加5、10 mmol·L-1GABA對丙二醛含量和電解質(zhì)外滲率影響不明顯；NaCl處理下（T3）西伯利亞白刺葉片中丙二醛含量顯著升高，較對照增加約0.3倍；施加不同濃度GABA后MDA含量顯著降低，分別降低50.47%和23.37%，西伯利亞白刺葉片中MDA含量最低時GABA濃度為5 mmol·L-（1T4）。鹽脅迫（T3）下西伯利亞白刺幼苗電解質(zhì)外滲率增加，是對照3.1倍。外源施用GABA降低鹽脅迫下西伯利亞白刺幼苗電解質(zhì)外滲率，當(dāng)GABA濃度為5 mmol·L-（1T4）時，電解質(zhì)外滲率最低。說明適宜濃度外源GABA（5 mmol·L-1）可緩解鹽脅迫對植物細(xì)胞膜傷害，減少離子流動，降低葉片電解質(zhì)外滲率和丙二醛含量。

2.2 外源GABA對鹽脅迫下西伯利亞白刺幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

從圖1可看出，無NaCl脅迫下，脯氨酸含量隨GABA濃度增加呈先升后降趨勢，并在GABA濃度為5 mmol·L-1時達(dá)到最大值。NaCl處理下脯氨酸含量較對照增加0.3倍，差異顯著。噴施GABA后脯氨酸含量隨GABA濃度升高呈先降后略微上升趨勢，分別較NaCl處理下降11.06%和4.40%，當(dāng)GABA濃度為5 mmol·L-1時脯氨酸含量最低。說明鹽脅迫條件下西伯利亞白刺積累脯氨酸參與滲透調(diào)節(jié)，防止細(xì)胞內(nèi)水分過度流失，且外源GABA在一定程度上緩解NaCl脅迫下西伯利亞白刺葉片脯氨酸含量增加。

圖1 NaCl脅迫下不同濃度外源GABA對西伯利亞白刺幼苗脯氨酸含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of exogenous GABA on prolinecontents in N.siberia seedlingsunder NaCl stress

如圖2所示，正常條件下，隨GABA濃度升高，西伯利亞白刺葉片可溶性糖含量逐漸減少，當(dāng)濃度升至10 mmol·L-1時，葉片中可溶性糖含量較對照降低34.2%。然而，鹽脅迫使可溶性糖含量大量積累，約為對照1.1倍，差異顯著。外源GA?BA使鹽脅迫下西伯利亞白刺可溶性糖含量大幅下降，且隨GABA濃度升高表現(xiàn)出先降后升趨勢，當(dāng)GABA濃度為5 mmol·L-1時西伯利亞白刺體內(nèi)可溶性糖含量最低。說明在西伯利亞白刺遭受鹽脅迫時，加速體內(nèi)以淀粉形式存在糖的水解作用，增加體內(nèi)可溶性糖含量，而一定濃度外源GABA緩解西伯利亞白刺葉片淀粉水解作用，降低可溶性糖含量。

圖2 NaCl脅迫下不同濃度外源GABA對西伯利亞白刺幼苗可溶性糖含量的影響Fig.2 Effect of different concentrationsof exogenous GABA on the solublesugar contents in N.siberia seedlings under NaCl stress

NaCl及外源GABA對西伯利亞白刺葉片可溶性蛋白含量影響如圖3所示，正常栽培條件下外源GABA提高可溶性蛋白含量，當(dāng)GABA濃度為5 mmol·L-1時，可溶性蛋白含量達(dá)峰值，與對照差異顯著（P<0.05）；NaCl脅迫降低西伯利亞白刺葉片可溶性蛋白含量，但外源GABA處理使可溶性蛋白含量先略微上升而后顯著下降，10 mmol·L-1GA?BA處理時可溶性蛋白含量降到最低。表明在鹽脅迫條件下，西伯利亞白刺滲透能力減弱，可溶性蛋白含量降低，且適宜濃度外源GABA對鹽脅迫下西伯利亞白刺可溶性蛋白含量增加具有一定作用。

2.3 外源GABA對鹽脅迫下西伯利亞白刺幼苗GABA支路的影響

由圖4可看出，無論正常栽培還是鹽脅迫下，適宜濃度外源GABA處理可增加西伯利亞白刺幼苗葉片內(nèi)源GABA含量。非NaCl脅迫條件下，外源施用10 mmol·L-1GABA提高西伯利亞白刺幼苗葉片內(nèi)源GABA含量，是對照1.03倍；NaCl處理導(dǎo)致內(nèi)源性GABA大量積累，而外源GABA降低鹽脅迫下西伯利亞白刺幼苗體內(nèi)GABA含量。隨外源GABA濃度增加，內(nèi)源性GABA含量表現(xiàn)為先降后升趨勢，當(dāng)GABA濃度為5 mmol·L-1時，顯著降低鹽脅迫下內(nèi)源GABA含量，且與對照無明顯差異。表明適宜濃度外源GABA可增加正常栽培條件下西伯利亞白刺幼苗內(nèi)源GABA含量，同時在鹽脅迫下，適宜濃度外源GABA有效促進(jìn)內(nèi)源GABA合成與積累，為GABA支路提供豐富前體物質(zhì)，降低鹽脅迫對西伯利亞白刺傷害。

圖3 NaCl脅迫下不同濃度外源GABA對西伯利亞白刺幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of exogenous GABA on thesolubleprotein contentsin N.siberia seedlings under NaCl stress

圖4 NaCl脅迫下不同濃度外源GABA對西伯利亞白刺幼苗內(nèi)源GABA含量的影響Fig.4 Effect of different concentrations of exogenous GABA on theendogenous GABA contentsin N.siberia seedlings under NaCl stress

GAD活性變化影響西伯利亞白刺體內(nèi)GABA含量。由圖5可知，正常條件下，外源施加GABA對西伯利亞白刺幼苗葉片內(nèi)GAD活性無明顯影響，200 mmol·L-1NaCl處理下GAD活性達(dá)到最大值且顯著高于對照（P<0.05）；鹽脅迫下施加外源5、10 mmol·L-1GABA，GAD活性分別低于單獨(dú)NaCl脅迫處理組1.1%和0.8%。由此表明，鹽脅迫使GAD活性升高，促進(jìn)L-Glu脫羧生成GABA，促進(jìn)GABA積累，且外源噴施GABA降低GAD活性。

圖5 NaCl脅迫下不同濃度外源GABA對西伯利亞白刺GAD活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of exogenous GABA on GAD activitiesin N.siberia under NaCl stress

GABA-T是GABA分解關(guān)鍵酶，在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。由圖6可知，外源施用GABA增強(qiáng)GABA-T活性，西伯利亞白刺幼苗內(nèi)GABA-T活性與GABA濃度呈正相關(guān)，當(dāng)GABA濃度為10mmol·L-1時達(dá)到最大值，顯著高于對照，是對照1.2倍；NaCl處理降低GABA-T活性，但影響不顯著，隨GABA濃度增加，GABA-T活性先升后降。當(dāng)GABA濃度為10 mmol·L-1時，分別低于同組鹽處理和5 mmol·L-1GABA處理14.3%和16.7%，與其他處理組差異顯著（P<0.05）。由此表明，正常情況下施加外源GA?BA提高西伯利亞白刺幼苗葉片內(nèi)GABA-T活性，但外源GABA降低鹽脅迫下GABA-T活性，從而促進(jìn)內(nèi)源GABA積累。

圖6 NaCl脅迫下不同濃度外源GABA對西伯利亞白刺GABA-T活性的影響Fig.6 Effectsof different concentrations of exogenous GABA on GABA-T activitiesin N.siberia under NaCl stress

3 討論與結(jié)論

土壤鹽分對植物生長有不利影響，植株高度和根莖比是重要生長指標(biāo)。本研究中鹽脅迫對西伯利亞白刺影響表現(xiàn)在株高顯著變矮而根莖比顯著升高。雖然西伯利亞白刺耐鹽性較強(qiáng)，但其地上莖部、地下根部受鹽脅迫影響程度不同。這與低濃度鹽對黑果枸杞幼苗根生長具有促進(jìn)作用，對莖生長影響不明顯結(jié)果一致[15]。植物通過多種生理生化作用相互影響應(yīng)對鹽脅迫，葉片相對含水量是植物體內(nèi)各種生理指標(biāo)綜合體現(xiàn)。本研究中，鹽處理降低西伯利亞白刺幼苗葉片相對含水量，與鹽脅迫下菊花幼苗相對含水量顯著下降結(jié)論一致[16]，說明鹽處理使土壤水勢降低，導(dǎo)致植物吸水困難。

當(dāng)植物缺水時，細(xì)胞將積累脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)能力，提高細(xì)胞保水性并維持水分平衡。本研究中，脯氨酸和可溶性糖含量在鹽脅迫下顯著增加，可溶性蛋白降低，與酸棗中3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均增加研究結(jié)果不一致[17]。可能原因是西伯利亞白刺遭受鹽脅迫時，葉片細(xì)胞受離子毒害，促使蛋白質(zhì)分解，使可溶性蛋白含量下降。鹽脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基，MDA含量高低和電解質(zhì)外滲率可衡量膜損傷程度。本研究中兩者變化趨勢與觀音竹研究結(jié)果一致[18]。植物內(nèi)源GABA含量變化趨勢與GAD和GABA-T活性有關(guān)，本研究中鹽脅迫下西伯利亞白刺幼苗葉片內(nèi)源GABA積累是因GAD活性增加，GABA-T活性無顯著變化，與Zarei等發(fā)現(xiàn)GABA高積累是由于GAD激活和GABA-T抑制引起的研究結(jié)果一致[19]。

本研究中，NaCl脅迫下西伯利亞白刺幼苗表現(xiàn)出典型鹽分破壞癥狀，包括株高、相對含水量、葉綠素含量顯著降低，丙二醛、電解質(zhì)外滲率顯著升高。外源GABA處理后，5 mmol·L-1GA?BA對恢復(fù)鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片相對含水量效果最佳，施加不同濃度外源GABA均增加葉綠素水平以減輕鹽脅迫造成損害。上述結(jié)果表明，通過添加外源GABA，可減弱西伯利亞白刺幼苗生長受到的抑制，與王馨對西伯利亞白刺研究一致[20]。鹽脅迫引起滲透和氧化脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加，GABA被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化過程中MDA形成抑制劑[21]。當(dāng)前的研究中，鹽脅迫下外源GABA處理后MDA和電解質(zhì)外滲率均顯著下降，且5 mmol·L-1緩解效果最佳，證明葉面噴施GABA溶液提高西伯利亞白刺抵抗鹽脅迫能力。本研究中鹽脅迫下可溶性糖含量大量積累，這與李煥勇等對鹽脅迫下小果白刺研究結(jié)果一致[22]，添加GABA溶液可溶性糖呈下降趨勢，說明一定濃度外源GABA可緩解西伯利亞白刺葉片淀粉水解作用，降低可溶性糖含量。鹽脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成代謝增強(qiáng)，提高滲透調(diào)節(jié)能力以促進(jìn)植物適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。本研究中，鹽處理下5 mmol·L-1GABA溶液促進(jìn)可溶性蛋白增加，提高細(xì)胞保水能力，保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷，但過量濃度GABA溶液抑制可溶性蛋白合成。此外，本研究結(jié)果顯示，脯氨酸在西伯利亞白刺體內(nèi)積累以適應(yīng)鹽環(huán)境，可能是由于鹽脅迫影響脯氨酸合成代謝酶活性，致使脯氨酸含量升高以維持細(xì)胞內(nèi)滲透平衡。GABA添加降低脯氨酸含量，這與利用GABA使甜瓜抵抗Ca（NO3）2脅迫結(jié)果一致[23]。

近年來，綜合研究GABA支路生理和遺傳學(xué)表明，其功能對于植物響應(yīng)非生物脅迫（例如極端溫度和鹽分）正常生長所必需。本研究結(jié)果表明，Na?Cl處理下西伯利亞白刺葉片內(nèi)源GABA含量顯著增加，外源GABA處理雖未進(jìn)一步增加但也顯著高于正常條件下GABA含量，與鹽堿脅迫下施加GABA對甜瓜品種“金輝”胚芽中GABA含量研究結(jié)果一致[24]。GAD和GABA-T是GABA合成和分解關(guān)鍵酶，在植物對逆境的防御反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中，鹽脅迫顯著增加GAD活性但對GABA-T活性無顯著影響。外源添加不同濃度GABA后GAD活性均降低，而GABA-T呈先升后降趨勢，其中GA?BA-T降低較顯著，與干旱脅迫下白三葉GAD和GABA-T活性均增加，但第10天加入外源GABA后，兩種酶活性均降低結(jié)果一致[25]。在鹽脅迫時添加GABA后西伯利亞白刺體內(nèi)GABA含量仍較高，可能是由于較低GABA降解速率，并非與GAD活性增加有關(guān)，這與Rujira研究結(jié)果一致[26]。

綜上所述，NaCl脅迫對西伯利亞白刺幼苗株高、根莖比、相對含水量、葉綠素含量、MDA含量、電解質(zhì)外滲率、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和GABA代謝關(guān)鍵物質(zhì)含量和關(guān)鍵酶活性產(chǎn)生影響，且外源噴施GABA后，通過對滲透調(diào)節(jié)以及GABA支路的影響產(chǎn)生緩解NaCl脅迫的效果。上述研究結(jié)果為改善鹽堿地和培育鹽生植物提供理論基礎(chǔ)。