超高壓處理對熱鮮豬肉中乳酸的影響

張慧娟，潘見

1.廣東力泰德食品工程有限公司（佛山 528225）；2.合肥工業(yè)大學農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心（合肥 230009）

乳酸是肌肉組織內(nèi)的糖類代謝產(chǎn)物[1]。動物屠宰后，要經(jīng)歷成熟過程，期間肌肉中的糖原先水解成葡萄糖，再經(jīng)過無氧酵解變成乳酸，糖酵解過程生成的乳酸不再像活體動物那樣被轉(zhuǎn)運到肝臟中而后合成肝糖原或通過血液循環(huán)而被排除到體外，而是在肌肉細胞內(nèi)蓄積起來，導致pH的下降[2-3]。同時，乳酸的大量生成會造成冷卻肉的保水性及嫩度不同程度下降，這與PSE（pale，soft and exudative）肉和DFD（dark，firm and dry）肉的產(chǎn)生有密切關系[4]。因此乳酸含量對肉的品質(zhì)影響尤為重要。

超高壓能夠抑制新鮮豬肉的僵化過程[5]，超高壓技術的應用未來可能替代傳統(tǒng)的吊掛排酸，為肉制品的加工提供新的方法。已有眾多學者對超高壓技術在肉中的應用做了大量的探索[6-8]，但超高壓對豬肉中乳酸含量的影響尚未見報道。通過探索超高壓對肉中乳酸含量的影響，并探索其變化的機理，以期為超高壓技術在肉品工業(yè)上的應用提供方法的完善與創(chuàng)新。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬腰肉（合肥市周谷堆農(nóng)貿(mào)市場）；乳酸標樣（純度99.9%，Sigma公司）；輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）（百靈威上海公司）；乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）（Promega公司）；牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海遠慕生物科技有限公司）；甲醇（國產(chǎn)色譜純，生工生物工程（上海）股份有限公司）；高氯酸（國產(chǎn)優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸二氫銨、磷酸、乙酸鈉、氫氧化鈉（國產(chǎn)分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；D-甘露糖醇（D-mannitol）、Tris-base（美國Amresco公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）、二硫蘇糖醇（dithiohthreitol，DTT）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）（Sigma公司）；NaF、焦磷酸鈉（天津永大化學試劑廠）；超純水（實驗室自制）；中速定量濾紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）；0.45 μm一次性針頭微孔濾膜（江蘇漢邦科技有限公司）；1 mL針器注射器（江蘇治宇醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 儀器與設備

1L超高壓系統(tǒng)（包頭科發(fā)科技有限公司）；Agilent 1260高效液相系統(tǒng)、Agilent C18（5 μm，Φ4.6 mm×250 mm）色譜柱（美國Agilent Technologies）；KH-1500SP超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；FM200分散器（德國FLUKO公司）；3K15高速冷凍離心機（Sigma公司）；UV-1600紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；pH計（上海雷磁科學儀器有限公司）；BCD-220VM（E）冰箱（美的集團）；FC104電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 肉樣的準備

1.3.1.1 成熟肉樣的準備

樣品來源于當?shù)赝涝讏觯?歲的皖北豬，每只體重為90～100 kg，按常規(guī)方法屠宰，之后在4 ℃下跟腱吊掛排酸24 h。吊掛結束后，從尸體中的腰部取出部分肉樣，并將這些肉樣平行于肌肉纖維切成大小為長8 cm×寬5 cm×高5 cm的小塊，分別用聚乙烯袋單獨真空包裝，之后儲存在-18 ℃冰箱中，直到進一步的使用。

1.3.1.2 超高壓肉樣的準備

從常規(guī)屠宰，未吊掛的、1歲、每只體重為90～100 kg的皖北豬尸體上取得腰肉樣品，共制備30個與1.3.1.1相同大小的樣本。每個樣品單獨用聚乙烯袋真空包裝，并立即進行超高壓處理。

肉樣在包裝后分別轉(zhuǎn)移到超高壓釜中。加壓介質(zhì)為油，初始溫度20 ℃（±3 ℃）。試驗采取不同壓力處理（分別為100，200，300和400 MPa），處理時間為10 min，后儲存在-18 ℃冰箱中，用于進行下一步分析。壓力分別在3～5 MPa/s之間增加和減少。

未處理的樣品保留作為對照處理。超高壓肉樣的制備在屠宰后2 h內(nèi)完成。

1.3.2 酶液準備

取適量的LDH，用100 mL生理鹽水溶解。再分別將10 mL酶液倒入聚乙烯袋中真空包裝，并立即進行超高壓處理（分別為100，200，300和400 MPa），然后儲存在4 ℃冰箱中。

未處理的樣品保留作為對照處理。

1.3.3 試驗方法

1.3.3.1 乳酸含量測定

1.3.3.1.1 色譜條件

參考朱學伸等[4]的方法，Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)；Agilent C18（5 μm，Φ4.6 mm×250 mm）色譜柱；以甲醇與10 mmol/L磷酸二氫銨混合液為流動相，體積比為5∶95，配制前磷酸二氫銨用體積分數(shù)為50%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.2，混合液在使用前經(jīng)0.45 μm的合成纖維素膜真空抽濾并超聲脫氣；0.7 mL/min流速；25℃柱溫；20 μL進樣量；210 nm紫外檢測波長。

1.3.3.1.2 樣品前處理

參考Immonen等[9]的方法，從冰箱中取出樣品，稱取1.0 g肉樣，剪碎后放入離心管中，然后加入10 mL的1 mol/L高氯酸，并在13 500 r/min條件下勻漿30 s。后勻漿液在5 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min，將上清液經(jīng)定量濾紙過濾置于25 mL容量瓶中，濾渣用10 mL高氯酸洗滌，并轉(zhuǎn)移至離心管中，再次在13 500 r/min的條件下勻漿30 s，后再次用5 500 r/min、4 ℃的條件離心10 min，上清液經(jīng)定量濾紙過濾，與前一次濾液合并轉(zhuǎn)入置于25 mL容量瓶中，并精準定容至25 mL。提取液在4 ℃條件下保存待檢測。檢測前提取液需過0.45 μm濾膜。

1.3.3.1.3 標準溶液配制及樣品測定

準確稱取100 mg乳酸標樣，用超純水定容至10 mL。然后用超純水逐級稀釋為20，40，60，80，200和250 μg/L的乳酸標準溶液。按照1.3.3.1的色譜條件進樣分析，每個質(zhì)量濃度進樣3次。以乳酸質(zhì)量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

肉樣經(jīng)1.3.1處理后，再按照1.3.3.1.2制得提取液，提取液按1.3.3.1.1的色譜條件測定。

1.3.3.2 酶活性測定方法

1.3.3.2.1 磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性檢測

參照楊雅媛等[10]的方法并作修改，取0.5 g冷凍的肉樣，剪碎后置于離心管中，加入預冷的勻漿液（pH 7.4，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，5 mmol/L焦磷酸鈉，50 mmol/L NaF，0.05 mol/L Tris-HCl，0.25 mol/LD-甘露醇）冰浴勻漿（每12 s勻漿1次，間隙20 s，重復5次）。然后在10 000 r/min、4 ℃的條件下離心5 min，取上清液用于AMPK活力的測定。測定方法參照試劑盒進行。

1.3.3.2.2 LDH活性檢測

總反應體系包括 50 mmol/L、pH 5.5的乙酸鈉緩沖液，0.2 mmol/L NADH，5 mmol/L乳酸，對照組中不含NADH，其他成分相同?；靹蚝笥?0 ℃保溫5 min，加入適量的酶液。檢測在340 nm處的吸光度。

1.3.3.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用 Excel 進行統(tǒng)計，采用SPSS進行分析，對各個指標進行差異性分析時采用Duncan方法，當p＜0.05時，表明對其影響差異顯著。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對肉中乳酸含量的影響

此次測定的乳酸含量和峰面積之間的回歸方程為Y=1.252 5X+5.573 2，R2=0.997 2，由此表明當乳酸質(zhì)量濃度在0～250 μg/mL范圍內(nèi)時，乳酸質(zhì)量濃度和峰面積之間線性良好。

不同處理條件，豬肉中的乳酸含量變化如圖1所示。與新鮮肉相比，壓力對豬肉中乳酸的變化顯著（p＜0.05）。

圖1 處理方法對豬肉中乳酸含量的影響

由圖1的結果可知，豬肉經(jīng)過吊掛成熟過程后，肉中的乳酸含量有小幅度的上升，由原來的0.83 mg/g上升為0.95 mg/g，說明肉的成熟過程是產(chǎn)生乳酸的過程。

低于或等于200 MPa壓力的處理，肉中的乳酸含量降低，可能是低于或等于200 MPa壓力抑制了乳酸的生產(chǎn)。壓力在300～400 MPa范圍內(nèi)，壓力的作用能夠引起乳酸含量的顯著變化，處理后豬肉中的乳酸含量明顯高于新鮮肉和成熟肉。當壓力從200 MPa升高到400 MPa時，乳酸含量持續(xù)增加，400 MPa肉中的乳酸含量達到最高，為5.18 mg/g。

Kijowski等[11]研究表明，乳酸能通過對肌原纖維和結締組織的弱化來改善肉的嫩度。在一定程度上，乳酸的抑菌作用可以顯著延長肉制品的貯藏期[12]。

正常情況下，乳酸的不斷生成，造成肉的pH不斷下降，乳酸生成速率下降。但此時乳酸短時間內(nèi)形成大量堆積，究其原因還需從乳酸的產(chǎn)生機制討論。

豬肉中乳酸的產(chǎn)生路線如圖2所示。糖原被分解生成丙酮酸，在缺氧的條件下丙酮酸進一步被還原為乳酸。從圖中可以看出影響乳酸生成的直接因素為底物丙酮酸的含量和LDH的酶活大小。而丙酮酸的含量主要受糖酵解的影響。

圖2 豬肉中乳酸生成的線路圖

朱庸平[13]研究表明，在糖酵解產(chǎn)生乳酸的過程中，糖原是足夠的，直到豬肉徹底熟化，糖原仍有剩余，產(chǎn)生乳酸的多少與糖酵解潛力有關。在糖酵解過程中，相關限速酶活性是影響糖酵解進程的關鍵因素[14]。在這些糖酵解限速酶中，糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase）和磷酸果糖激酶（phosphofructokinase）活性可以被腺苷酸蛋白活化激酶調(diào)控[15]。AMPK活性被激活后，可以直接磷酸化糖酵解關鍵酶并提高其活性，進而促進糖酵解[16]。

在無氧條件下，糖酵解的中間產(chǎn)物丙酮酸在LDH的作用下發(fā)生脫羧和還原反應，其中還原劑是NADH，最終生成乳酸和氧化態(tài)的NAD+[17]。超高壓對乳酸含量的影響是否是因為超高壓對AMPK和LDH的影響，將做進一步的討論。

2.2 超高壓對AMPK活性的影響

AMPK是一個異源三聚體，由α、β和γ三種亞基組成，能被機體各種刺激激活[18]。酶分子有一級、二級、三級和四級結構，不同層次的結構對酶分子具有不同的意義。超高壓通過破壞蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結構的非共價鍵，而不影響一級結構的共價鍵，從而使酶失活或增活。二級結構也是僅在非常高的壓力下才會發(fā)生結構調(diào)整，三級和四級結構受到壓力的影響最大[19]。蛋白質(zhì)結構的改變，造成了酶活大小的變化。

AMPK的活性高應該代表著糖酵解的速度也高[20]，那么丙酮酸的含量也將相應地提高，這將加快乳酸的生成。

壓力對AMPK活性的影響如圖3所示。與對照組相比，壓力對AMPK活性的影響顯著（p＜0.05）。

圖3 壓力對AMPK活性的影響

由圖3的結果可知，在壓力低于或等于200 MPa時，隨著壓力的升高，AMPK活性降低，但幅度較小，這說明，在此壓力區(qū)間，壓力對AMPK活性有一定的抑制作用。當壓力在200～400 MPa時，隨著壓力的升高，AMPK活性也顯著升高，且在400 MPa時達到最大值，這說明，較高的壓力改變了AMPK的結構，使AMPK被激活。

從圖2和圖1的對比可知，在壓力低于或等于200 MPa時，AMPK活性被抑制，降低了糖酵解的速度，進而降低了乳酸的生成；當壓力在200～400 MPa時，壓力越高，AMPK活性越大，糖酵解的速度越快，乳酸的積累越多。

2.3 超高壓對LDH活性的影響

LDH是一種參與新陳代謝的十分重要的蛋白酶，廣泛存在于植物、動物、原核生物中。它可以催化底物丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化。反應發(fā)生依賴于：NADH將H轉(zhuǎn)移給丙酮酸羰基的C原子，同時活性部位一個特定的已經(jīng)質(zhì)子化的組氨酸（histidine），將質(zhì)子轉(zhuǎn)給丙酮酸羰基的O原子，丙酮酸在它的羰基方向上同時加上了兩個氫，變成了乳酸[21-22]。

壓力對LDH活性的影響見圖4。試驗期間超高壓處理后LDH活性與對照組有顯著性差異（p＜0.05）。在0～200 MPa壓力范圍，LDH活性隨壓力升高而有小幅度的降低，在200 MPa時，LDH活性為對照組的0.87倍。在200～300 MPa壓力范圍內(nèi)，LDH活性隨壓力升高而升高，并在300 MPa時，活性達到最大，為對照組的1.97倍。在300～400 MPa壓力范圍內(nèi)，LDH活性隨壓力升高而降低，在400 MPa時，LDH活性為對照組的1.58倍。

圖4 壓力對LDH活性的影響

基于這些結果得出以下結論：200～400 MPa的壓力處理能夠顯著提高LDH的活性，進而使得糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸在LDH的作用下大量生產(chǎn)乳酸，使得乳酸得到積累。

3 結論

較未處理的新鮮豬肉，0～200 MPa壓力的處理，使得肉中的乳酸含量降低；300～400 MPa壓力的處理，豬肉中的乳酸含量明顯高于新鮮肉和成熟肉，并在400 MPa處理后，肉中的乳酸含量達到最高。

通過對乳酸產(chǎn)生機制中關鍵酶活的檢測，得到如下原因：

在壓力低于或等于200 MPa時，AMPK活性被抑制，降低了糖酵解的速度，同時LDH活性也有小幅度的降低，降低了乳酸的生成；當壓力在200～400 MPa時，壓力越高，AMPK活性越大，糖酵解的速度越快，在此壓力范圍內(nèi)，LDH酶活處于激活狀態(tài)，促進了乳酸的積累。