發(fā)芽黑小麥富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)組分優(yōu)化

陳雅芝，羅鑫，姚芙蓉，劉瑞*，孫元琳，何永吉

1.運城學院生命科學系/特色農(nóng)產(chǎn)品加工山西省重點實驗室（運城 044000）；2.山西農(nóng)業(yè)大學山西功能食品研究院（太原 030031）

黑小麥，別名益壽麥，屬于重要的黑色谷物資源[1]，含有大量人體所需的營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，又稱其為富硒麥、補鈣麥、蛋白麥等[2]。試驗使用的“運黑161”粒色呈紫黑，其面筋指數(shù)、濕面筋含量、必需氨基酸總量均較高，蛋白質(zhì)品質(zhì)良好[3-4]。

γ-氨基丁酸（GABA）具有促進記憶、降壓、改善腦活力、緩解焦慮和頭痛等功能[5]。GABA在高等植物中的合成主要來自GABA支路和多胺降解途徑，起主導(dǎo)作用的酶分別為谷氨酸脫羧酶和二胺氧化酶[6]。但在植物中GABA的含量很低，為0.3～32.50 μmol/g[7]。研究表明，干旱脅迫、機械損傷、浸漬處理、真空協(xié)同發(fā)芽、低氧聯(lián)合酸脅迫等均對植物中GABA富集有一定影響[8-12]。L-谷氨酸是谷氨酸脫羧酶的唯一底物，可以激發(fā)谷氨酸脫羧酶的活性，從而使GABA得到富集[13]。谷氨酸脫羧酶能以磷酸吡哆醛為輔酶專一性催化L-谷氨酸脫羧合成GABA，是生物催化法制備GABA的唯一酶[14]。若能外源加入磷酸吡哆醛，以此提高谷氨酸脫羧酶的活力，可能會使黑小麥中GABA含量有所提升。谷氨酸脫羧酶是一種Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴型酶，有鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)，Ca2+濃度與谷氨酸脫羧酶活性有關(guān)[15-17]；NaCl與植物體內(nèi)抗逆機制有關(guān)，在鹽逆境條件下會促進GABA產(chǎn)生。若以氯化鈣、氯化鈉分別作為培養(yǎng)液，使黑小麥處于鹽脅迫的環(huán)境中，可能會使黑小麥中GABA的含量提高，以此實現(xiàn)GABA富集。

電解水是指電解質(zhì)溶液在直流電場中電解而獲得的酸性電解水和堿性電解水的總稱[18]。研究表明，酸性電解水能有效殺滅多種食源性微生物[19-20]，而且可以促進谷物發(fā)芽過程中某些生物活性物質(zhì)的積累，使其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[21-24]。用微酸性電解水處理黑小麥，可能會在殺菌消毒、GABA含量富集方面發(fā)揮積極作用。

試驗以“運黑161”為材料，并采用微酸性電解水浸泡處理，將谷氨酸鈉、磷酸吡哆醛、氯化鈣、氯化鈉4種培養(yǎng)組分列為考察因素。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)芽黑小麥中GABA的培養(yǎng)液組分，以期為黑小麥芽功能性產(chǎn)品開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

運黑161[由山西農(nóng)業(yè)大學（山西省農(nóng)業(yè)科學院）棉花研究所麥類作物研究室提供]；GABA標準品（美國Sigma公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16G臺式高速離心機（天津廣豐科技有限公司）；UN-9000S雙光束紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；BS-1E恒溫培養(yǎng)箱（金壇市岸頭良友儀器廠）；Scient2-ND真空冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑小麥芽的制備

挑選籽粒飽滿、無蟲蛀、無霉爛的“運黑161”，分別稱取25.0±0.01 g該黑小麥種子于100 mL燒杯中。用自制微酸性電解水（pH 5.55、有效氯濃度22.4 mg/L）對種子浸泡消毒1 h。用相應(yīng)培養(yǎng)液以料液比1∶2對種子浸泡8 h，將浸泡后的種子均勻平鋪在底部有孔的發(fā)芽盒中，于恒溫培養(yǎng)箱（溫度20 ℃）進行避光培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每天用相應(yīng)培養(yǎng)液淋澆3次，對照組用等量去離子水淋澆。培養(yǎng)5 d后進行采收。

1.3.2 培養(yǎng)液成分對黑小麥芽GABA含量的影響

1.3.2.1 單因素試驗

培養(yǎng)液的制備：配制質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mg/mL谷氨酸鈉溶液；配制濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mmol/L氯化鈣溶液；配制濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mmol/L磷酸吡哆醛溶液；配制濃度分別為5，50，100，150，200和250 mmol/L氯化鈉溶液。按照1.3.1所述方法制備黑小麥芽。將采收后的黑小麥芽速凍后于真空冷凍干燥機中進行凍干，磨成粉狀后于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計，對黑小麥芽富集GABA的培養(yǎng)液組分進行優(yōu)化，因素與水平的設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.3.3 GABA含量測定

1.3.3.1 標準曲線建立

參考文獻[25]，并稍作修改。配制不同濃度的GABA標準溶液。各取1 mL，分別加入0.60 mL 0.20 mol/L硼酸鹽緩沖液，搖勻后加入2 mL 5%苯酚溶液，搖勻，加入1 mL 7%次氯酸鈉溶液混勻，用沸水加熱5 min，直到溶液變?yōu)樗{綠色，將其放入碎冰中冷卻至室溫。用雙光束紫外分光光度計在645 nm處測定吸光度并繪制標準曲線。

1.3.3.2 樣品GABA含量的測定

準確稱取0.50 g黑小麥芽粉樣品，加5 mL蒸餾水，在往復(fù)振蕩器振蕩提取4 h，上層清液于10 000 r/min離心3 min。用移液槍取1 mL上層清液于10 mL容量瓶中，按測定標準品的方法在雙光束紫外分光光度計波長645 nm處測定樣品中GABA含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

各試驗均重復(fù)3次，試驗結(jié)果以“平均值±標準偏差”表示。采用Design Expert軟件進行響應(yīng)面分析及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 谷氨酸鈉濃度對發(fā)芽黑小麥GABA含量的影響

從圖1可以得出，谷氨酸鈉質(zhì)量濃度在0.5～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著谷氨酸鈉質(zhì)量濃度升高，黑小麥GABA含量呈先升后降趨勢。谷氨酸鈉質(zhì)量濃度2.5 mg/mL時，GABA含量達到最大值，為1.65 mg/g，可能在此時底物與酶達到最適比例，表明發(fā)芽黑小麥富集GABA時，最佳谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL。

圖1 谷氨酸鈉濃度對發(fā)芽黑小麥GABA含量的影響

2.1.2 氯化鈣濃度對發(fā)芽黑小麥GABA含量的影響

由圖2得出，氯化鈣濃度在0.5～3.0 mmol/L范圍內(nèi)，黑小麥芽GABA含量呈起伏變化趨勢。當氯化鈣濃度為2.0 mmol/L時，黑小麥芽GABA富集量達到最大值，為1.63 mg/g，可能是Ca2+的脅迫作用，使得谷氨酸脫羧酶活性增大，GABA含量升高。故氯化鈣濃度2.0 mmol/L，發(fā)芽黑小麥中GABA含量較高。

圖2 氯化鈣濃度對發(fā)芽黑小麥GABA含量的影響

2.1.3 磷酸吡哆醛濃度對發(fā)芽黑小麥GABA含量的影響

從圖3可以得出，GABA富集量隨磷酸吡哆醛濃度增加呈先升后降趨勢。磷酸吡哆醛濃度2.0 mmol/L時，黑小麥GABA含量達最大值，為1.16 mg/g，可能是磷酸吡哆醛濃度的提升顯著促進谷氨酸脫羧酶的活性，從而提高黑小麥中GABA含量。結(jié)果表明發(fā)芽黑小麥富集GABA時，最佳磷酸吡哆醛濃度為2.0 mmol/L。

圖3 磷酸吡哆醛濃度對發(fā)芽黑小麥GABA含量的影響

2.1.4 氯化鈉濃度對發(fā)芽黑小麥GABA含量的影響

從圖4可以得出，氯化鈉濃度5～250 mmol/L范圍內(nèi)，黑小麥GABA富集量隨氯化鈉濃度的變化呈先升后降趨勢。可能是氯化鈉在一定濃度范圍內(nèi)造成黑小麥處于鹽脅迫的逆境，從而促進GABA生成。氯化鈉濃度50 mmol/L時，GABA含量達到最大值，為1.22 mg/g。說明發(fā)芽黑小麥富集GABA時，最佳氯化鈉濃度為50 mmol/L。

圖4 氯化鈉濃度對發(fā)芽黑小麥GABA含量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。根據(jù)ANOVA分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)，得到以GABA含量為考察指標的回歸模型：Y=1.36-0.064X1+0.013X2+0.13X3+0.085X4+0.15X1X2-0.023X1X3+0.005 75X1X4-0.2X2X3-0.29X2X4+ 0.019X3X4-0.26X12-0.22X22-0.1X32-0.14X42。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 方差分析

從表3可以得出，回歸模型的F值為279.07，p＜0.000 1，說明回歸模型極顯著；失擬項的p為0.114 2，p＞0.05時，說明方程擬合較好。谷氨酸鈉質(zhì)量濃度（X1）、磷酸吡哆醛濃度（X3）、氯化鈉濃度（X4）的p＜0.000 1，表明這3個因素對黑小麥芽GABA富集影響極顯著；氯化鈣濃度（X2）的p值為0.036 5，p＜0.05，表明氯化鈉濃度對發(fā)芽黑小麥GABA富集影響顯著。各因素的影響順序為磷酸吡哆醛濃度＞氯化鈉濃度＞谷氨酸鈉質(zhì)量濃度＞氯化鈣濃度。在該模型其他項中，X1X2、X1X3、X2X3、X2X4的交互作用及對黑小麥芽富集GABA的影響均有顯著性。綜合所有統(tǒng)計分析特征值，說明模型具有實踐指導(dǎo)意義。

表3 顯著性檢驗和方差分析

2.2.3 響應(yīng)面模型交互作用分析

培養(yǎng)液成分對發(fā)芽黑小麥GABA含量影響的等高線及響應(yīng)面如圖5所示。等高線的形狀反映兩因素交互效應(yīng)的大小，橢圓形則反映兩因素交互作用的顯著。從圖5（a、b、d、e）可以看出，等高線呈橢圓形，表明兩因素交互作用顯著。從圖5（c、f）可以看出，等高線較圓，表明兩因素交互作用不顯著，與顯著性分析結(jié)論一致。

圖5 培養(yǎng)液成分對發(fā)芽黑小麥GABA含量影響的等高線及響應(yīng)面圖

2.2.4 最優(yōu)條件驗證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗條件分析，確定最佳培養(yǎng)液濃度：谷氨酸鈉質(zhì)量濃度2.28 mg/mL、氯化鈣濃度1.5 mmol/L、磷酸吡哆醛濃度2.5 mmol/L、氯化鈉濃度100 mmol/L。此時發(fā)芽黑小麥GABA含量1.66 mg/g。在最佳工藝條件下進行驗證試驗，重復(fù)3次，得到試驗結(jié)果為1.68 mg/g，略高于軟件預(yù)測值。由此證明響應(yīng)面預(yù)測模型建立合理，試驗結(jié)果較理想。

3 結(jié)論

試驗以“運黑161”為原料，經(jīng)微酸性電解水浸泡處理，將谷氨酸鈉、磷酸吡哆醛、氯化鈣、氯化鈉溶液作為發(fā)芽黑小麥富集GABA的培養(yǎng)液。通過增大底物濃度，激發(fā)谷氨酸脫羧酶活力，使黑小麥發(fā)芽處于鹽脅迫環(huán)境等方法提高黑小麥芽GABA含量。

通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)芽黑小麥富集GABA的培養(yǎng)組分，當谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為2.28 mg/mL、氯化鈣濃度為1.5 mmol/L、磷酸吡哆醛濃度為2.5 mmol/L、氯化鈉濃度為100 mmol/L時，黑小麥芽的GABA含量達到1.68 mg/g。試驗結(jié)果為黑小麥芽功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論支持。