蘆筍液體發(fā)酵靈芝工藝及其對多糖質(zhì)量濃度的影響

董玉瑋，沙爽，張浩赟，周立輝，陳學(xué)紅，曹修春

1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院（徐州 221018）；2.徐州山崎農(nóng)產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)有限公司（徐州 221700）

蘆筍（學(xué)名：Asparagus officinalisL.）為石刁柏的幼苗，為百合科天門冬屬。蘆筍含有豐富的氨基酸、膳食纖維和礦物質(zhì)元素，皂苷、多糖、黃酮類[1]等活性物質(zhì)；具有抗癌[2-3]、抗衰老[4]、抗紫外線[5]、預(yù)防心腦血管疾病[6]。靈芝為多孔菌科真菌，其有效成分是三萜類、多糖，具有很強的抗氧化性和清除自由基能力[7]，被古今中外醫(yī)藥學(xué)家視為滋補養(yǎng)生、強身壯體的珍品[8-9]。

蘆筍的市場需求量及交易量逐年增加，高品質(zhì)蘆筍主要用于出口，而低品質(zhì)的蘆筍利用率較低，其主要原因是纖維素和木質(zhì)素在低品質(zhì)和長期貯藏的蘆筍中含量高，口感差。將這部分蘆筍進一步開發(fā)利用將有利于提升其利用價值。靈芝等藥食真菌菌絲體能利用纖維素、木質(zhì)素為碳源，產(chǎn)生多糖、三萜類等活性物質(zhì)。因此如果以低品質(zhì)蘆筍為原料，采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，制備發(fā)酵型藥食真菌，將具有生產(chǎn)成本小、產(chǎn)量較大、操作方便快捷、生產(chǎn)效率顯著提高等優(yōu)勢[10]。相比于傳統(tǒng)的化學(xué)試劑，液體發(fā)酵更符合綠色環(huán)保的理念，在產(chǎn)品質(zhì)量和操作可控制性方面有明顯優(yōu)勢[11]。李弈等[12]研究發(fā)現(xiàn)，液體發(fā)酵生產(chǎn)藥用真菌代用品可有效解決天然藥用真菌資源逐漸枯竭和生態(tài)環(huán)境保護的難題，是一種天然健康的發(fā)酵工藝。

以低品質(zhì)蘆筍為培養(yǎng)基，液體發(fā)酵靈芝，根據(jù)多糖質(zhì)量濃度優(yōu)化其發(fā)酵工藝，并對發(fā)酵液中的理化成分進行的測定，為蘆筍、藥食真菌精深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑和儀器

1.1.1 試驗材料和試劑

靈芝菌種（實驗室保存高活性靈芝菌種）；蘆筍（品質(zhì)低于出口標(biāo)準(zhǔn)，徐州山崎農(nóng)產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)有限公司）；乙醇、濃硫酸、苯酚、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等（均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 試驗儀器和設(shè)備

DHP-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司）；HH-2電熱恒溫水浴鍋（邦西儀器科技（上海）有限公司）；XFH-50CA手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫(yī)療器材有限公司）；HYG-II回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜（上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司）；TDL-5A低速大容量離心機（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；JA1003N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；1260液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；ICP-MS電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）。

1.2 培養(yǎng)基的配制

1.2.1 PDA培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：200 g土豆，洗凈去皮切碎，加1 000 mL水，煮25 min，濾渣取液體，向其中加磷酸二氫鉀3 g，瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，酵母膏3 g，硫酸鎂1.5 g和微量VB1，加熱攪拌，溶解后，加水補充到1 000 mL，裝于三角瓶內(nèi)，高壓滅菌40 min，取出備用。

1.2.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基

蘆筍液體培養(yǎng)基：蘆筍粉碎后，按0.25%～1.25%裝入三角瓶，加入1%酵母膏，2%可溶性淀粉，100 mL水配成液體發(fā)酵培養(yǎng)基。高壓滅菌后，取出冷卻至室溫。

1.3 靈芝菌種的活化和培養(yǎng)

將靈芝菌種在無菌操作臺內(nèi)接入PDA斜面培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～6 d。挑選長勢好的菌種，接種在液體培養(yǎng)基中，于28 ℃搖床培養(yǎng)6～8 d。

1.4 單因素試驗

以蘆筍添加量、溫度、裝液量3個因素為考察對象，每組試驗重復(fù)3次。

1.4.1 蘆筍添加量

分別向三角瓶中加入0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 g粉碎后的蘆筍，加入100 mL液體培養(yǎng)基，高壓滅菌后接種，于28 ℃搖床培養(yǎng)5～7 d。

1.4.2 溫度

分別向裝有100 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入0.75 g粉碎后的蘆筍，高壓滅菌后接種，分別放入溫度為24，26，28，30和32 ℃的搖床，培養(yǎng)5～7 d。

1.4.3 裝液量

依次向三角瓶中加入0.75 g粉碎后的蘆筍，分別加入60，80，100，120和140 mL的液體培養(yǎng)基，高壓滅菌后接種，于28 ℃搖床培養(yǎng)5～7 d。

1.5 正交試驗設(shè)計

選取溫度、蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)、裝液量3個因素，每個因素選取3個水平。試驗因素與水平如表1所示。

表1 試驗的因素與水平

1.6 多糖的提取及測定

1.6.1 粗多糖的提取方法

將培養(yǎng)后的發(fā)酵液以4 000 r/min離心10 min，取上清置于50 ℃烘箱中烘至原體積1/5，加入5倍體積95%乙醇，在4 ℃冰箱中過夜醇沉后，以4 000 r/min離心5 min，取沉淀于50 ℃烘箱烘干，得粗多糖。

1.6.2 多糖質(zhì)量濃度的測定——苯酚硫酸法

將1 g粗多糖加入100 mL蒸餾水充分溶解，取2 mL多糖溶液，加1 mL 6%苯酚、5 mL濃硫酸，混勻，100℃水浴15 min，冷卻至室溫，在490 nm處測定樣品吸光度，對照組為蒸餾水。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖質(zhì)量濃度。

1.6.3 粗多糖的純化

Sevag法脫蛋白：將1 g粗多糖加入10 mL純水溶解，加入2.5 mL Sevag試劑（V（氯仿）∶V（正丁醇）=5∶1），將混合溶液裝入分液漏斗中振蕩18～20 min，取上層溶液以4 000 r/min離心15 min，棄下層液體，上清液重復(fù)上述操作，至無蛋白質(zhì)層，合并上清液備用。

取截流相對分子質(zhì)量6 000～8 000的半透膜袋，沸水水浴5 min，用純水將其沖開，封住一端，將得到的上清液倒入后封住開口的另一端，置于裝有純水的燒杯中，用磁力攪拌器進行透析，每2 h換1次水，2 d后得到樣品烘干即為精制多糖。

1.6.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取50 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶解，制成1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取5 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍，取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)液分別裝于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，另取一支試管加2 mL蒸餾水，分別加入6%苯酚和5 mL濃硫酸，搖勻靜置5 min后，于100 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，在490 nm處測吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=9.092 9X+0.013 6，R2=0.994 8。

1.7 氨基酸組分檢測

HPLC檢測氨基酸參考鄧代信等[13]的方法。

1.8 高效液相色譜檢測

多糖中加入0.5 mL 2 mol/L三氯乙酸溶液，于120℃ 水解100 min，用氮吹儀吹干，得樣品。

取5 μL單糖標(biāo)準(zhǔn)品加入試管中，加入0.5 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，與上述多糖樣品一同放置在120 ℃水浴下水解100 min，空氣泵吹干。

處理好的單糖樣品加入0.5 mL 0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）試劑，0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液。充分混勻后，于70 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入0.5 mL氯仿和0.5 mL 0.3 mol/L HCl，充分振蕩萃取，以5 000 r/min離心5 min，除去氯仿層后重復(fù)2次萃取。用0.22 μm濾膜過濾水層，待測定。

儀器條件：波長245 nm，流動相為0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量10 μL。

1.9 礦物質(zhì)元素檢測

Mg、Fe、Se、Ca、Zn等元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用電感耦合等離子體-質(zhì)譜（ICP-MS）法測定[14]。取適量樣品放入聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL硝酸。靜置，反應(yīng)結(jié)束后，蓋蓋密封，放入微波消解儀，溫度冷卻到50 ℃以下，取出消解罐放入通風(fēng)櫥中，打開消解罐，用超純水潤洗，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，潤洗3～4次，用超純水稀釋、定容至刻度，待測?？瞻讓φ胀ㄌ幚?。ICP-MS儀器參數(shù)：射頻功率1 550 W，泵速40 r/min，霧化室溫度2.7 ℃，采樣深度5 mm，冷卻氣流速14 L/min，輔助氣流速0.8 L/min，霧化氣流速1.122 L/min。

1.10 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，所有數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多糖質(zhì)量濃度的影響

如圖1所示，蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%～1.25%時，隨著蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，多糖質(zhì)量濃度先增加后減少，蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%時，多糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值2.33 mg/mL。辛燕花等[15]研究何首烏發(fā)酵靈芝工藝時也有類似結(jié)果，發(fā)現(xiàn)何首烏含量0.7%～0.8%時，多糖質(zhì)量濃度最高。

圖1 蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)對發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響

2.1.2 裝液量對多糖質(zhì)量濃度的影響

如圖2所示，錐形瓶裝液量60～100 mL時，多糖質(zhì)量濃度隨著裝液量增加，先增加后減少，裝液量100 mL時，多糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值2.24 mg/mL。田淑雨等[16]通過單因素試驗研究靈芝多糖提取得率時，發(fā)現(xiàn)裝液量90～100 mL時，所獲得的多糖量最高，與試驗結(jié)果基本一致。

圖2 裝液量對發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響

2.1.3 溫度對多糖質(zhì)量濃度的影響

如圖3所示，溫度范圍24～28 ℃時，隨著溫度增大，多糖質(zhì)量濃度先增加后減少，溫度28 ℃時，多糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值2.51 mg/mL。馮嫣等[17]研究靈芝孢子粉提取多糖工藝時，發(fā)現(xiàn)溫度28 ℃時，所得到的多糖質(zhì)量濃度為2.6 mg/mL，與試驗結(jié)果基本一致。

圖3 溫度對發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響

2.2 正交試驗

正交試驗設(shè)計方案，通過具體試驗得到多糖質(zhì)量濃度，如表2所示。

表2 設(shè)計方案和結(jié)果

從表2結(jié)果可以看出，極差項R大小為A＞C＞B，即溫度的影響因素最大，其次是裝液量，最后是蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)。綜合3種因素對液體發(fā)酵靈芝多糖影響可知，發(fā)酵工藝最優(yōu)組合為A2B2C2，即液體發(fā)酵溫度28 ℃、蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%、裝液量100 mL時所得發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度最高。以A2B2C2為優(yōu)化條件設(shè)計正交試驗驗證試驗，最終得到多糖質(zhì)量濃度為2.73 mg/mL。

2.3 多糖中單糖組分檢測

每種單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：葡萄糖y=62.22x+270.7，R2=0.999 09；甘露糖y=82.26x+86.27，R2=0.999 94；阿拉伯糖y=71.82x+277.47，R2=0.999 26；半乳糖y=78.79x+207.08，R2=0.999 71；木糖y=57.01x+302.88，R2=0.998 53；半乳糖醛酸y=87.49x-60.39，R2=0.999 96；葡萄糖醛酸y=86.51x-61.36，R2=0.999 98。蘆筍-靈芝多糖中所含單糖組分色譜圖見圖4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖5。

圖4 多糖中單糖組分的高效液相色譜圖

圖5 多糖中單糖組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

從檢測結(jié)果中可以看出，多糖由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6種單糖組成，其中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為282 591.33 mg/kg。隋曉辰等[18]通過對深層發(fā)酵靈芝胞內(nèi)多糖結(jié)構(gòu)分析得出，胞內(nèi)多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖等5種成分組成，其種葡萄糖、半乳糖、甘露糖摩爾比83.75∶4.76∶4.15，其中葡萄糖量最大；黃靜涵等[19]分離純化靈芝多糖，得出靈芝單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木聚糖，物質(zhì)的量比率為4∶2∶10∶1，葡萄糖物質(zhì)的量最高，均與試驗結(jié)果基本一致。

蘆筍-靈芝發(fā)酵液經(jīng)高效液相色譜測定含有多種氨基酸，見圖6。

圖6 氨基酸組分的高效液相色譜圖

氨基酸與礦物質(zhì)元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖7。從圖7可以看出，發(fā)酵液中含有賴氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等多種氨基酸，其中脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為3.9 g/kg。鐵、鋅、鎂、硒、鈣等礦物質(zhì)元素中鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)68.6 g/kg，硒為0.03 mg/kg。隋月紅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，嫁接紅棗中鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)0.76 g/kg，硒為0.005 9 mg/kg，均低于發(fā)酵液中鈣和硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖7 蘆筍-靈芝液體發(fā)酵液中理化指標(biāo)測定結(jié)果

發(fā)酵液還中含有7種人類必需的氨基酸，營養(yǎng)價值較高。脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，能夠幫助分解蛋白質(zhì)，是理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。亮氨酸、異亮氨酸等部分苦味氨基酸，有利于蛋白質(zhì)向氨基酸轉(zhuǎn)化、形成和積累。呈鮮味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸占比19%，9種藥效氨基酸占比52%，必需氨基酸與氨基酸總量比值29%，必需氨基酸與非必需氨基酸比值40%。說明制備的蘆筍-靈芝口感鮮美，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，具有很高的藥效價值。黃清鏵等[21]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝發(fā)酵甘蔗汁中呈鮮味氨基酸占比32%，必需氨基酸與氨基酸總量比值34%，必需氨基酸與非必需氨基酸比值51%，與發(fā)酵液研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

1) 單因素試驗表明，培養(yǎng)基中蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%～1.00%、裝液量80～120 mL、培養(yǎng)溫度26～30 ℃時，能獲得較高多糖質(zhì)量濃度。

2) 正交試驗優(yōu)化得出最佳方案：蘆筍質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總裝液量的0.75%，裝液量100 mL，溫度28 ℃，此時得到的多糖質(zhì)量濃度最高，為2.64 mg/mL。

3) 發(fā)酵液多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖等單糖組成，其中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為282.59 g/kg；氨基酸中脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)3.9 g/kg，礦物質(zhì)元素鈣、硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)68.6 g/kg和0.005 9 mg/kg。