甘薯膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶同源建模及分子對(duì)接分析

李豐茂，楊 浩，2，傅玉凡，陳曉玲，唐云明

1.西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/重慶市甘薯工程研究中心，重慶 400715；2.重慶市潼南中學(xué)校，重慶 潼南 402660；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO，EC 1.10.3.1)是一類(lèi)由核基因編碼含銅質(zhì)體能催化酚類(lèi)物質(zhì)氧化的金屬酶．最早由Yoshida在研究漆樹(shù)液汁凝固現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種活性物質(zhì)，隨后Keilin和Mann 報(bào)道了多酚氧化酶的分離純化方法，公布了多酚氧化酶的理化性質(zhì)及酶學(xué)特征[1]，開(kāi)啟了對(duì)多酚氧化酶的系統(tǒng)性研究．國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合命名委員會(huì)根據(jù)酶的催化特性將PPO 分為兩大類(lèi)：1) 單酚酶(EC 1.14.18.1)；2) 二酚酶(EC 1.10.3)，包括兒茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)和漆酶(EC 1.10.3.2)[2]．目前在植物體中多酚氧化酶主要以可溶性多酚氧化酶(soluble polyphenol oxidase，sPPO)和膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶(membrane-bound polyphenol oxidase，mPPO)兩種形式存在，其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中[3]．多酚氧化酶參與植物光合作用[4]、逆境脅迫[5]、抗病蟲(chóng)害[6]、花色形成[7]、生物組織修復(fù)[8]，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起到了積極的作用．目前，該酶在茶葉發(fā)酵[9]、造紙工業(yè)[10]、污水處理[11]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用．

甘薯(Ipomoeabatatas(L.) Lam)又名紅薯，是我國(guó)主要糧食經(jīng)濟(jì)作物之一，產(chǎn)量居全球之首，而西南地區(qū)甘薯種植面積居全國(guó)第一．據(jù)研究報(bào)道，甘薯潛在的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值非常高，甘薯富含淀粉[12]、蛋白質(zhì)、膳食纖維[13]、維生素[14]、酚類(lèi)[15]、黃酮[16]、胡蘿卜素[17]，具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗心血管疾病和抗腫瘤等藥理作用[18-20]；而在工業(yè)能源方面，甘薯淀粉作為原料發(fā)酵和生產(chǎn)燃料酒精和酒精汽油[21]，以緩解目前的能源危機(jī)．近年來(lái)，鮮切甘薯因營(yíng)養(yǎng)豐富、便捷以及高利用率等特點(diǎn)迅速得到廣大消費(fèi)者的青睞[22]．但是鮮切甘薯在生產(chǎn)過(guò)程中容易受到機(jī)械力的傷害，多酚氧化酶與酚類(lèi)化合物原本的細(xì)胞區(qū)域被破壞，在氧氣作用下甘薯表面生成棕色或黑色聚合物導(dǎo)致甘薯表面出現(xiàn)褐變，褐變不僅會(huì)影響甘薯外觀，降低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還能導(dǎo)致甘薯變質(zhì)腐爛和浪費(fèi)，從而制約著甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展．目前有研究顯示PPO是導(dǎo)致果蔬褐變的主要物質(zhì)[22-23]，而mPPO是甘薯中主要的多酚氧化酶，當(dāng)甘薯組織受到損傷后，其編碼基因被誘導(dǎo)表達(dá)，mPPO活性逐漸增加，加速果蔬褐變腐爛，然而有關(guān)mPPO導(dǎo)致褐變的分子機(jī)制尚不明確，因此本研究主要利用同源建模和分子對(duì)接手段快速得到mPPO三維結(jié)構(gòu)以及與底物結(jié)合的潛在位點(diǎn)，為篩選和設(shè)計(jì)抑制劑以及深入理解褐變機(jī)理提供了新的理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材 料

生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，如Uniprot(Universal Protein：https：//www.uniprot.org/)，PDB(Protein Date Bank：https：//www.rcsb.org/)；在線(xiàn)軟件，如SWISS-MODELL，PISPRED，PROCHECK，ERRAT，SYBYL-X 2.0；本課題研究的甘薯膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶氨基酸序列來(lái)自Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)：Q9MB14)．

1.2 方 法

1.2.1 同源建模

先從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中下載甘薯膜結(jié)合態(tài)多酚氧化酶氨基酸序列，然后在蛋白質(zhì)自動(dòng)同源建模軟件SWISS-MODELL中輸入相應(yīng)序列構(gòu)建甘薯mPPO三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)建模反饋信息，獲得了4個(gè)模板和1個(gè)目標(biāo)模型(即mPPO三維結(jié)構(gòu))，并將mPPO的三維結(jié)構(gòu)保存為PDB格式以用于后續(xù)分子對(duì)接分析．

1.2.2 模型評(píng)估

利用在線(xiàn)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)評(píng)估軟件PROCHECK和ERRAT對(duì)所獲得的甘薯mPPO模型進(jìn)行評(píng)估以及對(duì)氨基酸殘基(aa)整體性進(jìn)行分析．

1.2.3 分子對(duì)接分析

從TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)數(shù)據(jù)庫(kù)中(https：//tcmspw.com/molecule.php?qn=415)下載底物鄰苯二酚、綠原酸、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、表兒茶素等酚類(lèi)化合物3D結(jié)構(gòu)，并保存為mol2格式，然后利用分子對(duì)接軟件SYBYL-X 2.0以銅質(zhì)體區(qū)域?yàn)閷?duì)接位點(diǎn)，采用半柔性對(duì)接方式進(jìn)行分子對(duì)接分析，探究mPPO與酚類(lèi)化合物的潛在結(jié)合位點(diǎn)以及相互作用方式[24]．

2 結(jié)果與分析

2.1 模型及其結(jié)構(gòu)分析

同源建模是利用具有同源性的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)作為模板，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)．由于蛋白中的三維結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)更加保守，氨基酸的突變和替換通常發(fā)生在蛋白質(zhì)表面回折區(qū)域，蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)、疏水核心結(jié)構(gòu)受序列變異影響很小．因此用同源建模預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)是比較可靠、快速的方法．任何一對(duì)蛋白質(zhì)，只要序列長(zhǎng)度達(dá)到一定程度，序列相似性超過(guò)30%，則具有相似的三維結(jié)構(gòu)[25]．由于甘薯mPPO研究仍處于轉(zhuǎn)錄水平，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中也無(wú)相應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息．利用SWISS-MODELL對(duì)甘薯mPPO同源建模，一共獲得了4個(gè)多酚氧化酶三維結(jié)構(gòu)模板，其在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)分別為6ELS(Latent apple tyrosinase)，4Z11(Latent aurone polyphenol oxidase)，6R83(squid hemocyanin)，4D87(Bacillus megaterium tyrosinase)，氨基酸序列相似性分別為54.49%，44.02%，21.23%，23.57%．由于序列相似性越高，獲得的三維結(jié)構(gòu)越可靠，因此選取了序列相似性最高的6ELS作為模板建模(圖1)，使獲得的模型最佳，其甘薯mPPO模型如圖2．

圖1 甘薯mPPO與模板6ELS序列比對(duì)

圖2 模板6ELS和甘薯mPPO三維結(jié)構(gòu)

通過(guò)甘薯mPPO與模板6ELS序列比對(duì)以及利用PISPRED對(duì)mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)含有18個(gè)α-螺旋、9個(gè)β-轉(zhuǎn)角、18個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲(圖3)，其1～50 aa和51～88 aa為2段跨膜信號(hào)序列，說(shuō)明葉綠體內(nèi)的mPPO會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)移肽轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用．結(jié)合圖2可以看出甘薯mPPO活性區(qū)域含有3個(gè)CuA和3個(gè)CuB，并被His178，His199，His208，His330，His334，His366包圍．Cys99→Cys116，Cys115→Cys179，Cys182→Cys199組成了mPPO鏈間二硫鍵穩(wěn)定著酶的結(jié)構(gòu)．

圖3 甘薯mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2 模型評(píng)估

將SWISS-MODEL建模后序列相似性最高的mPPO模型通過(guò)PROHECK和ERRAT進(jìn)行評(píng)估，圖4(a)顯示了mPPO拉式構(gòu)象圖中有92%殘基位于允許區(qū)[A，B，L]，7.2%殘基位于最大允許區(qū)域[a，b，l，p]，0.5%殘基位于扭轉(zhuǎn)角禁止區(qū)域[～a，～b，～l，～p]，一般認(rèn)為允許區(qū)域超過(guò)90%，模型中蛋白質(zhì)殘基的二面角都在合理的區(qū)間，則符合立體化學(xué)能量規(guī)則，表明其模型的可靠性較高[26]．圖4(b)，圖4(c)顯示mPPO的 QMEAN為0.67(QMEAN值在 0～1 之間，數(shù)值越大，獲得理想模型的可能性越大[27])，且Z值均大于2，反映出模型質(zhì)量可靠．ERRAT對(duì)mPPO整體三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，有95.15%的殘基在95%誤差值以外，綜上所述甘薯mPPO模型合格(圖4d)，可以用于后續(xù)分析計(jì)算．

圖4 mPPO模型評(píng)估

2.3 催化位點(diǎn)分析

分子對(duì)接是在分子水平上通過(guò)化學(xué)計(jì)算研究分子的幾何結(jié)構(gòu)、分子間相互作用的方法，其理論基礎(chǔ)來(lái)源于E.Fisher 提出的“鎖鑰模型”，該模型描述了酶與底物專(zhuān)一性的結(jié)合，但存在一定局限性．Koshland提出了“誘導(dǎo)契合原理”，該理論認(rèn)為受體和配體在相互結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化[28]．利用分子模擬軟件SYBYLX-2.0分別將鄰苯二酚、綠原酸、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、表兒茶素與mPPO進(jìn)行分子對(duì)接，在對(duì)接過(guò)程中蛋白受體和小分子配體的構(gòu)象是可柔性可變化的，以滿(mǎn)足空間形狀和能量匹配．結(jié)果發(fā)現(xiàn)在活性位點(diǎn)附近，Gln197，Leu212，Phe204，His365，Phe362，Phe205，Arg209，Thr331以氫鍵的方式與5種酚類(lèi)化合物結(jié)合(表1)，說(shuō)明這幾個(gè)殘基都是潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖5)．

表1 甘薯mPPO與不同底物結(jié)合位點(diǎn)

圖5 甘薯mPPO與酚類(lèi)化合物分子對(duì)接結(jié)果

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)承擔(dān)者，其具有的功能很大程度上與自身的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此，對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究有助于了解其工作機(jī)理．目前蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)收集的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)量不斷增加，但是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定仍然落后于基因測(cè)序[29]．X-射線(xiàn)晶體衍射和核磁共振技術(shù)是獲取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的重要手段，但蛋白質(zhì)晶體表達(dá)、提純與結(jié)晶增加了測(cè)定的難度．為了加快蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定速度，發(fā)展理論蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)序方法顯得尤為重要．因此，利用蛋白質(zhì)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行生物信息學(xué)分析不僅可以快速了解、認(rèn)識(shí)目標(biāo)蛋白質(zhì)，還可以快速、高效地解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，以研究蛋白質(zhì)與配體的相互作用及其分子機(jī)制．

通過(guò)分析氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，mPPO二級(jí)結(jié)構(gòu)含有18個(gè)α-螺旋、9個(gè)β-轉(zhuǎn)角、18個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，其中1～50 aa，51～88 aa為2段跨膜信號(hào)序列，這與茄子(81 aa)，蘋(píng)果(89 aa)，土豆(86 aa)，番茄(99 aa)mPPO跨膜轉(zhuǎn)移肽不同[30]，植物mPPO N-端轉(zhuǎn)移肽差異可能與不同物種mPPO轉(zhuǎn)運(yùn)方式有關(guān)．銅質(zhì)體區(qū)域是甘薯mPPO活性部位，受His178，His199，His208，His330，His334，His366包圍，而在單亞基甘薯多酚氧化酶中，只存在單個(gè)銅質(zhì)體，并被His240，His244，His274包圍，葡萄PPO中活性區(qū)域受His211，His220，His342，His346，His375包圍[31]，這表明PPO活性區(qū)域差異與所編碼的基因以及所在區(qū)域的執(zhí)行功能有關(guān)．

分子對(duì)接結(jié)果顯示，甘薯mPPO中Gln197，Leu212，Phe204，His365，Phe362，Phe205，Arg209，Thr331等殘基與鄰苯二酚、綠原酸、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、表兒茶素相互作用，表明甘薯mPPO不僅催化區(qū)域廣，而且催化底物種類(lèi)多，而甘薯組織受到機(jī)械傷害時(shí)，能與各種酚類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)，驗(yàn)證了多酚氧化酶是導(dǎo)致果蔬褐變的主要氧化酶．氫鍵驅(qū)動(dòng)mPPO和底物結(jié)合，正是由于他們之間的這種分子相互作用，使得甘薯mPPO與底物結(jié)合的親和力高，促進(jìn)了甘薯mPPO催化效率．因此，可以通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)抑制劑屏蔽掉相關(guān)氨基酸殘基上的官能團(tuán)，削弱與酶的結(jié)合能力，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可以通過(guò)基因敲除或者RNA干擾技術(shù)培育無(wú)褐變甘薯品種，擴(kuò)大甘薯物種豐富度，降低因褐變?cè)斐傻慕?jīng)濟(jì)損失．

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)挖掘甘薯mPPO相關(guān)數(shù)據(jù)掌握了其結(jié)構(gòu)特征以及潛在催化靶點(diǎn)，為進(jìn)一步揭示甘薯褐變分子機(jī)制和篩選高效無(wú)毒害抑制劑提供了新的思路．