膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中的作用及機制研究*

金學廷，邱正紅，劉向國

（1.安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院疼痛科，安徽合肥238000；2.安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，安徽合肥230012）

神經(jīng)病理性疼痛主要是由于軀體的感覺神經(jīng)受到一定的損傷所致，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病時間一般很長，有的患者會持續(xù)數(shù)月或數(shù)年，其特征主要為自發(fā)性的疼痛、痛覺過敏和超敏等[1]。神經(jīng)病理性疼痛對人類的健康產(chǎn)生嚴重的威脅，嚴重患者會失去自主行動的能力，該疾病在全國范圍內(nèi)困擾著數(shù)百萬的患者，因此神經(jīng)病理性疼痛成為神經(jīng)科學者們首要關注的疾病[2]。神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制非常復雜，神經(jīng)元、免疫細胞和膠質(zhì)細胞激活等都參與其發(fā)生和發(fā)展[3]。目前臨床上對于該疾病的治療一般會采用藥物治療，例如阿片類、抗驚厥類和抗抑郁類等，但由于參與的病理和生理機制較多，以上藥物的療效都不理想，成為治療神經(jīng)病病理性疼痛領域中的難題。膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell derived neurotrophic factor,GDNF）是近些年發(fā)現(xiàn)的一種新型的營養(yǎng)因子[4]。早期研究發(fā)現(xiàn)[5]，GDNF 不僅能提高培養(yǎng)的多巴胺神經(jīng)元細胞的存活率，還能為已經(jīng)發(fā)育好和成熟的神經(jīng)元提供相應的營養(yǎng)，使神經(jīng)元細胞更好地分化。有學者發(fā)現(xiàn)[6]，GDNF 和神經(jīng)病理性疼痛有著很大的關系，其對損傷的軸突再生有一定的促進作用，進而恢復損傷。研究顯示[7]，GDNF 不僅能保護神經(jīng)損傷，還為治療神經(jīng)損傷開辟新的治療途徑。PINK1 是一個具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激活性的線粒體外膜蛋白，其在受損傷的線粒體中起到分子感受器的作用。Parkin 是一種具有E3泛素蛋白連接酶的蛋白，并且具有其活性，同時也可以調(diào)節(jié)不同蛋白的降解，從而起到轉(zhuǎn)導信號的作用。PINK1和Parkin基因在很多組織和器官中都有顯著表達，特別是在高耗能的器官中表達最為明顯[8]。帕金森病患者體內(nèi)的呼吸鏈復合物1 功能會受到一定損傷，這讓帕金森病患者體內(nèi)的應激反應不斷加重，從而激活PINK1/Parkin 通路介導的線粒體自噬[9]。此外，PINK1/Parkin 通路的基因發(fā)生改變，線粒體的自噬因此出現(xiàn)異常，從而不同程度地損傷線粒體的聚集，導致神經(jīng)元發(fā)生萎縮甚至完全死亡，這也是導致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變的主要機制之一[10]。但目前關于GDNF 對PINK1 和Parkin 影響的相關性研究較少，所以本文探究GDNF 通過PINK1/Parkin 信號通路對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2018-0012]，共計30 只。體重200～220 g，適應性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。

1.2 試劑和儀器

GDNF（美國Pepro Tech 公司），PINK1 抗體、Parkin 抗體（美國CST 公司），日立HT7800 型透射電鏡（日本日立公司），測痛儀（美國North Coast 公司），貝克曼高速冷凍離心機XPN100（美國Beckman 公司），超低溫冰箱（日本Sanyo 公司）。

1.3 鞘內(nèi)置管

大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）進行麻醉，經(jīng)枕骨大孔進行鞘內(nèi)置管。置管后2 d未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)的大鼠經(jīng)導管注入2%利多卡因20 μl，注射藥物后大鼠出現(xiàn)雙后肢麻痹并于0.5 h 內(nèi)恢復即為置管成功，將置管成功的大鼠分籠單獨飼養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.4 模型復制及鞘內(nèi)給藥

將30 只大鼠按隨機數(shù)字表法分為Sham 組（假手術組）、NP 組（神經(jīng)病理性疼痛模型組）、GDNF組（治療組），每組10 只。采用坐骨神經(jīng)壓榨性損傷（chronic constrictioninjury,CCI）法復制單側(cè)神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型。麻醉大鼠后，切開大鼠皮膚，分離大鼠的肌肉組織，使坐骨神經(jīng)的主干全部暴露在外，并對其進行結(jié)扎，4 個小結(jié)的間隔距離為1 mm。最合適的力度是讓神經(jīng)外膜有輕微的壓迫感，部分血管受到阻斷，大鼠的肢體出現(xiàn)稍微的沖動。當大鼠傷口全部縫合后，所有實驗大鼠全部注射青霉素，以防止感染。Sham 組大鼠除不結(jié)扎外，其他手術步驟同模型組。Sham 組和NP 組大鼠鞘內(nèi)注射10 μl 生理鹽水，隔日1 次；GNDF 組大鼠鞘內(nèi)注射用生理鹽水稀釋為10 μl 的GDNF 2 μg，隔日1 次。3 組大鼠均連續(xù)給藥14 d。

1.5 標本采集

1.5.1 蛋白標本收集麻醉大鼠后，將大鼠的背部皮膚全部剪開，使大鼠的脊柱節(jié)段全部暴露出來，逐層分離脊柱表面和脊柱兩側(cè)的肌肉，將兩側(cè)的肋骨全部剪斷。取CCI 模型大鼠同側(cè)脊髓灰質(zhì)前角，找到大鼠頭端的追關口，用注射器將磷酸鹽緩沖液（PBS）注入椎管內(nèi)，借助液體壓力將脊髓完整吹出。用無菌手術刀片取出脊髓腰膨大部位，即L4～L6節(jié)段脊髓組織，立刻放入液氮中速凍2 h，存儲于-80℃的冰箱中。

1.5.2 透射電鏡標本收集取L4～L6脊髓組織迅速置于2.5%戊二醛和1.0%鋨酸中雙重固定，待作透射電鏡切片。

1.6 大鼠一般情況觀察及行為學測定

手術及給藥后，觀察3 組大鼠的存活、傷口感染、肢體出現(xiàn)癱瘓及導管脫落等情況。

1.6.1 機械縮足反射閾值（MWT）的測定分別于CCI 前，CCI 后第3 天、第7 天、第14 天測定3 組大鼠的MWT 值，并計算大鼠的縮足閾值。在金屬的篩網(wǎng)上放置一個透明的玻璃箱，讓大鼠在玻璃箱中適應新環(huán)境15 min。用纖維絲從大鼠后足的中間位置進行直接刺激，刺激的時間為6 s，大鼠陽性反應為抬足或添足。測定大鼠的力度從2 g 開始，最大力度為26 g，當力度超過26 g 時也計為26 g。對大鼠進行刺激而沒出現(xiàn)任何陽性反應時，應該用相鄰高的力度再次刺激；對大鼠進行刺激后很快地出現(xiàn)炎癥反應時，應該用相鄰低的力度再次進行刺激。連續(xù)刺激所有大鼠，記錄大鼠第一次出現(xiàn)陽性反應的情況，再連續(xù)測定5 次，每次刺激間隔10 min。計算50%陽性反應刺激力度，即為大鼠的MWT。

1.6.2 熱痛閾值（TWL）的測定分別于CCI 前、CCI 后第3 天、第7 天和第14 天測定3 組大鼠TWL值。把大鼠放置在玻璃板上，讓其適應新環(huán)境15 min，對大鼠的足底部進行熱痛敏刺激。照射過程中，將大鼠第1 次出現(xiàn)抬腿的時間記為TWL。大鼠足部照射時間一次不能超過30 s，防止大鼠的足底部受到損傷。測定1 次TWL，共測定5 次，分別取后3 次的平均值。

1.7 透射電鏡觀察大鼠脊髓L4～L6 節(jié)段自噬小體數(shù)量和線粒體形態(tài)

將固定后的脊髓組織常規(guī)樹脂包埋，制成厚度為80 nm 的超薄切片，裱貼于銅網(wǎng)上，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察大鼠脊髓L4～L6節(jié)段自噬小體數(shù)量和線粒體形態(tài)。每張切片取10 個視野進行觀察。

1.8 Western blotting 檢測大鼠脊髓組織中PINK1 和Parkin 蛋白表達

將解凍的50 mg 脊髓組織取出，裂解細胞并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在-20℃的冰箱中。提取的蛋白溶液和緩沖溶液按照4∶1 的比例混勻，蛋白溶液全部進行煮沸處置。將50 μg 的蛋白樣品注入電泳板。將電泳板的蛋白樣品全部轉(zhuǎn)到PVDF 膜，脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗前，用TTBS 溶液洗滌，每次漂洗10 min，一共漂洗3 次，漂洗后再加入二抗，稀釋后封閉1 h。最后取出PVDF膜，用TTBS 溶液再次漂洗，DAB 溶液顯影后觀察。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用重復測量設計的方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠一般情況比較

3 組大鼠手術后恢復良好，均無感染、死亡及肢體癱瘓的情況出現(xiàn)。Sham 組大鼠的情況良好；NP 組大鼠手術側(cè)肢體后爪有內(nèi)收的現(xiàn)象，偶有大鼠跛行；與NP 組大鼠比較，GDNF 組大鼠的情況明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 3組大鼠行為學特點比較

Sham 組、NP 組及GDNF 組大鼠術前及術后3 d、7 d、14 d 的MWT 和TWL 比較，采用重復測量設計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的MWT 值及TWL 值有差異（FMWT=220.200，PMWT=0.000；FTWL=48.040，PTWL=0.000）。②Sham 組、NP 組及GDNF 組大鼠MWT 值及TWL 值比較有差異（FMWT=122.700，PMWT=0.000；FTWL=121.100，PTWL=0.000）。③Sham組、NP 組及GDNF 組大鼠MWT 值及TWL 值變化趨勢有差異（FMWT=24.39，PMWT=0.000；FTWL=15.82，PTWL=0.000）。見表1、圖1 和表2、圖2。

表1 3組大鼠MWT比較 （n=10，g,±s）

表1 3組大鼠MWT比較 （n=10，g,±s）

組別Sham組NP組GDNF組術前14.13±1.81 13.61±2.13 15.12±1.12術后3 d 13.51±1.61 4.82±1.12 7.13±1.13術后7 d 13.13±2.12 3.51±1.14 6.02±1.51術后14 d 13.71±1.73 4.14±1.21 6.72±1.42

圖1 3組大鼠MWT比較

表2 3組大鼠TWL比較 （n=10，s,±s）

表2 3組大鼠TWL比較 （n=10，s,±s）

組別Sham組NP組GDNF組術前11.71±1.12 11.92±1.31 12.14±1.13術后3 d 12.31±0.92 7.43±0.91 9.14±0.92術后7 d 11.92±1.13 5.93±1.12 8.01±2.22術后14 d 12.03±1.02 5.82±1.13 8.11±1.21

圖2 3組大鼠TWL比較

2.3 3組大鼠線粒體形態(tài)和自噬小體數(shù)量比較

Sham 組大鼠脊髓組織細胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體的結(jié)構(gòu)相對完好，線粒體未見腫脹或空泡、小室的現(xiàn)象；與Sham組比較，NP組大鼠脊髓組織中完整自噬小體雙膜結(jié)構(gòu)較少，線粒體分別出現(xiàn)腫脹甚至空泡變性，還有一部分線粒體會和溶酶體相互融合；GDNF組大鼠脊髓組織的情況明顯好于NP組。見圖3。

圖3 3組大鼠脊髓組織中的線粒體和自噬小體 （透射電鏡×25 000）

2.4 大鼠脊髓組織中PINK1和Parkin蛋白表達

3 組大鼠各10 只，與Sham 組PINK1 和Parkin 蛋白比較顯示，NP 組大鼠脊髓組織中的蛋白升高（P＜0.05）；經(jīng)過GDNF 干預治療后發(fā)現(xiàn)，GDNF 組大鼠脊髓組織中PINK1 和Parkin 蛋白降低（P＜0.05）。見圖4 和圖5。

圖4 3組大鼠脊髓組織中PINK1和Parkin蛋白表達

圖5 3組大鼠脊髓組織中PINK1和Parkin蛋白表達

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是最為常見的一種慢性疾病，其與受損神經(jīng)部位神經(jīng)元正常生理活動發(fā)生改變有關[11-12]。神經(jīng)元通過異常放電向脊髓神經(jīng)元發(fā)放異常沖動，強化脊髓興奮性，同時讓感覺功能出現(xiàn)異常。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)病理性疼痛在動物實驗中存在自噬現(xiàn)象[13]。金桂林等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當外周神經(jīng)受到損傷后，其中的GABA神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的自噬功能會受到損傷，這很可能是神經(jīng)病理性疼痛對其的誘導。線粒體自噬在自噬過程中具有一定的選擇性，介導受損細胞的清除。線粒體自噬功能紊亂可能會導致許多系統(tǒng)功能紊亂，如腫瘤、心血管、肌肉等相關疾病[15]。PINK1/Parkin 作為主要的信號轉(zhuǎn)導通路，參與細胞調(diào)控線粒體自噬。既往認為，Parkin在細胞線粒體自噬中扮演主要角色。但最新研究顯示，在線粒體損傷中，PINK1不僅是主要的標志，也能有效地清除細胞中失去功能的線粒體。自噬這一生理過程普遍存在于真核生物細胞內(nèi)，將細胞可利用成分進行分解回收，同時清除無用細胞成分，包括細胞質(zhì)、蛋白和細胞器等。生理情況下，神經(jīng)細胞會通過線粒體的自噬作用對線粒體的質(zhì)量進行調(diào)控，讓受到損傷的線粒體全部清除，從而發(fā)揮神經(jīng)細胞的保護作用。到目前為止，還沒發(fā)現(xiàn)徹底治療神經(jīng)病理性疼痛的方法，并且對其發(fā)病機制也不是十分清楚。GDNF是近些年新發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，在所有的運動神經(jīng)元營養(yǎng)因子中也是最活躍的[16]。因此本文用GDNF對神經(jīng)病理性疼痛大鼠進行干預，研究其對脊髓組織中PINK1蛋白和Parkin蛋白的影響。

本實驗復制CCI模型，通過對大鼠行為學的觀察比較發(fā)現(xiàn)，3 組大鼠MWT 和TWL 在CCI 前的閥值均沒有明顯變化，與Sham組大鼠的術后3 d、7 d和14 d的MWT 和TWL 比較，NP 組大鼠明顯降低；經(jīng)過GDNF 干預后，GDNF 組大鼠在各個時間的MWT 和TWL比NP組大鼠明顯增加?？梢奊DNF對NP模型大鼠發(fā)揮了鎮(zhèn)痛作用。同時，與NP組大鼠相比，GDNF組大鼠脊髓組織一般情況明顯好轉(zhuǎn)，并且線粒體的數(shù)目也顯著增多，提示GDNF 可抑制NP 模型大鼠脊髓組織細胞自噬活性，同時對線粒體損傷具有改善作用。在本研究中，經(jīng)過GDNF 干預后NP 模型大鼠脊髓組織細胞自噬活性改變與大鼠疼痛行為學改變呈相反趨勢，同時伴有線粒體數(shù)目和形態(tài)的改變，由此可認為，GDNF 可能通過調(diào)控脊髓組織線粒體自噬活性，改善線粒體損傷，從而參與對NP 大鼠模型鎮(zhèn)痛作用的機制。陳貴軍等[17]通過對腦卒中大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中大鼠神經(jīng)肝細胞移植治療時，神經(jīng)干細胞經(jīng)GDNF修飾后，可有效提升治療效果，同時減輕神經(jīng)損傷的程度。李真真等[18]通過對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可不同程度地提高大鼠的機械痛閥值和熱刺激痛閥值。

目前，Parkin和PINK1信號是線粒體自噬的主要途徑，其對線粒體功能的維持和代謝都起重要作用[19]。目前，在線粒體的自噬障礙中，Parkin和PINK1信號起著重要的介導作用，同時對退行性疾病也有嚴重影響。在正常的線粒體外膜中PINK1呈低表達，幾乎檢測不到，只有當內(nèi)源性PINK1的表達升高才會檢測到其存在。聚集在線粒體外膜的PINK1具有募集Parkin的作用。PINK1與Parkin會相互作用，從而對線粒體自噬的活性進行調(diào)節(jié)，以此對線粒體的數(shù)量和功能進行有效維持。有研究證實，GDNF 能有效地保護神經(jīng)損傷，進而抑制神經(jīng)病理性疼痛，DRG 神經(jīng)元中和傷害性有關的物質(zhì)、P 物質(zhì)和VRI 的表達均可通過GDNF 上調(diào)[20]。A 類纖維物質(zhì)會直接影響神經(jīng)損傷而造成的神經(jīng)痛，同時NGF 也會對A 類纖維物質(zhì)進行調(diào)節(jié)，所以GDNF 在不表達NGF 的DRG 神經(jīng)元中就顯得特別重要，并且極有可能在神經(jīng)病理性疼痛中起重要作用。本研究通過大鼠PINK1 和Parkin 蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，NP 組大鼠的PINK1 和Parkin 蛋白表達升高；當NP 模型大鼠經(jīng)過GDNF 干預后，大鼠脊髓組織中PINK1 和Parkin 蛋白顯著降低。因此可以推測，PINK1 和Parkin 通路活性降低，介導脊髓組織細胞線粒體自噬水平的改變，進而發(fā)揮其對NP模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用，其可能是GDNF 對NP 模型大鼠發(fā)揮治療作用的機制之一。MEKA 等[21]發(fā)現(xiàn)，GDNF 可降低大鼠Parkin 蛋白的表達，從而預防多巴胺能神經(jīng)元變性。CHOONG 等[22]通過對帕金森病的研究證實，新型神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF 能有效地抑制PINK1 蛋白的表達，從而有效地減輕帕金森病的嚴重程度。

綜上所述，GDNF 的作用機制可能是通過抑制PINK1 蛋白和Parkin 蛋白的表達，從而有效地減輕神經(jīng)病理性疼痛。