結(jié)直腸癌患者血清microRNA-335、microRNA-497表達與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系*

聶向榮，武劍磊，武永慶

[邯鄲市中心醫(yī)院1.普外三科，2.邯鄲市中心醫(yī)院急診外科，河北邯鄲056001；3.武安市第一人民醫(yī)院骨科，河北武安056399]

2018年國際結(jié)直腸癌新發(fā)病例約為110萬人，占惡性腫瘤新發(fā)病例的6.1%，而死亡人數(shù)約為55 萬人，占惡性腫瘤死亡人數(shù)的5.8%，發(fā)生率和病死率分別排在惡性腫瘤的第4 位和第5 位，對人們的生命健康造成嚴重威脅[1]。目前對結(jié)直腸癌的發(fā)病過程仍然缺乏了解，已有研究報道在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中大量microRNA（miRNA）的表達存在異常[2]。miRNA 是一類長度在20～25 nt 的單鏈RNA 分子，不編碼多肽和蛋白質(zhì)，但是在細胞分裂、分化、細胞代謝、細胞物質(zhì)運輸?shù)冗^程中均起到一定的調(diào)節(jié)作用[3]。其中microRNA-335（miR-335）與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是一種抑癌基因，在肝癌和肺癌中低表達，并且能夠抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。microRNA-497（miR-497）同樣是一種抑癌基因，在肝癌和喉鱗狀細胞癌中低表達，并且miR-497低表達與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[5-6]。本研究通過檢測血清miR-335、miR-497 表達水平，探討其表達水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報道結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年2月—2014年9月于邯鄲市中心醫(yī)院診治的結(jié)直腸癌患者99 例作為結(jié)直腸癌組。其中，男性59 例，女性40 例；年齡42～75 歲，平均（58.67±13.96）歲；腫瘤直徑＜5 cm 的52 例，腫瘤直徑≥5 cm 的47 例。32 例腫瘤位于左半結(jié)腸，31 例位于右半結(jié)腸，36 例位于直腸。浸潤深度T1患者11 例，T2患者16 例，T3患者39 例，T4患者33 例。TNM 分期Ⅰ期患者41 例，Ⅱ期患者27 例，Ⅲ期患者31 例。腫瘤低分化患者17 例，腫瘤中分化患者51例，腫瘤高分化患者31例。有脈管浸潤25例，有神經(jīng)浸潤9例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者37 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者62 例。選擇同期在該院體檢的99 例健康者作為健康組。其中，男性53例，女性46例。年齡40～71歲，平均（54.96±12.87）歲。納入標準：①患者經(jīng)病理學診斷確診為結(jié)直腸癌；②入院前6 個月內(nèi)無抗炎藥物治療史；③無放化療治療史；④患者適宜進行手術(shù)治療。排除標準：①合并其他腫瘤；②存在全身性感染性疾病、系統(tǒng)性疾病和自身免疫性疾??；③臨床病理資料不完整；④入院前3 個月內(nèi)有外科手術(shù)史。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象簽署同意書。

1.2 實驗試劑及儀器

miRNA 分離試劑盒（商品編號：QA1290）、cDNA合成試劑盒（商品編號：QA2317）、mirVana?qRTPCR miRNA 檢測試劑盒（商品編號：QA1541）均購自德國Qiagen 有限公司，引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。臺式高速離心機（型號：5810）購自美國Eppendorf 科學儀器有限公司，熒光定量PCR 儀（型號：VIIA7）購自美國ABI 科技有限公司。

1.3 血清miR-335、miR-497表達水平檢測

1.3.1 血清總RNA提取采集入組人員空腹靜脈血5 ml（健康組體檢時及結(jié)直腸癌組入院后），室溫3 000 r/min 離心20 min，半徑10 cm，取上清液于另一干凈離心管中，置入-80℃冰箱冷凍保存。采用miRNA 分離試劑盒對血清中的總RNA 進行提取，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 miRNA 逆轉(zhuǎn)錄使用cDNA 合成試劑盒對miRNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μl，包括：總RNA 1 μl，miRNA-Script-緩沖液4 μl，逆轉(zhuǎn)錄引物Mix 2 μl，蒸餾水13 μl。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃逆轉(zhuǎn)錄1 h；98℃酶滅火10 min。

1.3.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測使用mirVana?qRT-PCR miRNA 檢測試劑盒對逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 進行定量檢測，反應(yīng)體系總體積20 μl，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，水7 μl，SYBR Mix 10 μl，PCR 正反向引物各0.5 μl。反應(yīng)條件：95℃變性20 s，53℃退火30 s,72℃延伸30 s，循環(huán)35 次。miR-335正向引物：5'-TAAAGGGGGTTTTGTTTATT-3'，反向引物：5'-CCCACAAACTACCCACAAAC-3'。miR-497正向引物：5'-GTCCTATCCAGTGCAGGGT-3'，反向引物：5'-CCAGGTATTCCCACTCGGATAC-3'。以U6基因作為內(nèi)參，U6引物序列，正向：5'-CGCTTCGG CAGCACATATAC-3'，反向：5'-AAATATGGAACGCT TCACGA-3'。根據(jù)2-△△Ct法計算miR-335、miR-497的相對表達量，-△△CtmiR-335=△CtmiR-335-△CtU6，-△△CtmiR-497=△CtmiR-497-△CtU6。以健康組和結(jié)直腸癌組血清miR-335、miR-497 相對表達量的均值作為相應(yīng)的分組依據(jù)，其中，血清miR-335 相對表達量≥21.26 為高表達，＜21.26 為低表達。血清miR-497相對表達量≥18.06為高表達，＜18.06為低表達。

1.4 隨訪

隨訪方式以電話隨訪和門診復(fù)查為主，當患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或死亡時隨訪結(jié)束?；颊叩纳鏁r間為治療結(jié)束日至末次隨訪日或治療結(jié)束日至患者死亡日。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析；計數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-335、miR-497相對表達量的比較

兩組血清miR-335 和miR-497 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結(jié)直腸癌組低于健康組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清miR-335、miR-497相對表達量比較（n=99，±s）

表1 兩組血清miR-335、miR-497相對表達量比較（n=99，±s）

組別健康組結(jié)直腸癌組t 值P 值miR-335 29.73±9.59 12.79±3.55 16.483 0.000 miR-497 26.16±8.44 9.95±2.76 18.163 0.000

2.2 結(jié)直腸癌患者不同因素血清miR-335 和miR-497 相對表達量的比較

不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的血清miR-335 相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期、分化程度的患者血清miR-335相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），TNM 分期Ⅰ、Ⅱ和高分化患者血清miR-335 相對表達量高于TNM分期Ⅲ和低分化患者。

不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的血清miR-497 相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清miR-497相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），浸潤深度T1、T2，TNM分期Ⅰ、Ⅱ，及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清miR-497 相對表達量高于浸潤深度T3、T4，TNM分期Ⅲ，及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者不同因素間血清miR-335和miR-497表達水平的比較 （±s）

表2 結(jié)直腸癌患者不同因素間血清miR-335和miR-497表達水平的比較 （±s）

臨床病理特征年齡＜60歲≥60歲性別miR-335 t/F 值P 值miR-497 t/F 值P 值13.05±4.21 12.29±3.41 1.165 0.247 10.21±3.29 9.45±2.63 0.908 0.366男女12.87±4.15 12.67±3.52 0.273 0.786 10.02±3.23 9.85±2.74 0.250 0.803

續(xù)表2

2.3 血清miR-335、miR-497表達水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

血清miR-335 高表達組患者的中位生存時間為55 個月，5年生存率為67.24%（39/58）。血清miR-335低表達組患者的中位生存時間41個月，5年生存率為48.78%（20/41）。兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.594，P=0.018），血清miR-335 高表達組患者5年生存率高于低表達組患者。血清miR-49 高表達組患者的中位生存時間為55 個月，5年生存率為65.45%（36/55）。血清miR-497 低表達組患者的中位生存時間42個月，5年生存率為52.27%（23/44）。兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.046，P=0.044），血清miR-497 高表達組患者5年生存率高于低表達組患者。見圖1。

圖1 血清miR-335、miR-497高低表達組生存曲線圖

3 討論

miRNA 能夠與基因的信使RNA（mRNA）非編碼區(qū)結(jié)合，促進mRNA 的降解，從而調(diào)控基因的表達水平[7]。一種miRNA 能夠與多種基因的mRNA 結(jié)合，從而調(diào)控多種基因的表達，并且miRNA 之間也存在相互調(diào)控機制，因此在細胞中存在復(fù)雜的miRNA 調(diào)控途徑[8]。通過RNA-seq和基因芯片等高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中miRNA 途徑發(fā)生紊亂，部分miRNA 的表達呈現(xiàn)顯著上調(diào)和顯著下調(diào)趨勢，導致細胞的惡性增殖和腫瘤發(fā)生[9]。例如XU等[10]通過RNA-seq 技術(shù)對結(jié)直腸癌細胞進行RNA 組學高通量測序，發(fā)現(xiàn)眾多miRNA 表達異常，并且存在十分復(fù)雜的miRNA-mRNA 調(diào)控途徑。對結(jié)直腸癌中miRNA 的表達情況及其與預(yù)后的關(guān)系進行分析，對制訂針對性干預(yù)措施以提高和改善患者的預(yù)后和生存具有重要意義。

miR-335 能夠抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在胃癌和甲狀腺癌中miR-335 表達水平均下調(diào)[11]。首先，miR-335 能夠抑制促癌基因的表達，繼而抑制腫瘤細胞的惡性增殖，從而發(fā)揮抑癌基因的作用。如LIU等[12]的研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中miR-335能夠抑制生存素促癌基因的表達，進而促進胃癌細胞增殖。其次，miR-335能夠抑制腫瘤增殖相關(guān)信號通路的活化，進而抑制腫瘤細胞的增殖。WANG等[13]發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）信號通路中ERK1和ERK2基因均是miR-335 的直接作用靶點，miR-335 能夠下調(diào)ERK1和ERK2基因表達，進而抑制ERK 信號通路的活化，從而抑制膀胱癌細胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌患者中血清miR-335表達水平下降，表明miR-335可能起到抑癌基因的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-335表達水平在TNM 分期較高、分化程度較低的結(jié)直腸癌患者中降低，表明miR-335 低表達可能與結(jié)直腸癌的惡性增殖和低分化密切相關(guān)。Kaplan-Meier 生存曲線結(jié)果顯示miR-335 低表達患者的總生存率下降，表明miR-335 表達水平與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，并且miR-335 低表達結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差。推測其原因，可能是由于人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）、ERK和多聚ADP 核糖轉(zhuǎn)移酶（PARP1）等基因均是miR-335 的作用靶點，而PTEN、ERK和PARP1是較強的促癌基因，能夠有效促進腫瘤細胞增殖，同時降低腫瘤的分化程度，并且三者在MAPK、ERK 和凋亡相關(guān)信號通路中均起到關(guān)鍵作用，與腫瘤的惡性程度存在明顯的正相關(guān)性，miR-335 抑制PTEN、ERK和PARP1表達能夠有效降低結(jié)直腸癌的惡性程度，從而抑制結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展[14-15]。

miR-497 是與腫瘤發(fā)病密切相關(guān)的miRNA，在骨肉瘤和乳腺癌中表達缺失，能夠抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且miR-497 低表達與骨肉瘤和乳腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[16]。miR-497 對腫瘤細胞的作用機制主要是通過調(diào)節(jié)癌基因表達完成的，miR-497 能夠與癌基因mRNA 的非編碼區(qū)結(jié)合，導致mRNA 的穩(wěn)定性下降并促進核糖核酸酶對mRNA的降解，從而導致癌基因表達水平下降。例如CHENG 等[17]發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中胰島素樣生長因子受體1（IGF1R）癌基因是miR-497 的直接作用靶點，miR-497 能夠下調(diào)IGF1R 癌基因表達，進而抑制肝癌發(fā)生發(fā)展。同時miR-497 也可與lncRNA 結(jié)合并介導lncRNA 降解，形成lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控途徑，lncRNA 與miR-497 的結(jié)合能夠解除miR-497 對癌基因的抑制作用，從而促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。例如MA 等[18]研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中miR-497 能夠與長鏈非編碼RNA X 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本（lnc RNA XIST）結(jié)合，從而解除miR-497 對人結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)基因1（MACC1）的抑制作用，進而促進胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。其次，miR-497 能夠同時抑制信號通路中多個基因的表達，進而抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路的活化，導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展受到抑制。例如TAO 等[19]發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細胞中miR-497 能夠負調(diào)控絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號通路的活化，進而促進宮頸癌細胞凋亡并抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌患者中血清miR-497 表達水平下降，表明miR-497 表達水平可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并且在結(jié)直腸癌中可能起到抑癌基因的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-497 表達水平在浸潤深度較深、TNM分期較高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中降低，表明miR-497 低表達可能與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Kaplan-Meier 生存曲線結(jié)果顯示miR-497低表達患者的總生存率下降，表明miR-497 表達水平與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，并且miR-497 低表達結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差。推測其原因，可能是由于miR-497 作為抑癌基因在腫瘤當中具有普遍性，miR-497 在結(jié)直腸癌中低表達導致miR-497 對MAPK信號通路的抑制作用下降，使得MAPK 信號通路異?；罨?，而MAPK 信號通路參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，因此結(jié)直腸癌miR-497 表達下降會促進結(jié)直腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，導致結(jié)直腸癌細胞在患者體內(nèi)擴散并形成相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶，導致患者出現(xiàn)臟器衰竭而死亡[20]。

綜上所述，血清miR-335、miR-497 在結(jié)直腸癌患者中的表達水平下降，且miR-497 表達水平與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，而miR-335 表達水平與結(jié)直腸癌的惡性增殖和分化程度有關(guān)，兩者的低表達與結(jié)直腸癌患者的不良生存預(yù)后有關(guān)。鑒于miR-335、miR-497 在多種腫瘤中均低表達，是否能作為結(jié)直腸癌的標志物還需要進一步深入研究，并且對兩者在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制仍需要進一步深入探究。