舒肝益脾顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

顏瑞琪，栗建明，顧利紅，侯惠嬋，袁震霆

（廣州市藥品檢驗(yàn)所·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510160）

舒肝益脾顆粒由茵陳、蒲公英、五味子、黃芪、茯苓、山楂組方，具有清化濕熱、舒肝利膽、解毒退黃、健脾和胃功效［1］，為肝膽類疾病臨床常用藥。茵陳為方中君藥；五味子中含有木脂素類（五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等）、揮發(fā)油類和三萜類等活性成分，具有保肝護(hù)肝、鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等藥理作用［2－7］。目前，該品種有 6 家企業(yè)擁有批準(zhǔn)文號(hào)，各企業(yè)執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均不一致，生產(chǎn)工藝參數(shù)、檢驗(yàn)項(xiàng)目、含量測(cè)定指標(biāo)和限度均有較大差異，包括含蔗糖型和無(wú)蔗糖型。由于已有標(biāo)準(zhǔn)中薄層色譜（TLC）鑒別缺乏對(duì)茵陳的質(zhì)量控制，五味子含量測(cè)定僅以單一成分為控制指標(biāo)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善，不能有效控制該品種的質(zhì)量。近年來(lái)，多指標(biāo)含量測(cè)定已廣泛應(yīng)用于中藥材、中成藥的質(zhì)量控制［4，8－17］。本課題中采用 TLC 法對(duì)茵陳進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定舒肝益脾顆粒中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量，建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該制劑的深層次開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制提供可行性方案。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A 型高效液相色譜儀，包括SIL－20AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO－20A 柱溫箱、SPD－M20A 檢測(cè)器和LabSolutions 色譜工作站（日本 Shimadzu 公司）；XP26 型和XS204 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；硅膠G60 薄層預(yù)制板（德國(guó) Merck 公司）；Elmasonicp P300H型超聲儀（德國(guó)Elma 公司）。

1.2 試藥

茵陳對(duì)照藥材（批號(hào)為120950－201608），五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)為110857－201815，含量為99.7%），五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)為110764－201714，含量為99.3%），五味子乙素對(duì)照品（批號(hào)為110765－201512，含量為99.0%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；舒肝益脾顆粒（M1 公司，批號(hào)為 S1 及 S2；M2 公司，批號(hào)為 S3－S7；M3 公司，批號(hào)為 S8－S12）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 茵陳 TLC 鑒別

取樣品10 g（含蔗糖型）或2 g（無(wú)蔗糖型），研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲（功率為380 W，頻率為37 kHz，下同）處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至5 mL，即得供試品溶液。另取茵陳對(duì)照藥材 1.5 g，加水 30 mL，煎煮 60 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，即得對(duì)照藥材溶液。另取缺茵陳的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》（通則 0502）TLC 法試驗(yàn)，在溫度為 20 ℃、相對(duì)濕度為58%條件下吸取上述供試品溶液2 ～4 μL 及對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯 － 乙酸乙酯 － 丙酮（5 ∶3 ∶2，V ／ V ／ V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置365 nm 紫外光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同藍(lán)色的熒光主斑點(diǎn)。陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1。

2.2 五味子含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）－ 0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫 （0 ～ 15 min 時(shí) 56%A，15 ～ 25 min 時(shí) 56% →75%A，25 ～44 min 時(shí) 75%A）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：217 nm；柱溫：30 ℃。

圖1 薄層色譜圖1.Negative reference solution 2.Reference medicinal materials solution 3 － 14.Test solution（batch number：S1 － S12）Fig.1 TLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

取3 種對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲50 μg、五味子甲素10 μg、五味子乙素15 μg 的混合對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下供試品，研細(xì)，取約 5.0 g（含蔗糖型）或 1.0 g（無(wú)蔗糖型），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸至近干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，并移? mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。取缺五味子的陰性樣品（企業(yè)提供），按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見(jiàn)圖2。

線性關(guān)系考察：取3 種對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇，制成五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素質(zhì)量濃度分別為 0.250 6，0.125 2，0.168 9 mg ／mL 的混合對(duì)照品貯備液，稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定。以各成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，ng）進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見(jiàn)表1。

精密度試驗(yàn)：取已知質(zhì)量濃度（五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素質(zhì)量濃度分別為 49.790，9.985，14.964 μg ／mL）的對(duì)照品溶液，按 2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的 RSD 分別為0.03%，0.09%，0.08%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

圖2 高效液相色譜圖1. schisandrol 2.schisandrin A 3. schisandrin BA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n ＝10）Tab.1 Results of linear relation test（n ＝ 10）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品1.0 g（無(wú)蔗糖型，批號(hào)為S7）或5.0 g（含蔗糖型，批號(hào)為S12），依法制備供試品溶液，分別在室溫下放置 0，4，8，16，24，30，36 h 時(shí)按 2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素峰面積的 RSD 均小于 1.00% （n ＝ 7），表明供試品溶液在室溫下36 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品1.0 g（無(wú)蔗糖型，批號(hào)為S7）或5.0 g（含蔗糖型，批號(hào)為S12），依法平行制備供試品溶液各6 份，再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果無(wú)蔗糖型樣品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量分別為 0.564 3，0.090 7，0.141 4 mg ／g，RSD 分別為 1.40% ，1.40% ，1.50% （n ＝6）；含蔗糖型樣品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量分別為0.127 9，0.061 6，0.087 8 mg ／g，RSD 分別為 0.67% ，1.51%，1.48%（n ＝6）。表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品約0.5 g（無(wú)蔗糖型）和 2.5 g（含蔗糖型），各 6 份，精密稱定，分別精密加入混合對(duì)照品溶液50 mL，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝ 6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取12 批樣品，每批取1 袋，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg／袋，n ＝2）Tab.3 Content determination of schisandrol，schisandrin A and schisandrin B in the samples（mg ／bag， n ＝ 2）

3 討論

茵陳為舒肝益脾顆粒方中君藥，但目前各企業(yè)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)該藥材的鑒別項(xiàng)目，2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》中所載茵陳分為綿茵陳和花茵陳。前期調(diào)研結(jié)果顯示，生產(chǎn)企業(yè)均使用綿茵陳投料。參考生產(chǎn)工藝，對(duì)照藥材采取水煮后醇提的處理方法，盡量保持與生產(chǎn)過(guò)程一致。同時(shí)，還考察了不同廠家的薄層色譜板（青島海洋硅膠G 板、山東煙臺(tái)硅膠G 板和默克硅膠 G60板），不同溫度（5，20，30 ℃ ），不同相對(duì)濕度（32%，58%，88%）對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，在色譜板、溫度、相對(duì)濕度發(fā)生一定變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

預(yù)試驗(yàn)中分別考察了提取方法（超聲提取、回流提?。?，提取溶劑（體積分?jǐn)?shù)為100%、75%、50%的甲醇和三氯甲烷），提取時(shí)間（30，45，60 min）對(duì) 3 種木脂素類成分提取率的影響。結(jié)果顯示，以甲醇超聲提取30 min 的效率較高，且提取時(shí)間適宜，故最終選擇此方法制備供試品溶液。

2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》五味子含量測(cè)定項(xiàng)下檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，故本試驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器，在 190 ～ 400 nm 波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，3 種對(duì)照品在217 nm 和250 nm 波長(zhǎng)處均有最大吸收，但五味子甲素、五味子乙素在250 nm 波長(zhǎng)處響應(yīng)值較弱，故最終選定217 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

由于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)各企業(yè)所控制的成分各不相同，所測(cè)成品中五味子相應(yīng)成分含量差異較大。本研究中建立的HPLC 法可用于同時(shí)測(cè)定舒肝益脾顆粒中3 種木脂素類成分含量，該方法較現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)增加了五味子的指標(biāo)成分?jǐn)?shù)量，有利于對(duì)五味子原料質(zhì)量的全面控制，設(shè)立統(tǒng)一的監(jiān)測(cè)指標(biāo)并評(píng)價(jià)該品種質(zhì)量的一致性。

綜上所述，本研究中所建立的方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度和精密度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可用于舒肝益脾顆粒中茵陳的薄層鑒別，以及五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素3 種木脂素類成分含量的同時(shí)測(cè)定，可為舒肝益脾顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。