熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及高效液相色譜指紋圖譜研究*

王雯 ，楊 錦 ，梁馨月 ，薛佩蕓 ，陳 萍 ，△

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2. 兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所，陜西 西安 710065； 3. 陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

熟地黃是由玄參科植物地黃 Rehmannia glutinosa Libosch. 的新鮮或干燥塊根經(jīng)酒燉法或蒸法制成，為生地黃炮制加工品，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)血滋陰、益精填髓之功效，常用于治療精血不足和肝腎陰虛等證［1－2］。熟地黃含有環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、糖類、氨基酸類、金屬離子等多種化學(xué)成分［3］。2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》中收載的含熟地黃的成方制劑有151 種?！吨嗅t(yī)方劑大辭典精選本》中含熟地黃的方劑有739 首，且熟地黃常與補(bǔ)益藥、清熱藥、活血化瘀藥、利水滲濕藥、收澀藥、溫里藥配伍［4－5］，常入四物湯、六味地黃湯等中醫(yī)經(jīng)典湯劑?！皽呤幰?，去大病用之?！闭f明中藥飲片制成湯劑內(nèi)服吸收快、藥效發(fā)揮迅速，且可隨證加減。本研究中依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》，確定標(biāo)準(zhǔn)湯作為中藥配方顆粒的研究參照物，通過測(cè)定熟地黃中地黃苷D 含量，以出膏率、總多糖含量、轉(zhuǎn)移率為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立高效液相色譜指紋圖譜，為熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；U－2910 型紫外 －可見分光光度計(jì)（日本 Hitachi 公司）；BT25S 型電子天平（精度為十萬分之一）、BS210S 型電子天平（精度為萬分之一），均購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；CP2102 型電子天平（奧豪斯儀器＜常州＞有限公司，精度為百分之一）；RM2135 型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；KQ－500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；202V1 型電熱恒溫干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）；YF111 型高速粉碎機(jī)（江陰市創(chuàng)新機(jī)械設(shè)備有限公司，容量為100 g）。

1.2 試藥

地黃苷D 對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為L(zhǎng)21O10Y100752，含量≥98 %）；桃葉珊瑚苷對(duì)照品（批號(hào)為111761－200601，含量≥98%），D－無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)為 110833－201908，含量≥99.8%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。15 批熟地黃飲片，按2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》熟地黃項(xiàng)下要求，進(jìn)行基原、形狀、顯微、薄層層析鑒別，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院楊智峰教授鑒定為正品；進(jìn)行水分、總灰分、酸不溶性灰分檢查，并測(cè)定浸出物及毛蕊花糖苷、地黃苷D 含量，詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯制備

取15 批樣品飲片各100 g，加熱、煎煮2 次，第1 次加入7 倍量水，浸泡30 min，加熱回流提取60 min，趁熱濾過，收集濾液，第2 次加入6 倍量水，回流提取40 min，趁熱濾過，合并 2 次濾液，并濃縮至 500 mL，得標(biāo)準(zhǔn)湯［6］。

2.2 干膏率計(jì)算

分別精密量取15 批熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯各5 mL，分別置恒重蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?05 ℃干燥3 h，取出，分別置干燥器中放置30 min，稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏率。干膏率（% ）＝ 干膏質(zhì)量（g）× 總體積（mL）／ ［取樣量 × 總生藥量（g）］× 100% 。結(jié)果干膏率平均值為 67.01% ，詳見表2。

2.3 總多糖含量測(cè)定

溶液制備：稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品43.43 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為 1.737 2 mg／mL 的葡萄糖對(duì)照品溶液。分別精密量取15 批標(biāo)準(zhǔn)湯各0.5 mL，分別置10 mL 離心管中，加8 mL 無水乙醇，渦旋混勻，放置過夜，離心，傾出上清液，沉淀用80%乙醇洗滌2 次；沉淀加水溶解，搖勻，定容，即得供試品溶液。

表1 15 批熟地黃飲片信息（%）Tab.1 Information of 15 batches of Rehmanniae Radix Praeparata（%）

表2 樣品中干膏率及總多糖、地黃苷D 含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.2 Determination of dry extract rate，total polysaccharide and rehmannioside D content in the samples（%）

線性關(guān)系考察：精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.2，1.6，2.0，3.0 mL，分別置 50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為 0，2.084 64，4.169 28，6.253 92，8.338 56，12.507 84，16.677 12，20.846 40，31.269 60 μg ／mL 的系列對(duì)照品溶液。分別精密量取3 mL，各置10 mL 容量瓶中，加5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速滴加濃硫酸6 mL，渦旋混勻，50 ℃水浴40 min，取出，置水中，冷卻至室溫，混勻，以 0 μg／mL 為空白溶液，于 490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（ Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（ X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得總多糖回歸方程 Y ＝0.047 77X－0.022 82，R2＝0.997 17（n ＝9）。結(jié)果表明，總多糖進(jìn)樣量在2.084 64 ～31.269 60 mg 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

含量測(cè)定：分別精密量取2.1 項(xiàng)下15 批標(biāo)準(zhǔn)湯各0.5 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加水 2.5 mL，搖勻。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下方法，自“加5 %苯酚溶液1.0 mL”起依法測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，即得總多糖含量。結(jié)果總多糖含量平均值為3.58%，詳見表2。

2.4 地黃苷D 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 －0.1 % 磷酸溶液（5 ∶95，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：23 ℃［1］；進(jìn)樣量：10 μL［7－8］。

2.4.2 溶液制備

取地黃苷D 對(duì)照品適量，精密稱定，以25 %甲醇溶解，制成地黃苷 D 質(zhì)量濃度為 76.6 μg ／mL 的對(duì)照品溶液。分別精密量取2.1 項(xiàng)下15 批標(biāo)準(zhǔn)湯各5 mL，水浴蒸至近干，殘?jiān)?5%甲醇溶解，移至10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密量取水10 mL，同供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取地黃苷D 對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果理論板數(shù)以地黃苷D 峰計(jì)大于5 000，與相鄰色譜峰分離度均大于1.5。詳見圖1。

專屬性試驗(yàn)：取地黃苷D 對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜圖中，在與地黃苷D 對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間（30.3 min）處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.rehmannioside DA. Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取地黃苷D 對(duì)照品溶液 0.1，0.5，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加25%甲醇定容，搖勻，制成系列對(duì)照品溶液。按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣 10 μL 測(cè)定，記錄峰面積。以地黃苷 D 質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y ＝5.614 15 X ＋4.563 44，R2＝0.999 98（n ＝7）。結(jié)果表明，地黃苷 D 進(jìn)樣量在15.32 ～306.40 mg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取地黃苷D 對(duì)照品溶液和2.4.2 項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD 分別為0.89%和 0.64%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.4.2 項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，8，12，16，24 h 時(shí)按 2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD 為 0.87%（n ＝7），表明供試品溶液在室溫放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取標(biāo)準(zhǔn)湯 5 mL，共 6 份，按 2.4.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算地黃苷D 含量。結(jié)果地黃苷D平均含量為 0.118 mg／mL，RSD 為 1.85 % （n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的標(biāo)準(zhǔn)湯（批號(hào)為20200201）0.5 mL，共 9 份，分別精密加入地黃苷 D 對(duì)照品溶液（61.28 μg ／mL）0.5，1.0 mL，地黃苷 D 對(duì)照品溶液（122.56 μg ／mL）0.7 mL，按 2.4.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）Tab.3 Results of the recovery test（n ＝ 9）

2.4.4 樣品含量測(cè)定

取15 批地黃標(biāo)準(zhǔn)湯各適量，分別按2.4.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)湯、飲片中地黃苷D 含量及轉(zhuǎn)移率［9－10］。轉(zhuǎn)移率（% ）＝ 本項(xiàng)指標(biāo)成分中含量 ／飲片（上一環(huán)節(jié)）中指標(biāo)成分含量×100%。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)湯、飲片中地黃苷D 平均含量分別為0.064%和0.087%，轉(zhuǎn)移率平均值為74.275%，詳見表2。

2.5 高效液相色譜指紋圖譜建立

溶液制備方法及方法學(xué)考察同2.4 項(xiàng)。取15 批熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯適量，按2.4.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將15 批熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯的色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）”，以參照?qǐng)D譜為 S1，時(shí)間寬度設(shè)為 0.10，采用多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜（R），計(jì)算相似度，詳見圖2、圖3 和表4。結(jié)果15 批熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯指紋圖譜相似度與對(duì)照?qǐng)D譜相似度均大于0.95，表明一致性很好［11－15］。

圖2 15 批熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯的高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.2 HPLC superimposed fingerprint of 15 batches of Rehmanniae Radix Praeparata standard decoction

圖3 熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜1.aucubin 2.rehmannioside DFig.3 HPLC reference fingerprint of Rehmanniae Radix Praeparata standard decoction

3 討論

3.1 色譜條件選擇

本研究中參考了 2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》［1］熟地黃項(xiàng)下地黃苷D 的含量檢測(cè)色譜條件，并綜合比較峰形、分離度、出峰時(shí)間等參數(shù)，流動(dòng)相體系選擇與藥典一致［甲醇 － 0.1% 磷酸溶液（5 ∶95，V ／ V）］，在 203 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。

3.2 特征成分及參數(shù)范圍確定

熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯中地黃苷D 提取率高、轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定，能表征提取物的均一性，因此采用地黃苷D 為質(zhì)量評(píng)價(jià)的定量指標(biāo)成分［9，16］。按 15 批熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯以各參數(shù)均值的75% ～125%計(jì)，參數(shù)范圍為，出膏率 50.26% ～83.76%，地黃苷 D 轉(zhuǎn)移率 55.700% ～ 92.833% ，各項(xiàng)實(shí)測(cè)值均在標(biāo)準(zhǔn)湯參數(shù)范圍內(nèi)，表明熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯質(zhì)量均一性好［16－17］。

表4 15 批熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯高效液相色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)Tab.4 Similarity of HPLC fingerprints of 15 batches of Rehmanniae Radix Praeparata standard decoction

2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》熟地黃項(xiàng)下含量測(cè)定項(xiàng)為毛蕊花糖苷的檢測(cè)，由于毛蕊花糖苷含量在地黃中僅為萬分之二，且在炮制過程中極不穩(wěn)定，易發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化。針對(duì)此問題，國(guó)家通過立項(xiàng)研究與評(píng)價(jià)抽驗(yàn)結(jié)合，將毛蕊花糖苷換成有滋陰、補(bǔ)血及降血糖活性且含量較高、性質(zhì)更穩(wěn)定的地黃苷D 作為熟地黃的含量測(cè)定指標(biāo)［18］。

綜上所述，所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及高效液相色譜指紋圖譜可為熟地黃標(biāo)準(zhǔn)湯的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。