亞油酸與亞麻酸對延邊黃牛瘤胃發(fā)酵特性和脂肪酸的影響

崔 巖， 孫 斌， 李 強， 孫 芳， 嚴昌國， 李香子*

(1.延邊大學 東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林 延吉 133002;2.黑龍江農(nóng)科院畜牧研究所,黑龍江 哈爾濱 150000)

亞油酸(LA)是反芻動物日糧精飼料中富含的主要不飽和脂肪酸，而亞麻酸(LNA)是日糧粗飼料中的主要脂肪酸[1]，兩者的構成比例及含量對肉牛瘤胃微生物脂肪酸代謝起著重要的作用，影響體內脂肪酸的內源合成和結構。不同飼料對瘤胃發(fā)酵特性都有不同程度的影響[2],同樣影響著飼料降解率[3]；優(yōu)化日糧可影響揮發(fā)性脂肪酸(VFA)生成[4]；Li X Z等通過研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸對瘤胃微生物活力有不同程度的影響，特別是添加亞麻酸后可以顯著提高瘤胃微生物的總脫氫酶活性[5]。硬脂酰輔酶A去飽和酶指數(shù)(SCD)是飽和脂肪酸去飽和合成單不飽和脂肪酸(MUFA)以及C18∶1和內源合成CLA的重要參考指標。但是其指標的高低與MUFA和SFA是否存在關聯(lián)并不是很清楚。SCD基因廣泛表達于脂肪組織中，影響著前體脂肪細胞的分化，同時，合成各類脂肪反應的單不飽和脂肪酸是通過SCD合成的，因此,脂質的合成以及代謝過程都離不開SCD基因[6]。該試驗在瘤胃體外培養(yǎng)液中分別添加LA和LNA,旨在分析亞油酸和亞麻酸對延邊黃牛瘤胃微生物體外發(fā)酵相關指標的影響。通過pH值、NH3-N、VFA、脂肪酸和SCD指數(shù)等指標進一步分析延邊黃牛瘤胃的發(fā)酵規(guī)律、瘤胃微生物與組織結構的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設計

在12頭體內有瘤胃瘺管的延邊黃牛中選取3頭。根據(jù)延邊黃牛飼養(yǎng)規(guī)程進行基礎日糧配制，每天飼喂2次(7：00 和 17：30)，自由飲水、活動。試驗設置3個添加水平，對照組(CON)，根據(jù)前期預試驗條件摸索，確定亞油酸組(LA,培養(yǎng)液添加60 mg/100 mL亞油酸)，亞麻酸組(LNA,培養(yǎng)液添加60 mg/100 mL亞麻酸)3個試驗組，每個水平設 6個重復。 培養(yǎng)時間設為2，6和12 h，分別測定pH值、NH3-N含量、VFA含量、脂肪酸和SCD指數(shù)。

1.2 基礎日糧組成

基礎日糧組成見表1。

表1 試驗用飼料組成(風干基礎)

1.3 方法

1.3.1 瘤胃液采集

試驗在晨飼(7∶00)的2 h后收集3頭延邊黃牛瘤胃內容物，使其充分混合后再通過4層及12層紗布進行濾化，將濾液裝于事先通入CO2并且在39 ℃下預熱的滅菌收集瓶中，30 s后迅速分裝在各培養(yǎng)瓶并置于培養(yǎng)箱中進行體外培養(yǎng)前期準備。

1.3.2 人工唾液制備

營養(yǎng)液配置方法參照McDougall的方法[7]。人工唾液制備后，在120 ℃、1 000 kPa下進行全自動高溫滅菌，等到溶液冷卻后用鹽酸調整pH值至6.5。

1.3.3 體外培養(yǎng)液組成

瘤胃液、人工唾液1∶1混合。

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1.3.4 體外培養(yǎng)方法

體外發(fā)酵裝置包括玻璃培養(yǎng)瓶、恒溫培養(yǎng)箱(135 r/min、39 ℃)、注射器以及CO2鋼瓶。首先在玻璃培養(yǎng)瓶中加入底物(1.2 g精料+0.8 g粗料)，然后依次加入瘤胃液(45 mL)、人工唾液(45 mL)，混勻，通入CO2，密封后放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)12 h。

1.4 測定指標

1) pH值 用pH測定儀測定。

2) 氨態(tài)氮的測定 參照Fawcett和Scott(1960)[8]方法用紫外/可見光分光光度計(DU-650)進行測定。

3) VFA(乙酸、丙酸、丁酸)濃度的測定 采用氣相色譜法，以標準已知濃度VFA標準品(Supelco 47058, WSFA-4,USA)制作標準曲線，以三甲基乙酸為內標進行定量分析。具體操作過程為：待測樣品中加入0.2 mL 三甲基乙酸(20 g/L)混合均勻，10 000 r/min離心15 min，取出1 mL上清液置于GC vial中上機分析。氣相色譜分析條件，GC型號：HP5890 GC(美國Hewlett Packard，F(xiàn)ID，配有100孔位自動進樣器)；分析柱型號 ：30 m 長毛細管柱(HP-FFAP 19091F-112，0.32 mm i.d., USA)；氣體載體(氦氣，純度為99.999 9%)流速為50 mL/min，柱溫120 ℃，進樣口與檢測器溫度分別為170 ℃和200 ℃

4) 脂肪酸的測定 培養(yǎng)液內脂肪提取方法：向培養(yǎng)瓶中加入1 mL 內標溶液(C13∶0標準品1 g，用氯仿定容到100 mL)，加入30 mL脂肪提取液(氯仿∶甲醇= 2∶1)，震蕩約3 h；4 ℃離心10 min；溶液分層之后，酯化瓶內移入下層溶液，此操作通過巴氏吸管轉移。

5) 脂肪酸甲基化 將酯化管放入氮吹儀，50 ℃恒溫吹干；在酯化管內加入2 mL BF3，密封；75 ℃水浴1 h，并每隔10 min震蕩1次；冷卻至與室內溫度相同，放入2 mL正己烷，震蕩1 min，靜置30 min；加入飽和氯化鈉4 mL，震蕩1 min后靜置30 min；然后1 500 r/min離心10 min，取上層清液，用于測定。使用安捷倫氣相色譜儀(GC-7890A)測定，配備100 m石英毛細管柱(Supelco SPTM-2560, 0.25 mm i.d.USA)。進樣口溫度240 ℃，檢測器溫度250 ℃；分流比1∶100；柱箱溫度140 ℃，持續(xù)2 min，升溫至240 ℃，升溫速度4 ℃/min，保持40 min。

6) SCD指數(shù)計算 c9C18∶1/C18∶0、c9t11C18∶2/t11C18∶1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用方差分析，不同處理組之間的顯著性分析按照S-N-K`s Test (Steel and Torrie, 1980)線性模型分析。

2 結果與分析

2.1 亞油酸和亞麻酸對pH值、NH3-N (mg/100 mL)濃度和VFA濃度的影響

由表2可以看出,2、6和12 h時,LA組和LNA組的pH值和NH3-N濃度與CON組相比，均無顯著差異(P>0.05)。2 h時，與CON組相比，LA組和LNA組的總揮發(fā)性脂肪酸含量及乙酸、丙酸和丁酸量均無顯著變化(P>0.05)。6 h時，所測得的指標中只有乙酸/丙酸與CON組相比存在顯著性差異(P<0.05)。12 h時，LA組的總揮發(fā)性脂肪酸低于CON組，而LNA組總揮發(fā)性脂肪酸高于CON組，但均無顯著性差異(P>0.05)。CON組乙酸/丙酸低于LA組和LNA組，且差異顯著(P<0.05)。

表2 亞油酸和亞麻酸對pH、NH3-N (mg/100 mL)濃度、VFA濃度的影響

續(xù)表2 亞油酸和亞麻酸對pH、NH3-N (mg/100 mL)濃度、VFA濃度的影響

2.2 亞油酸和亞麻酸對脂肪酸的影響

由表3可知，添加亞油酸和亞麻酸可顯著提高LMUFA、LPUFA和USFA含量(P<0.05)。在2和12 h時，LNA組對提高LMUFA和LPUFA含量效果高于LA組。LA和LNA組SFA含量顯著低于CON組(P<0.05)。2、6和12 h時，LA和LNA組USFA/SFA均顯著高于CON組(P<0.05)，與CON組相比，LA組PUFA/USFA顯著降低(P<0.05)，LNA組顯著升高(P<0.05)。2 h時，LA組的MUFA/USFA顯著高于CON組(P<0.05)，LNA組顯著低于CON組(P<0.05)；6 h時LA和LNA組的MUFA/USFA均顯著高于CON組(P<0.05)；12 h時LA組顯著低于CON組(P<0.05)，LNA組顯著高于CON組(P<0.05)。

表3 亞油酸和亞麻酸對飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸比例的影響

2.3 亞油酸和亞麻酸對ω-3和ω-6脂肪酸的影響

由表4可知，在2、6和12 h時，與CON組相比，LA和LNA組ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸的含量顯著升高(P<0.05)。2和6 h時，ω-3脂肪酸與ω-6脂肪酸的比值在LNA組中最大，且顯著高于CON組和LA組(P<0.05)。12 h時，LA組ω-3脂肪酸與ω-6脂肪酸的比值最大，與CON相比，差異顯著(P<0.05)，與LNA組相比，差異不顯著。

表4 亞油酸和亞麻酸對ω-3和ω-6脂肪酸的影響

2.4 亞油酸和亞麻酸對SCD指數(shù)的影響

由表5可知，在6 h時，LA和LNA組的c9C18∶1/C18∶0均顯著高于CON組(P<0.05)。在2和12 h時,LA和LNA組c9t11C18∶2/t11C18∶1均高于CON組，且差異顯著(P<0.05)。

表5 亞油酸(LA)和亞麻酸(LNA)對SCD指數(shù)的影響

3 討論

瘤胃液pH值可以反映瘤胃發(fā)酵情況，試驗中瘤胃液在經(jīng)過發(fā)酵后，在0～12 h內，pH值隨著時間的增加均呈下降趨勢，亞麻酸(LNA)組pH值下降更明顯，該結果與于伽等[9]研究結果一致。瘤胃中正常pH值的范圍為6～7，pH值降低將會導致瘤胃內微生物多樣性降低，如瘤胃pH值較低導致革蘭氏陰性細菌死亡和溶解[10]。而該試驗在日糧中添加亞油酸(LA)和亞麻酸(LNA)，對照組與試驗組的pH值雖有變化，但總體保持在正常范圍內，pH值相對穩(wěn)定。亞油酸組和亞麻酸組隨著體外培養(yǎng)時間的延長(2、6和12 h)，其pH值呈下降趨勢，這可能與日糧中的精粗比有關[11]。瘤胃中NH3-N的濃度反應微生物對飼料中含氮物質的吸收情況以及微生物對瘤胃中NH3-N的利用效率。NH3-N過多可能代表著飼料能源的浪費，過低則代表瘤胃內微生物的代謝情況不佳。一般情況下，瘤胃內NH3-N濃度在6～30 mg/100 m L之間變化[12]。該試驗中NH3-N濃度的變化范圍均在正常區(qū)域內，亞油酸組與亞麻酸組在2和6 h時，NH3-N濃度均高于對照組，這與張春梅等[13]研結果不一致，這可能與品種間的個體差異及飼料營養(yǎng)配比有關。而在12 h時測得的NH3-N濃度較對照組低，這可能是因為隨著添加亞油酸和亞麻酸時間的延長，瘤胃微生物的活性逐漸增強，利用的NH3-N增多，這與Stefano Schiavon研究中改善肉牛生長的結果一致[14]。楊宏波等研究表明, 瘤胃NH3-N濃度在采食后呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[15]，這與該試驗中NH3-N濃度隨時間的延后而增加的結果不一致，這可能是由日糧配方中粗蛋白含量不同導致的[16]。

瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的比例及其含量反應微生物的發(fā)酵狀況，是瘤胃發(fā)酵的主要產(chǎn)物，為瘤胃微生物蛋白合成提供碳架。丙酸生產(chǎn)的主要途徑是二元(Succinate-propionate)途徑。丙酸生產(chǎn)的第2條途徑是丙烯酸酯途徑。丙酸的增加影響氫氣的代謝，且可能促進與甲烷菌競爭性結合氫氣的細菌生長，從而降低甲烷的排放，這不僅增加了凈能也降低溫室氣體的排放。宋志華等研究表明，添加三丁酸甘油酯能夠提高揮發(fā)性脂肪酸的濃度和纖維素降解酶活性,促進日糧營養(yǎng)成分的降解[17]。該試驗中亞油酸組和亞麻酸組丙酸的含量均高于對照組，且在12 h測定的丙酸含量中差異顯著，乙酸/丙酸數(shù)值在6和12 h，處理組與對照組差異顯著,這與周薇等在α-亞麻酸對瘤胃微生物體外發(fā)酵特性及其生物氫化中間產(chǎn)物的影響研究中結果一致[18]。揮發(fā)性脂肪酸含量的變化說明添加亞油酸和亞麻酸改善了瘤胃環(huán)境，促進了微生物代謝，這與馬雙等研究結果一致[4]。

亞油酸在氫化過程中首先會形成順9、反11-18∶2,進一步由于氫化作用順9、反11-18∶2轉化為反11-18∶1,最終生成硬脂酸。亞油酸變?yōu)橛仓徇@一過程即為亞油酸的氫化作用。趙小偉等研究表明，在亞油酸在加氫過程中，會形成反式C18：1和CLA異構體，只是雙鍵位置有所區(qū)別[19]。該試驗中，LMUFA、LPUFA、USFA均隨著時間增加而減少，可能是由于LA、LNA在氫化的過程中，不飽和脂肪酸通過加氫變?yōu)轱柡椭舅釋е?。SFA隨著時間的推移在各組中逐漸積累也是相同的原因。SFA隨著時間延長均累積增加，但與對照組相比，2個試驗組的SFA含量較低，這可能是由于LNA在加氫的作用下形成了c9,t12-C18∶2、CLA和CLnA，培養(yǎng)液中由于累積了這些，t11-C18∶1在一定程度上被阻止氫化為C18∶0。魏宏陽等在研究中發(fā)現(xiàn)，游離的C18∶2可以阻止t11-C18∶1 及t9-C18∶1完成氫化過程[20]。從而導致C18∶0無法合成，抑制了SFA的生成，進而表現(xiàn)出2個試驗組中SFA含量低于對照組。

亞油酸是ω-6脂肪酸的前體，可轉化為γ-亞麻酸、花生四烯酸等ω-6系列等長鏈多不飽和脂肪酸[21]。ω-3脂肪酸的前體為ALA，可以轉化為DHA和EPA等[22],因此，LA、LNA組的脂肪酸含量高于對照組。而隨著時間的積累，3組中ω-3和ω-6脂肪酸越來越少，可能是因為ω-3多不飽和脂肪酸進入瘤胃后會引起瘤胃的生物氫化作用加強[23]，導致LA、LNA的氫化作用將這2種USFA轉變?yōu)轱柡偷挠仓?。在脂肪酸轉化的過程中，2類脂肪酸都通過向羧基酸增加雙鍵途徑，生成含20和22個碳原子的長鏈脂肪酸[24]。LA轉化為C20∶4，ALA則轉化為EPA和DHA，從而改變ω-3、ω-6脂肪酸的結構。添加LA、LNA增加了ω-3和ω-6脂肪酸的母體物質，進而影響氫化反應和代謝途徑，改變脂肪酸的碳鏈長度以及飽和程度，從而導致ω-3、ω-6脂肪酸結構發(fā)生各種變化。

SCD酶的活性在飽和脂肪酸的影響下可以提高，而PUFA則相反，會抑制SCD的表達。由此可見，SCD的活性和表達情況受脂肪酸的種類以及雙鍵數(shù)目調控。研究表明，分別給大鼠飼喂α-亞麻酸和缺乏ω-3脂肪酸的日糧后，發(fā)現(xiàn)缺乏ω-3脂肪酸組的大鼠肝臟中SCD的影響能力提高，ω-3脂肪酸對去飽和酶有抑制作用[25]，且高劑量的ω-3脂肪酸對去飽和酶的抑制作用明顯[26]。該試驗中加入亞油酸、亞麻酸之后飽和脂肪酸的含量降低，LMUFA的含量升高，進而使試驗組的c9C18∶1/C18∶0比值高于對照組。SCD能夠將C18∶0轉化為C18∶1，但是隨時間推移，試驗組的c9C18∶1/C18∶0升高趨勢減緩，這可能是因為隨時間積累，亞油酸和亞麻酸由于氫化作用產(chǎn)生大量多不飽和脂肪酸積累在培養(yǎng)液內，抑制了SCD的表達。同時，由于氫化作用使得c9t11C18∶2升高，而SCD在MUFA合成中具有重要的生理作用，LA、LNA抑制SCD基因mRNA的轉錄，使該酶的活性降低進而降低了MUFA的比例。Jeffcoat等[27]報道，小鼠日常飼料中添加6.0%的亞油酸使得肝臟中SCD活性降低了60%，并認為該酶活性的改變主要是由于亞油酸抑制了SCD基因的表達，這與該試驗結果一致。

4 結論

添加60 mg/100 mL亞油酸或亞麻酸可以降低瘤胃液pH值，增加USFA的含量，降低SFA的含量，2和6 h時，顯著提高NH3-N的質量濃度，12 h時，使丙酸含量顯著提高，6和12 h時，C2/C3顯著降低。對LMUFA、ω-3脂肪酸等脂肪酸的含量及比例產(chǎn)生改變，從而改變瘤胃內的發(fā)酵模式。綜上所述，十八碳多不飽和脂肪酸對延邊黃牛瘤胃發(fā)酵有一定影響。