放牧藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs與 SGLT1基因表達(dá)特征關(guān)聯(lián)分析

魏 紅,沙玉柱,史 浩,呂衛(wèi)兵,羅玉柱,王繼卿,李少斌,胡 江,劉 秀

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

藏綿羊是青藏高原最古老的綿羊品種，與蒙古羊、哈薩克羊并稱為中國三大粗毛羊品種，繁育在海拔3 000 m以上的青藏高原地區(qū)。藏綿羊?qū)η嗖馗咴母吆脱醐h(huán)境具有良好的適應(yīng)性，不但能夠在嚴(yán)酷的自然環(huán)境中健康生長和繁育，還能夠給當(dāng)?shù)啬撩裉峁┤?、毛、燃料等生產(chǎn)和生活必須品，是當(dāng)?shù)啬撩窠?jīng)濟(jì)收入的主要來源，也是青藏高原重要的家畜品種和種質(zhì)資源。全年放牧是藏綿羊千百年來形成的傳統(tǒng)，盡管“暖牧冷飼”的飼養(yǎng)模式逐漸被牧民接受，但大多數(shù)地區(qū)還是以全年放牧為主，采食天然牧草是放牧藏綿羊獲取食物的主要來源，在漫長的冷季(10月-翌年4月)，藏綿羊只能通過啃食枯草來獲取營養(yǎng)物質(zhì)以滿足自身營養(yǎng)需要。面對青藏高原暖、冷季飼草供給存在的嚴(yán)重不均衡，藏綿羊如何應(yīng)對暖、冷季營養(yǎng)供給的巨大變化及冷季營養(yǎng)脅迫，解析這一科學(xué)問題是藏綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求。

碳水化合物(Carbohydrate，CHOs)可被唾液和胰腺分泌的淀粉酶以及存在于腸上皮刷狀緣膜中的寡糖、二糖和三糖酶分解[4]，生成的單糖(葡萄糖、半乳糖和果糖)被腸道吸收，為機(jī)體提供能量。腸上皮組織的葡萄糖吸收方式有兩種，分別是鈉依賴葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體(SGLT1-Sodium glucose cotransporter)進(jìn)行的主動轉(zhuǎn)運(yùn)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glucose transporters，GLUTs)進(jìn)行的易化擴(kuò)散。其中，鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLTs-Sodium glucose cotransporters)是小腸上皮細(xì)胞上攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的主要載體，除小腸上皮細(xì)胞吸收葡萄糖外，瘤胃上皮細(xì)胞也能吸收部分葡萄糖[5]。表明瘤胃內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)不僅被微生物降解為VFAs吸收，還有部分葡萄糖通過SGLT1基因被瘤胃上皮吸收，但暖、冷季藏綿羊瘤胃、小腸、大腸組織SGLT1基因的表達(dá)情況未見報(bào)道。

綜上所述，基于VFAs與SGLT1基因?qū)Ψ雌c動物進(jìn)行能量輸送和調(diào)控中所發(fā)揮的重要作用，本研究以瘤胃上皮SGLT1基因表達(dá)與VFAs間的相關(guān)性研究為切入點(diǎn)，以期得到它們之間的相互聯(lián)系。從而為藏綿羊應(yīng)對暖、冷季營養(yǎng)供給嚴(yán)重不均衡以及冷季營養(yǎng)脅迫提供基礎(chǔ)，也為藏綿羊種質(zhì)資源保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與樣品采集

在甘肅省甘南藏族自治州合作市佐蓋曼瑪鄉(xiāng)(海拔3 300 m)同一牧戶羊群選取1周歲(±1月齡)、身體健康、體質(zhì)量相近(≤2 kg)、自然放牧狀態(tài)、沒有進(jìn)行任何補(bǔ)飼的藏綿羊母羊12只。分別于7月中旬(2019年7月15日，代表暖季)和12月中旬(2019年12月15日，代表冷季)各采集6只藏綿羊瘤胃液以及組織樣。

瘤胃液采集：試驗(yàn)羊只歸牧后，在次日早晨測量體質(zhì)量，利用羊用胃管式瘤胃采樣器采集瘤胃液，每只羊采集2管，并將樣品立刻放入準(zhǔn)備好的液氮罐中進(jìn)行冷凍保存，帶回實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行 -80 ℃保存。

組織樣采集：每個時期分別屠宰6只藏綿羊進(jìn)行腸道內(nèi)容物及組織樣品的采集。采用頸靜脈放血屠宰，立即取瘤胃、小腸(十二指腸)、大腸(盲腸)組織樣，將其分離出來，再用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水和PBS緩沖液將瘤胃、大腸、小腸的各個部位沖洗干凈，用吸水紙把樣品吸干，然后再分別取瘤胃、大腸、小腸部位樣各2 cm左右，放到 1.5 mL離心管中，然后將樣品立刻放入到準(zhǔn)備好的液氮罐中進(jìn)行冷凍保存，帶回實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行 -80 ℃保存，以供后續(xù)分析。

1.2 VFAs測定

采用日本島津(GC-2010 plus)氣相色譜儀測定藏綿羊瘤胃VFAs，內(nèi)標(biāo)為2-乙基丁酸(2EB)，色譜柱為AT-FFAP(50 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱。色譜柱升溫程序：溫度60 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至115 ℃，不保留，再以15 ℃/min升至180 ℃，檢測器溫度260 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

1.3 總RNA提取和胃腸道組織cDNA合成

利用Trizol一步抽提法提取藏綿羊瘤胃、小腸、大腸組織總RNA，測定總RNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，全部樣品的吸收比(A260/A280)在1.8～2.1。使用含有 gDNA Wiper酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 設(shè)計(jì)與合成引物

從NCBI中搜索出綿羊SGLT1基因的 mRNA序列(GenBank No：NM_000343.4)，利用Premier 5.0設(shè)計(jì)SGLT1基因擴(kuò)增引物，引物信息(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 SGLT1基因Real-time PCR擴(kuò)增

以β-Actin為內(nèi)參基因，利用實(shí)時熒光定量PCR儀(QuantStudioTM6 Flex,ABI,美國)進(jìn)行SGLT1基因及內(nèi)參基因熒光定量，反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性30 s；循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；每次循環(huán)的最后一步收集SYBR green熒光信號，溶解曲線(95 ℃ 15s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15s)。反應(yīng)體系：20 μL體系，含有2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix， cDNA模板和上下游引物。以β-Actin為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。VFAs含量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，SGLT1基因表達(dá)量，以β-Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT的方法計(jì)算相對表達(dá)量。瘤胃VFAs與SGLT1基因組織表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs測定結(jié)果

藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs測定結(jié)果顯示(表2)，藏綿羊瘤胃在冷季的總VFA含量顯著高于暖季(P<0.05)，除丁酸外，其他VFA含量在暖、冷季均差異顯著(P<0.05)。冷季的乙酸、丙酸含量均顯著高于暖季(P<0.05)，異丁酸、異戊酸、戊酸的含量為暖季顯著高于冷季(P<0.05)，丁酸在暖、冷季差異不顯著(P>0.05)。另外，冷季乙酸/丙酸(A/P)值顯著高于暖季(P<0.05)。

表2 藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs含量測定結(jié)果Table 2 Determination of VFAs concentration in rumen of Tibetan sheep in warm and cold seasons

2.2 藏綿羊暖、冷季胃腸道 SGLT1基因表達(dá)特征

通過對藏綿羊暖、冷季胃腸道組織(瘤胃、小腸、大腸)SGLT1基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)(圖1)，藏綿羊暖、冷季胃腸道組織的SGLT1基因表達(dá)存在顯著性差異(P<0.05)。其中，暖季的瘤胃、小腸、大腸組織的SGLT1基因表達(dá)量顯著高于冷季(P<0.05)，同一季節(jié)不同腸道組織的SGLT1基因表達(dá)也存在一定差異，表現(xiàn)為：小腸組織>瘤胃組織>大腸組織。藏綿羊小腸組織的SGLT1基因表達(dá)量顯著高于瘤胃和大腸組織(P<0.05)，在暖、冷季無差異。其中，暖季比冷季小腸組織的表達(dá)量高出1.8倍。

2.3 藏綿羊瘤胃VFAs與 SGLT1基因之間相關(guān)性分析

藏綿羊瘤胃VFAs和SGLT1基因之間存在一定的相關(guān)性(表3)，其中，乙酸、丙酸與SGLT1基因呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)均大于0.9；異丁酸、異戊酸、戊酸與SGLT1基因呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)均在0.98以上。另外，6種VFA之間也存在一定的相關(guān)性，除丁酸外，其他VFA之間的相關(guān)性均差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs含量分布特征

VFAs既是碳水化合物在瘤胃中的終產(chǎn)物，也是瘤胃微生物生長所需的重要碳架和能量來源，能夠維持正常的瘤胃內(nèi)環(huán)境[6]。瘤胃VFAs含量和組成受日糧、飼料加工處理、瘤胃微生物、瘤胃PH等因素的影響[7]。在本研究中，藏綿羊在冷季的VFAs含量顯著高于暖季(P<0.05)，其中，冷季的乙酸和丙酸的含量顯著高于暖季 (P<0.05)，可能是由于暖季飼草料豐富、營養(yǎng)價值高，為瘤胃微生物生長提供了充足養(yǎng)分，為產(chǎn)甲烷菌生長增殖提供了充足氮源。瘤胃內(nèi)纖維分解菌生長增殖快，纖維分解效果大大提高，為產(chǎn)甲烷菌的生長增殖提供了充足的氫源，產(chǎn)甲烷菌與產(chǎn)乙酸菌競爭氫生成甲烷或乙酸[8]。反芻動物主要的排氫途徑是在瘤胃內(nèi)生成甲烷。因此，暖季瘤胃內(nèi)甲烷含量高，導(dǎo)致乙酸含量降低。Fonty等[9]研究發(fā)現(xiàn)，有產(chǎn)甲烷菌的羔羊氫利用能力高達(dá)90%以上，無產(chǎn)甲烷菌時羔羊的氫利用能力降低，僅為28%～46%。在正常生長的羔羊瘤胃發(fā)酵過程中，乙酸的產(chǎn)生僅占一小部分，但在無產(chǎn)甲烷菌時則占瘤胃發(fā)酵的21%～25%[10]。由于冷季飼草養(yǎng)分質(zhì)量低，產(chǎn)甲烷菌不能獲得足夠的養(yǎng)分，限制產(chǎn)甲烷菌的生長繁殖，因而冷季產(chǎn)甲烷菌數(shù)量明顯低于其他季節(jié)[11]，以致冷季的乙酸含量高于暖季。另外，異丁酸、異戊酸、戊酸的含量為暖季顯著高于冷季(P<0.05)，主要是因?yàn)閂FAs中異丁酸和異戊酸是由蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的[12]。藏綿羊在暖季可以采食能量和蛋白質(zhì)含量較高的牧草，瘤胃中可利用碳水化合物充足，氨利用率高，蛋白質(zhì)合成強(qiáng)度大，從而導(dǎo)致異丁酸、異戊酸等暖季含量大于冷季。研究發(fā)現(xiàn)，不管是冷季還是暖季，乙酸的含量都較高，約占VFA總產(chǎn)量的70%～75%[13]，主要是因?yàn)橐宜崾欠雌c動物新陳代謝的主要能量來源。同時，乙酸通過葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑代謝和葡萄糖存在依賴關(guān)系[14]。丙酸是唯一生成葡萄糖的VFA，是肝臟組織中糖異生的重要葡萄糖前體，在經(jīng)瘤網(wǎng)胃壁吸收過程中為肌肉組織提供能量[15]。冷季的A/P值顯著高于暖季(P<0.05)，且A/P值均在 1～3，從能量利用的角度看，A/P比值越低，對飼料能量利用效率越高，放牧藏綿羊冷季的A/P值高于暖季，說明放牧藏綿羊?qū)ζ淠敛莸睦眯瘦^高。綜上所述，藏綿羊?yàn)閼?yīng)對冷季營養(yǎng)物質(zhì)嚴(yán)重匱乏，進(jìn)化出了較強(qiáng)的能量適應(yīng)機(jī)制。

3.2 藏綿羊暖、冷季胃腸道 SGLT1基因表達(dá) 特征

致使暖季SGLT1基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于冷季的原因較多[16-17]，如季節(jié)、日糧、饑餓狀況、Na+攝入水平、激素水平、炎癥、應(yīng)激、腸黏膜上皮細(xì)胞沿腸絨毛軸的分化及其細(xì)胞周期等[18]。本研究中，小腸組織中的SGLT1基因表達(dá)量均顯著高于瘤胃和大腸組織(P<0.05)，小腸上皮細(xì)胞上攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的主要載體是SGLTs，介導(dǎo)腎臟和腸道中葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，所以小腸的SGLT1基因表達(dá)量較高。藏綿羊暖季瘤胃、小腸、大腸組織的SGLT1基因表達(dá)量顯著高于冷季(P< 0.05)，這可能與全年放牧有關(guān)，由于冷季飼草匱乏，個體之間存在更激烈的覓食競爭，導(dǎo)致個體在獲取飼料資源方面存在更大的差異。隨著暖季食物可得性的增加，個體采食競爭減小、飼草料豐富且營養(yǎng)價值較高[19]，以及暖季牧草中的含糖量顯著高于冷季[20-21]。景小平等[22]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胃腸道里面的葡萄糖含量慢慢增加時，SGLT1基因也在增加，進(jìn)而可以讓胃腸道對葡萄糖的吸收效率得到較大的提高，且葡萄糖含量越高，SGLT1基因的活性和效率越高，所以，暖季胃腸道SGLT1基因表達(dá)量高于冷季。另外，盧垚等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，在漫長的冷季，由于寒冷的氣候，藏綿羊發(fā)生炎癥的幾率增大，受到的應(yīng)激變大，所以冷季SGLT1基因表達(dá)量較低。王修啟等[23]、倫志國[24]研究表明，由于過瘤胃葡萄糖的作用，導(dǎo)致瘤胃中的葡萄糖以某種方式保護(hù)起來，使其在反芻家畜瘤胃內(nèi)不易被降解，而直接進(jìn)入瘤胃后消化系統(tǒng)(主要是小腸)進(jìn)行消化、吸收和利用，所以導(dǎo)致小腸的SGLT1基因表達(dá)量最高。但本研究主要針對暖、冷季的瘤胃SGLT1基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析，雖說瘤胃中大部分葡萄糖直接進(jìn)入后消化系統(tǒng)進(jìn)行消化吸收或者直接被發(fā)酵為VFAs，但是，在暖季牧草量充足的情況下，瘤胃組織直接將多余的葡萄糖通過SGLT1蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液，節(jié)約了發(fā)酵所需的能量[25]。此外，暖季瘤胃SGLT1基因表達(dá)量顯著高于大腸組織(P<0.05)。瘤胃中的SGLT1基因吸收葡萄糖，降低反芻動物前胃葡萄糖濃度，可改善或預(yù)防反芻動物乳酸酸中毒。有研究認(rèn)為[26]，反芻動物對碳水化合物的消化吸收主要是由其在瘤胃中轉(zhuǎn)化為VFAs的轉(zhuǎn)化效率來決定的，趙小剛等[27]研究證實(shí)，瘤胃上皮SGLT1基因的轉(zhuǎn)錄和功能性表達(dá)水平對反芻動物利用葡萄糖也具有很大的影響。因此，對研究胃腸道葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控具有重要意義。

3.3 藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs與 SGLT1基因之間的相關(guān)性

進(jìn)一步評估VFAs與SGLT1基因表達(dá)之間的相關(guān)性，可以發(fā)現(xiàn)乙酸、丙酸與SGLT1基因呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)均大于 0.9，異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸與瘤胃上皮的SGLT1基因之間呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)。如前所述，在反芻動物中，日糧的碳水化合物發(fā)酵成VFAs主要由瘤胃微生物發(fā)酵，通過瘤胃上皮吸收，在肝臟中被用于糖異生來為動物提供能量，部分瘤胃沒有發(fā)酵消化的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物、葡萄糖及與微生物相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以經(jīng)SGLT1基因介導(dǎo)直接被瘤胃上皮吸收進(jìn)入血液中，在血液中供機(jī)體使用，剩余的蛋白質(zhì)被小腸再次吸收，在小腸消化酶的作用下，進(jìn)一步變?yōu)樾‰?、氨基酸和單糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體[28]。因此，到達(dá)小腸的單糖量減少，隨著到達(dá)小腸的單糖含量降低，小腸的SGLT1基因含量和mRNA水平均顯著降低，表明VFAs與SGLT1基因之間存在著一定的關(guān)聯(lián)。有研究表明[5]，營養(yǎng)物質(zhì)不僅僅以VFAs的形式被瘤胃上皮吸收，還有部分葡萄糖直接被瘤胃上皮SGLT1基因介導(dǎo)吸收進(jìn)入血液；此外，反芻動物體內(nèi)葡萄糖相對于VFAs的能量值遠(yuǎn)高于單胃動物，這是因?yàn)榉雌c動物幾乎完全依賴葡萄糖糖異生來滿足其對葡萄糖的需求[29]。通過SGLT1基因直接攝取葡萄糖可以減少動物糖異生的代謝消耗[30]。在漫長的冷季，飼草料嚴(yán)重匱乏，藏綿羊通過高產(chǎn)量的VFAs以維持自身新陳代謝和提供能量。并且在SGLT1基因的作用下，有效調(diào)節(jié)了胃腸道內(nèi)葡萄糖含量的波動。因此，探討藏綿羊暖、冷季瘤胃VFAs與SGLT1基因的相互調(diào)控作用，從而為藏綿羊應(yīng)對暖、冷季營養(yǎng)供給嚴(yán)重不均衡以及冷季營養(yǎng)脅迫提供基礎(chǔ)，也為藏綿羊種質(zhì)資源保護(hù)提供 參考。

4 結(jié) 論

放牧藏綿羊瘤胃中的VFAs含量在冷季顯著高于暖季(P<0.05)。除丁酸外，其他VFA在暖、冷季均存在顯著性差異(P<0.05)。對放牧藏綿羊瘤胃、大腸、小腸SGLT1基因的表達(dá)量測定發(fā)現(xiàn)，藏綿羊暖季的瘤胃、大腸和小腸SGLT1基因的表達(dá)量顯著高于冷季(P<0.05)，在暖、冷相同的季節(jié)中小腸組織的SGLT1的基因表達(dá)量最高。對藏綿羊瘤胃VFAs與SGLT1基因表達(dá)間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，乙酸、丙酸與SGLT1基因表達(dá)呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05)，異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸與瘤胃上皮的SGLT1基因之間呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)。