黃土高原雨養(yǎng)區(qū)不同種植年限紫花苜蓿土壤真菌群落的分布特征

馬 欣，羅珠珠，張耀全，牛伊寧，李玲玲，蔡立群，蔡雪梅，劉家鶴

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 延安 716000)

紫花苜蓿(Medicagosativa)有著高產(chǎn)、耐瘠、保土等優(yōu)良特性，在西部黃土高原地區(qū)廣泛種植，是當(dāng)?shù)赝烁€林的主要草種[1]，亦是糧改飼、發(fā)展草牧業(yè)的優(yōu)質(zhì)牧草，種植苜?？纱龠M(jìn)當(dāng)?shù)夭菔承竽翗I(yè)健康發(fā)展[2]。苜蓿根瘤可在根瘤菌的作用下固定游離氮，地上部枯枝落葉可經(jīng)微生物分解增加土壤有機(jī)碳含量，改善土壤質(zhì)量[3]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，可調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和系統(tǒng)的穩(wěn)定性，提高其抗干擾能力[4]。一般情況下，多年生植物通過(guò)根系分泌物對(duì)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和分布產(chǎn)生影響，從而改變微生物的豐富度和多樣性[5]。紫花苜蓿屬于軸根型牧草，根系發(fā)達(dá)，多年種植紫花苜蓿會(huì)導(dǎo)致土壤容重減小、深層水分虧缺，土壤質(zhì)量及牧草品質(zhì)逐步退化[6-7]，亦會(huì)對(duì)土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。

真菌是土壤微生物中數(shù)量最多的類群之一[8]，可通過(guò)參與土壤中碳素轉(zhuǎn)化、物質(zhì)循環(huán)影響腐殖質(zhì)的形成，穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)[9]，是維持生態(tài)系統(tǒng)功能的基礎(chǔ)和生態(tài)系統(tǒng)健康的指示物[10]。Yang[11]、錢雅麗[12]等對(duì)黃土高原半干旱區(qū)不同土地利用類型真菌群落的研究發(fā)現(xiàn)種植紫花苜蓿有利于土壤真菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而提高真菌豐富度和多樣性，特別是通過(guò)影響土壤顆粒機(jī)械組成、養(yǎng)分含量、pH，進(jìn)而影響土壤子囊菌和擔(dān)子菌等優(yōu)勢(shì)菌群的分布格局[13]。研究表明，連作抑制土壤中細(xì)菌及固氮菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)真菌群落的繁殖，導(dǎo)致土壤由高肥力‘細(xì)菌型’向低肥力‘真菌型’轉(zhuǎn)換[14-15]。耿德洲[16]等在寧南黃土高原的研究表明,隨著苜蓿種植年限的增加真菌群落多樣性降低，群落組成從農(nóng)田逐漸向天然草地方向演變。麻冬梅[6]在寧南山區(qū)的研究表明，不同種植年限苜蓿地土壤微生物群落均以細(xì)菌為主，其豐度隨苜蓿種植年限的增加而增加，真菌的變化趨勢(shì)則不明顯，數(shù)量一直在0.10～0.14萬(wàn)個(gè)·g-1范圍徘徊；邰繼承[17]對(duì)內(nèi)蒙古灰色草甸土的研究發(fā)現(xiàn)，種植苜蓿能夠有效促進(jìn)微生物群落的發(fā)展，種植5 a的紫花苜蓿土壤細(xì)菌數(shù)量是種植2 a苜蓿地細(xì)菌數(shù)量的1.86倍，但真菌數(shù)量無(wú)明顯變化。

目前，研究黃土高原雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)紫花苜蓿的研究多集中在水分利用效率[18-19]、土壤理化性質(zhì)[20-21]以及溫室氣體排放[22-23]等方面，對(duì)于土壤微生物群落的研究較少。而研究土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性可為農(nóng)田土壤的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。因此，本研究以農(nóng)田為對(duì)照，通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序研究黃土高原地區(qū)不同種植年限苜蓿土壤真菌群落組成及多樣性特征，以探明不同種植年限苜蓿土壤真菌群落演變規(guī)律及優(yōu)勢(shì)菌屬分布特征。研究結(jié)果在理論上有助于從分子生物學(xué)角度揭示苜蓿種植年限對(duì)土壤真菌群落特征的影響，在實(shí)踐上可為區(qū)域苜蓿適宜種植年限的選擇提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)設(shè)在甘肅省定西市安定區(qū)李家堡鎮(zhèn)的甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)旱作農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)站(104°44′E，35°28′N)進(jìn)行，該區(qū)屬于典型的黃土高原半干旱雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，平均海拔約為2 000 m，年均太陽(yáng)輻射592.9 kJ·cm-2，平均日照時(shí)數(shù)2 476.6 h，年均氣溫6.4℃，0～10℃積溫范圍為2 239.1～2 933.5℃，無(wú)霜期為141 d，年均降雨量400 mm，年蒸發(fā)量1 531 mm，干燥度2.53。土壤類型為黃綿土，土壤容重1.19 g·cm-3，pH 值8.36，土壤有機(jī)質(zhì)12.01 g·kg-1，全氮0.76 g·kg-1，全磷0.79 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以玉米田為對(duì)照，2003年(L2003)、2005年(L2005)、2012年(L2012)建植的紫花苜蓿人工草地為研究對(duì)象，小區(qū)面積均為3 m×7 m=21 m2，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)。苜蓿品種為當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)品種隴東苜蓿，整個(gè)生育期無(wú)人為干預(yù)，各處理田間管理保持一致，每年刈割兩次(6月和10月)。苜蓿人工草地在2003、2005和2012年建植時(shí)施純氮105 kg·hm-2，純P2O5105 kg·hm-2，之后在苜蓿生長(zhǎng)期間未進(jìn)行施肥、灌水。玉米品種為‘先玉335’，2013年開始種植玉米，持續(xù)至今，每年播前人工撒施純N 200 kg·hm-2，純P2O5105 kg·hm-2，生育期不再追肥，收獲后期玉米根系不還田。

1.3 土樣采集

在每個(gè)采樣小區(qū)中，于2018年苜蓿頭茬花期按照五點(diǎn)采樣法用土鉆采集0～30 cm和30～60 cm土層土壤樣品，去除樣品中的植物根系、石塊等雜物混合均勻后過(guò)2 mm篩，裝入滅菌自封袋，干冰保存，帶回實(shí)驗(yàn)室置于超低溫冰箱中用于土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的測(cè)定。

1.4 真菌ITS高通量測(cè)序

將用于測(cè)定的土樣送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行真菌 ITS 高通量測(cè)序，引物如表1所示。從土壤樣品中抽提基因組DNA后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA，然后對(duì)樣品的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(ABI GeneAmp? 9700型，Thermo Fisher Scientific，USA)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司,USA)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫, 2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM～ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司,USA)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，隨后構(gòu)建Miseq文庫(kù)，用Illumina平臺(tái)Miseq 300測(cè)序儀測(cè)序[24-25]。

表1 目標(biāo)基因的引物名稱及引物序列

1.5 Alpha多樣性指數(shù)計(jì)算方法

微生物α多樣性[26]：

式中，Chao1表示菌群豐度；Sobs為實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)；n1為只含有一條序列的OTU數(shù)目；n2為只含有兩條序列的OTU數(shù)目。

Simpson和Shannon代表微生物多樣性：

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Mothur指數(shù)分析，基于指數(shù)評(píng)估的OTU相似水平97%得出土壤真菌Alpha多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)、菌群豐富度指數(shù)(Chao1)。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性指數(shù)均采用SPSS 22.0和Excel數(shù)據(jù)處理軟件，差異顯著性分析利用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較法(Duncan)。維恩圖(Venn)通過(guò)I-Sanger云平臺(tái)(美吉公司，上海)進(jìn)行處理，主成分分析使用Canoco 5，AI軟件進(jìn)行圖表修飾。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤真菌群落OTU特異性分析

通過(guò)對(duì)不同種植年限土壤樣品中真菌群落Venn圖(圖1)的比較分析發(fā)現(xiàn)，隨種植年限增加，耕層0～30 cm苜蓿土壤真菌群落物種數(shù)在增加，L2003、L2005、L2012分別獲得OTUs 731、746、691個(gè)，農(nóng)田獲得OTUs 752個(gè)，各處理特有物種分別為108、125、116和216，占各處理物種總數(shù)的14.77%、16.76%、16.79%%和28.72%；共有物種OTUs 303個(gè)，占物種總數(shù)量的10.38%。L2003和L2005共有物種數(shù)(506)，高于L2003和L2012(468)、L2005和L2012(474)物種共有數(shù)。30～60 cm土層中L2003、L2005、L2012和農(nóng)田分別獲得OTUs 678、675、631、697個(gè)，共有275個(gè)，占物種總數(shù)的10.26%；L2003特有OTUs 114個(gè)，L2005特有OTUs 139個(gè)，L2012特有OTUs 95個(gè)，農(nóng)田特有OTUs 186個(gè)。這表明隨苜蓿種植年限延長(zhǎng)土壤真菌物種數(shù)增加，但不同種植年限苜蓿土壤真菌特有物種數(shù)均少于農(nóng)田土壤。

2.2 土壤真菌群落 Alpha多樣性

Miseq高通量測(cè)序結(jié)果優(yōu)化后共獲得389693條有效序列，對(duì)所有樣品進(jìn)行抽平得到38560條序列后進(jìn)行后續(xù)分析。由表2看出，樣品測(cè)序覆蓋度均在0.99以上，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，基本能真實(shí)反映土壤微生物的群落組成。與農(nóng)田相比，耕層0～30 cm種植苜蓿對(duì)Shannon指數(shù)無(wú)明顯影響，但其隨著苜蓿種植年限的延長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)，表現(xiàn)為L(zhǎng)2003和L2005處理顯著高于L2012，分別增加18.47%和21.34%。Chao1和Simpson指數(shù)在農(nóng)田和不同種植年限苜蓿間均無(wú)顯著差異。耕層以下30～60 cm土壤剖面真菌群落的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)隨著種植年限的變化呈現(xiàn)出與耕層0～30 cm類似的趨勢(shì)，但處理間均無(wú)顯著差異。

表2 不同處理真菌Alpha多樣性指數(shù)

2.3 門水平土壤真菌群落組成特征

本研究所有供試黃綿土樣品中共檢測(cè)到真菌6門24綱73目156科313屬，土壤真菌群落門水平主要包括4個(gè)類群(圖2)，占真菌總數(shù)的99%以上，分別為：子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和unclassified_k__Fungi。黃綿土子囊菌門相對(duì)豐度隨土層深度增加而降低，接合菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度則表現(xiàn)為相反趨勢(shì)。

與農(nóng)田相比，耕層0～30 cm苜蓿土壤子囊菌門相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)，且隨苜蓿種植年限延長(zhǎng)先降低后升高，不同種植年限苜蓿土壤比農(nóng)田土壤提高17.50%～32.08%。接合菌門、擔(dān)子菌門和unclassified_k__Fungi相對(duì)豐度表現(xiàn)為苜蓿土壤顯著低于農(nóng)田土壤(P<0.05)，且隨種植年限延長(zhǎng)先升高后降低。其中接合菌門相對(duì)豐度降低62.36%～73.54%，擔(dān)子菌門豐度降低60.08%～78.84%，unclassified_k__Fungi相對(duì)豐度降低8.16%～55.05%。不同種植年限苜蓿土壤優(yōu)勢(shì)門豐度亦存在差異，L2003子囊菌門相對(duì)豐度顯著高于L2005處理12.42%(P<0.05)，接合菌門相對(duì)豐度顯著低于L2005處理153.54%(P<0.05)。耕層以下30～60 cm真菌優(yōu)勢(shì)門群落相對(duì)豐度隨著苜蓿種植年限的變化呈現(xiàn)出與耕層0～30 cm類似的趨勢(shì)。農(nóng)田土壤子囊菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度顯著高于苜蓿土壤(P<0.05)；接合菌門相對(duì)豐度表現(xiàn)出農(nóng)田和L2005處理顯著高于L2003和L2012處理(P<0.05)；unclassified_k__Fungi相對(duì)豐度在農(nóng)田和不同種植年限苜蓿土壤間無(wú)明顯差異。

2.4 屬水平土壤真菌群落組成特征

土壤真菌在屬水平種類繁雜，各個(gè)門科下屬分類地位不明確的菌屬占總序列的10.98%～32.71%，耕層0～30 cm土壤真菌相對(duì)豐度>1%的菌屬分布見圖3。農(nóng)田土壤前3種優(yōu)勢(shì)真菌屬分別為被孢霉屬(Mortierella，19.63%)、綠僵菌屬(Metarhizium，13.67%)和腐質(zhì)霉屬(Humicola，11.63%)，且表現(xiàn)為農(nóng)田土壤顯著高于苜蓿土壤(P<0.05)，其中被孢霉屬相對(duì)豐度提高62.38%～73.48%，綠僵菌屬豐度提高64.83%～85.55%，腐質(zhì)霉屬豐度提高88.43%～93.53%。苜蓿土壤共有優(yōu)勢(shì)真菌屬為刺孢屬(Phaeomycocentrospora, 10.49%～29.54%)、白僵菌屬(Beauveria，10.10%～13.02%)、被孢霉屬(5.21%～13.19%)和綠僵菌屬(1.98%～4.81%)。隨苜蓿種植時(shí)間延長(zhǎng)，刺孢屬、赤霉菌屬(Gibberella)相對(duì)豐度呈先降低后升高趨勢(shì)，被孢霉屬、Tetracladium屬和隱球菌屬相對(duì)豐度呈相反趨勢(shì)先升高后降低，白僵菌屬、綠僵菌屬和Lectera屬相對(duì)豐度逐漸升高。

30～60 cm土層，農(nóng)田土壤優(yōu)勢(shì)屬為被孢霉屬(32.45%)，相對(duì)豐度顯著高于苜蓿土壤28.11%～80.75%(P<0.05)(圖4)。刺孢屬(7.94%～17.95%)和被孢霉屬(6.25%～23.33%)為苜蓿土壤共有優(yōu)勢(shì)菌屬。隨苜蓿種植時(shí)間延長(zhǎng)，刺孢屬、被孢霉屬和Tetracladium屬相對(duì)豐度呈先升高后降低趨勢(shì)，白僵菌屬、綠僵菌屬、土赤殼屬和叢赤殼屬(Nectria)相對(duì)豐度呈先降低后升高趨勢(shì)，而鐮刀菌屬相對(duì)豐度顯著增加。統(tǒng)計(jì)分析表明，L2012刺孢屬相對(duì)豐度顯著低于L2003和L2005(P<0.05)，降低45.95%和555.77%；L2012處理白僵菌屬和綠僵菌屬相對(duì)豐度顯著高于其余處理(P<0.05)，增加84.73%～98.28%和51.22%～92.82%；L2003鐮刀菌屬相對(duì)豐度顯著高于L2005和L2012處理54.00%和64.04%(P<0.05)。

2.5 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析

主成分分析(圖5)表明，不同種植年限苜蓿土壤真菌屬在PC1軸和PC2軸上解釋度分別為66.90%和17.13%，農(nóng)田和苜蓿草地土壤真菌群落顯著分開。農(nóng)田土壤真菌群落主要分布在第一、四象限，苜蓿土壤真菌群落主要分布在第二、三象限。載荷因子反映真菌屬水平豐度與所提取主成分之間的相關(guān)性，載荷因子絕對(duì)值越高，表示該真菌屬對(duì)主成分的影響越大[27]。表3結(jié)果表明，叢赤殼屬、土赤殼屬和鐮刀菌屬與第一主成分(PC1)具有較高的相關(guān)性，Lectera菌屬、支頂孢屬和赤霉菌屬與第二主成分具有較高相關(guān)性，而這6類菌屬均屬子囊菌門肉座菌目類植物病原菌。與第一、二主成分相關(guān)的菌屬均與植物病害相關(guān)，說(shuō)明長(zhǎng)期種植苜蓿引起相關(guān)病原菌累積。

表3 真菌屬水平豐度的主成分載荷因子Table 3 Component loading factor of soil fungalgenera in relative abundance

3 討 論

3.1 苜蓿種植對(duì)黃綿土真菌多樣性的影響

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性的增加能夠改變土壤微生態(tài)的穩(wěn)定性，其在一定程度上可反映土壤健康狀況[28]。真菌參與土壤有機(jī)物質(zhì)分解，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的一部分[29]。趙彤等[30]對(duì)寧南山區(qū)不同植被類型土壤微生物群落進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，苜蓿人工草地能夠顯著改善土壤微生物多樣性，這主要是因?yàn)椴煌魑锔捣置谖锎嬖诋愘|(zhì)性，釋放根系分泌物(氨基酸、分泌酶、粘液和細(xì)胞裂解物)會(huì)影響微生物多樣性，且凋落物經(jīng)分解后釋放的有機(jī)物質(zhì)成分和數(shù)量亦使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性發(fā)生不同程度的變化[31-32]。已有研究表明，氮含量添加會(huì)降低真菌豐度及多樣性并改變真菌的群落結(jié)構(gòu)；相對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，真菌有更強(qiáng)的吸收氮素和磷素的能力[33-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，氮含量添加的農(nóng)田土壤真菌群落多樣性Chao1、Simpson和Shannon指數(shù)與苜蓿土壤并無(wú)明顯差異，這說(shuō)明黃綿土區(qū)不同作物根系分泌物引起的土壤微生物多樣性的差異可能主要存在于細(xì)菌群落而非真菌群落，本試驗(yàn)后續(xù)還需進(jìn)一步探索。但是本研究發(fā)現(xiàn)，不同種植年限的紫花苜蓿草地土壤真菌多樣性發(fā)生了改變，隨著苜蓿種植年限延長(zhǎng)，真菌群落的多樣性(Shannon指數(shù))顯著增加，之后隨著苜蓿生長(zhǎng)的衰敗又有所降低。這與耿德洲[16]在寧南山區(qū)研究的結(jié)果基本一致，但是最高值出現(xiàn)的年份有所不同，這可能與當(dāng)?shù)剀俎＿m宜種植的年限有關(guān)，隴中黃土高原苜蓿適宜種植的年限可達(dá)10 a[36]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于寧南山區(qū)苜蓿6 a的適宜種植年限。多年生植物通過(guò)分泌根系分泌物對(duì)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和分布產(chǎn)生影響，進(jìn)而改變微生物的豐富度和多樣性[5]。苜蓿為多年生草種，根系發(fā)達(dá)，根系分布可直接改變真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性[37]；且隨著苜蓿種植時(shí)間的延長(zhǎng)到達(dá)旺盛期后地表覆蓋物不斷增加，凋落物和根系的腐解程度增大，苜蓿根瘤菌的固氮作用增強(qiáng)，使土壤有機(jī)碳和養(yǎng)分含量增加，根系通過(guò)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和能量傳遞等過(guò)程提高了真菌豐富度[16,38-39]。隨著苜蓿草地慢慢退化，苜蓿自身較強(qiáng)的化感物質(zhì)通過(guò)根系分泌物、植株殘?bào)w分解和地上部分淋洗等形式被釋放到土壤中，并呈現(xiàn)逐年富集的趨勢(shì)[40]，這種自毒效應(yīng)損害了根系的生長(zhǎng)發(fā)育并降低根瘤菌固氮能力[41]，引起土壤養(yǎng)分含量和微生物豐度與多樣性下降。

3.2 苜蓿種植對(duì)黃綿土真菌群落分布特征的影響

農(nóng)田土壤真菌群落組成與苜蓿存在差異，說(shuō)明作物類型、耕作和施肥等措施對(duì)土壤中微生物群落組成有著顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)田和苜蓿土壤真菌均以子囊菌門為主，占比達(dá)到了69.15%～91.45%，其次為接合菌門和擔(dān)子菌門，這與肖禮和Wang[42-43]等在黃土高原地區(qū)土壤真菌的研究結(jié)果相似，進(jìn)一步說(shuō)明子囊菌門為黃綿土真菌優(yōu)勢(shì)菌門，但由于受不同種植作物影響，不同生境中其相對(duì)豐度具有一定差異[42-43]。子囊菌門以腐生菌為主，可將土壤中的有機(jī)物質(zhì)分解成易被作物吸收的養(yǎng)分，土壤中難以分解的纖維素和木質(zhì)素主要依賴于子囊菌[44]。本研究中苜蓿土壤子囊菌門相對(duì)豐度顯著高于農(nóng)田土壤，農(nóng)田土壤雖然通過(guò)長(zhǎng)期耕作提高了土壤輕組C和N含量，但連續(xù)種植苜蓿增加了土壤腐殖質(zhì)含量，且苜蓿能與根瘤菌形成共生關(guān)系固氮，所以苜蓿能為子囊菌的生長(zhǎng)提供良好的繁殖條件[45-46]。農(nóng)田土壤擔(dān)子菌門相對(duì)豐度顯著高于苜蓿土壤，可能是因?yàn)閭鹘y(tǒng)耕作措施種植玉米影響作物殘茬分解過(guò)程，使土壤中木質(zhì)素含量升高，增加了擔(dān)子菌門相對(duì)豐度，而苜蓿土壤長(zhǎng)期種植不翻耕，分解速率降低，導(dǎo)致?lián)泳T豐度較低[47]。本研究耕層土壤接合菌門相對(duì)豐度隨著苜蓿種植年限的延長(zhǎng)呈先升高后降低趨勢(shì)，長(zhǎng)期種植苜蓿且未翻耕，植物殘?bào)w落葉等進(jìn)入土壤轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)，使有機(jī)物質(zhì)含量提高，為微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供了充足的底物[48]，而接合菌門恰恰能很好地利用腐生環(huán)境[49]。苜蓿種植15 a以后地上生物量降低，養(yǎng)分含量降低與生長(zhǎng)衰退同時(shí)發(fā)生[50]，有機(jī)物質(zhì)的減少導(dǎo)致接合菌門相對(duì)豐度隨之減小。

本研究中被孢霉屬相對(duì)豐度表現(xiàn)為農(nóng)田土壤顯著高于苜蓿土壤，隨苜蓿種植年限延長(zhǎng)被孢霉屬相對(duì)豐度先增加后降低。被孢霉屬能促進(jìn)植株生長(zhǎng)，是土壤中的有益微生物，可補(bǔ)充氮素、溶磷，提高植物的抗病性[51-52]；健康植株土壤中的相對(duì)豐度顯著高于發(fā)病植株土壤[53]。玉米根系分泌糖和氨基酸，能促進(jìn)微生物活化難利用的磷[54]，進(jìn)而提高了被孢霉屬豐度。隨苜蓿種植時(shí)間延長(zhǎng)，土壤養(yǎng)分和地上生物量均逐漸增加，為被孢霉屬的生長(zhǎng)繁殖提供了充足的底物，而持續(xù)種植紫花苜蓿會(huì)導(dǎo)致土壤產(chǎn)生干層，當(dāng)苜蓿種植年限達(dá)到一定的階段，土壤干燥化嚴(yán)重，此時(shí)土壤孔隙度降低、空氣含量下降，水分條件和氧氣含量成為了限制被孢霉屬生長(zhǎng)繁殖的限制性因素，缺乏生存條件的被孢霉屬豐度又逐漸下降[7,45,50]。本研究農(nóng)田土壤綠僵菌屬相對(duì)豐度顯著高于苜蓿土壤，且隨苜蓿種植年限延長(zhǎng)逐漸下降。綠僵菌具有較強(qiáng)的耐高溫和耐旱特性，豐富的N、P可以促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)并能增加其菌苔厚度[55]。農(nóng)田土壤由于連年施肥使得速效N、P含量較高，且覆膜使土壤溫度持續(xù)上升，提高了氮素轉(zhuǎn)化速率，增加了綠僵菌屬豐度；L2012處理的苜蓿處于生長(zhǎng)旺盛期，土壤中可以被利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多，能夠?yàn)榫G僵菌的生長(zhǎng)與繁殖提供適宜的環(huán)境[56]。隨著苜蓿種植年限的延長(zhǎng)，土壤速效磷含量大幅降低[57]，導(dǎo)致綠僵菌的豐度持續(xù)降低。本研究中農(nóng)田土壤腐質(zhì)霉屬相對(duì)豐度均顯著高于苜蓿土壤，可能是因?yàn)楦|(zhì)霉屬營(yíng)腐生，可在土壤內(nèi)或病株殘?bào)w上越冬，農(nóng)田玉米收獲后根系殘留在地表過(guò)冬，碳含量充足，加之覆膜保濕，為腐質(zhì)霉屬的繁殖保證了水分和營(yíng)養(yǎng)條件。

主成分分析發(fā)現(xiàn)，土壤鐮刀菌屬、叢赤殼屬和土赤殼屬均與第一主成分具有較高的相關(guān)性，鐮刀菌屬是重要的植物病原菌之一，對(duì)種子萌發(fā)、根系、根莖生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響[58]。本研究苜蓿土壤鐮刀菌屬相對(duì)豐度隨種植時(shí)間延長(zhǎng)隨之增長(zhǎng)，由于苜蓿隨種植時(shí)間的增加可通過(guò)根系分泌物和植株殘?bào)w分解等形式釋放化感物質(zhì)到土壤中，產(chǎn)生自毒效應(yīng)，并呈現(xiàn)出逐年富集的趨勢(shì)[40]，特別是對(duì)其根系的生長(zhǎng)發(fā)育及根瘤菌的固氮能力造成損害[41]，使病原真菌含量逐漸增長(zhǎng)。叢赤殼屬和土赤殼屬作為子囊菌門肉座菌目的分生孢子在草本植物的根際大量存在，為腐生真菌，常引起植物根腐病等病害[59-60]，本試驗(yàn)中與第一主成分相關(guān)性較高的菌屬均為與植物病害有關(guān)的病原菌，這與苜蓿種植年限有一定的關(guān)系。

4 結(jié) 論

與農(nóng)田相比，種植苜蓿對(duì)土壤真菌多樣性無(wú)明顯影響，但其表現(xiàn)為隨苜蓿種植年限的延長(zhǎng)顯著增加，之后隨著苜蓿生長(zhǎng)的衰敗有所降低。不同種植年限苜蓿地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成相似性高，但其優(yōu)勢(shì)菌群分布受種植時(shí)間的影響。黃土高原雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)農(nóng)田和苜蓿土壤真菌優(yōu)勢(shì)門為子囊菌門(56.46%～91.45%)、接合菌門(5.23%～32.83%)和擔(dān)子菌門(1.92%～9.06%)；農(nóng)田土壤已分類優(yōu)勢(shì)菌屬為被孢霉屬(19.63%～32.45%)，苜蓿土壤優(yōu)勢(shì)菌屬為刺孢屬(7.94%～29.54%)、被孢霉屬(5.21%～23.33%)和白僵菌屬(3.13%～29.73)，且表現(xiàn)為隨著種植年限延長(zhǎng)，耕層土壤促生菌(白僵菌屬和綠僵菌屬)豐度下降，部分病原菌(鐮刀菌屬、赤霉菌屬)豐度增加。