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    依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的線粒體相關(guān)因子的影響

    2021-06-27 11:04:04于書(shū)娟劉洪臣
    關(guān)鍵詞:頜骨孔板成骨細(xì)胞

    于書(shū)娟 劉洪臣

    由于頜骨作為全身骨骼的一部分,在很多方面是相似的,有研究表明,全身骨的骨量減少與頜骨的骨量減少非常相似,并且有一定的相關(guān)性[1-3],所以很多學(xué)者在頜骨的骨量減少的防治上使用全身骨質(zhì)疏松癥的治療藥物。依普黃酮(ipriflavone,IP)是人工合成的異黃酮,已被報(bào)道能增加骨質(zhì)疏松患者的骨密度[4]并具有抗氧化特性[5],其雖然具有雌激素的作用,但對(duì)子宮內(nèi)膜和乳腺的刺激作用小于雌激素[6,7],作為骨質(zhì)疏松癥藥物在臨床已經(jīng)應(yīng)用多年,并且引起口腔醫(yī)學(xué)者的關(guān)注。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)依普黃酮可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的體外增殖和成骨分化,促進(jìn)牙齒移動(dòng)后的牙周組織的重組,預(yù)防正畸后的復(fù)發(fā)[8]。也有學(xué)者的研究結(jié)果提示依普黃酮可以增加頜骨的骨密度[9],從而對(duì)頜骨的骨質(zhì)疏松有一定的防治效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的線粒體相關(guān)因子解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的影響,為依普黃酮應(yīng)用于口腔頜骨骨質(zhì)疏松防治的研究提供理論基礎(chǔ),并且初步探索其分子作用機(jī)制。

    1.材料和方法

    1.1 主要試劑和設(shè)備 依普黃酮(Sigma,美國(guó)),杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)(Gibco,美國(guó)),胰蛋白酶(Amresco,美國(guó)),新生牛血清(四季青,杭州),胎牛血清(Gibco,美國(guó)),培養(yǎng)細(xì)胞總RNA 提取試劑盒(TIANGEN,北京),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(TIANGEN,北京),SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(BOSTER,武漢),總蛋白抽提試劑盒(BOSTER,武漢),辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Santa,美國(guó)),兔抗鼠UCP2 單克隆抗體(BOSTER,武漢)。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

    雙能X 線骨密度儀(Lunar,美國(guó)),ELx800uv全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Tek,美國(guó)),倒置相差顯微鏡(Leica,德國(guó)),紫外分光光度計(jì)(Beckman-DU640,美國(guó)),多功能熒光分析儀(FLUOstar Omega,BMG LABTECH,德國(guó)),TDZS-WS 型多管架自動(dòng)平衡高速離心機(jī)(湘儀公司,長(zhǎng)沙),低溫高速離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó)),ST-Ⅰ型半干式轉(zhuǎn)移電泳槽(競(jìng)邁生物,大連)。

    1.2 動(dòng)物來(lái)源20 只SD 大鼠(雌性,12 周齡,約300g)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng),觀察一周,大鼠均健康。

    1.3 骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)大鼠被隨機(jī)平均分為兩組[去勢(shì)組(n=10)和假手術(shù)組(n=10)]。麻醉后取仰臥位,正中切開(kāi)腹部,去勢(shì)組對(duì)雙側(cè)卵巢結(jié)扎切除,假手術(shù)組對(duì)雙側(cè)卵巢附近的與卵巢大小相似的小塊脂肪切除,嚴(yán)密縫合腹部傷口,術(shù)中注意無(wú)菌操作,術(shù)后注射抗生素防止感染。大鼠在術(shù)后12 周時(shí),通過(guò)綜合分析評(píng)價(jià),成功建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型[10]。

    1.4 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 全麻下處死已建立骨質(zhì)疏松模型的大鼠,無(wú)菌條件下取出下頜骨,去除頜骨上的肌肉和筋膜,完整的拔除頜骨上的牙齒,運(yùn)用課題組人員熟練使用的成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法,即組織塊法和酶消法共同培養(yǎng)的方法[10,11]。首先,在無(wú)菌器皿中用無(wú)菌剪刀將下頜骨,剪成約2mm 直徑大小的骨片,倒入0.125%胰蛋白酶將骨片完全覆蓋,約8min 后,將首次消化的液體倒掉。再用胰蛋白酶連續(xù)消化骨片5次,依次收集,高速離心,將離心管中上清液棄去,管底部細(xì)胞重懸后接種到培養(yǎng)瓶中。然后胰蛋白酶消化后留下的骨片加入培養(yǎng)基,繼續(xù)用無(wú)菌剪刀將骨片剪成約1mm 直徑大小,倒入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待成骨細(xì)胞長(zhǎng)滿全瓶后傳代。

    當(dāng)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中達(dá)到約80%的融合率時(shí),換成不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,以使得細(xì)胞達(dá)到同步化,然后將細(xì)胞分成依普黃酮組和對(duì)照組,分別采用含10-8M 依普黃酮[12]的培養(yǎng)基和不含依普黃酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)成骨細(xì)胞72h。然后進(jìn)行ATP含量檢測(cè)、ROS含量檢測(cè)、UCP2的RT-PCR基因檢測(cè)和UCP2 的western blot 蛋白檢測(cè)。

    1.5 成骨細(xì)胞的ATP 含量檢測(cè) 將成骨細(xì)胞以3×105細(xì)胞/ml 接種于5個(gè)6 孔板,用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化,每個(gè)6 孔板中3個(gè)孔使用藥物干預(yù),3個(gè)孔用作對(duì)照。藥物干預(yù)72h 后。使用ATP 檢測(cè)試劑盒(Beyotime,中國(guó))中提供的試劑,溶解成骨細(xì)胞10min。溶解后,混合物在12000g 和4oC下離心10min。將ATP 檢測(cè)工作液在不透明的96孔板中孵育5min,以減少ATP 的背景。然后將離心后的成骨細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移到96 孔板中2s,立即用多功能熒光分析儀(FLUOstar Omega,BMG LABTECH,德國(guó))在562nm 波長(zhǎng)下測(cè)量化學(xué)發(fā)光(熒光素酶催化熒光素產(chǎn)生熒光)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出ATP 濃度。

    1.6 成骨細(xì)胞的ROS 含量檢測(cè) 將成骨細(xì)胞以1×106細(xì)胞/ml 的密度接種于5個(gè)6 孔板,每個(gè)6 孔板中3個(gè)孔使用藥物干預(yù),3個(gè)孔用作對(duì)照。細(xì)胞同步化和藥物干預(yù)培養(yǎng)后,用PBS 洗滌細(xì)胞兩次,并將用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA 探針(1∶1000 稀釋)添加到培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞20min 后,用無(wú)血清培養(yǎng)基連續(xù)洗滌3次,用于去除多余的DCFH-DA,然后以800 轉(zhuǎn)/分離心6min。用PBS 洗滌細(xì)胞并在0.3ml PBS 中重新懸浮,將0.2ml 含有細(xì)胞的懸浮液轉(zhuǎn)移到96 孔板中,用多功能熒光光分析儀(FLUOstar Omega,BMG LABTECH,德國(guó))測(cè)量熒光(488nm 的激發(fā)/波長(zhǎng),525nm 的散發(fā)波長(zhǎng))。通過(guò)減去自身熒光背景校正,最終獲得成骨細(xì)胞的ROS 含量。

    1.7 RT-PCR 將成骨細(xì)胞以1×105細(xì)胞/ml接種于3個(gè)12 孔板,每個(gè)12 孔板中6個(gè)孔使用藥物干預(yù),6個(gè)孔用作對(duì)照。培養(yǎng)72h 后,用PBS 連續(xù)沖洗三次,用總RNA 提取試劑盒抽提成骨細(xì)胞的總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)式試劑盒反轉(zhuǎn)錄1.5μg 的mRNA 為cDNA,進(jìn)行PCR。引物的合成通過(guò)專業(yè)生物技術(shù)公司(上海英俊公司,中國(guó))完成,見(jiàn)表1。

    表1 用于RT?PCR的基因引物

    每個(gè)25μl 的PCR 反應(yīng)體系包括1.5μl 的cDNA,0.5μl 的dNTPs(10mM),2.5μl 的10×PCR 緩沖液,0.5μl 的β-肌動(dòng)蛋白f(25pmol/ul),0.5μl 的β-肌動(dòng)蛋白r(25pmol/ul),0.5μl的Taq 酶(2u/ul)和ddH2O(補(bǔ)足至25μl)。設(shè)置循環(huán)參數(shù),在94℃預(yù)變性2min,再按94℃/30s、63℃/30s 和72℃/30s 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。然后用瓊脂糖凝膠電泳30min,獲得圖像,用Labworks 4.0 圖像采集分析軟件(PerkinElmer,Waltham,Massachusetts,USA)對(duì)各條帶積分光密度值(IOD)進(jìn)行分析,以目標(biāo)基因與GADPH 基因的IOD 值之比作為目標(biāo)基因表達(dá)水平,每一個(gè)樣品分析三次。

    1.8 Western Blotting 將成骨細(xì)胞以1×105細(xì)胞/ml接種于3個(gè)12孔板,每個(gè)12孔板中6個(gè)孔使用藥物干預(yù),6個(gè)孔用作對(duì)照。藥物干預(yù)培養(yǎng)72h后,將待檢測(cè)的成骨細(xì)胞用PBS洗滌三次后加入細(xì)胞裂解液,冰上輕搖晃15min。刮取各孔的成骨細(xì)胞并且收集于1.5ml試管中,在12000g下4℃離心15min,上清液經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后分裝。含有等量蛋白質(zhì)(30μg)的成骨細(xì)胞上清液,用、SDS-PAGE 分離蛋白,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)移后,用40ml的0.1%Tris緩沖鹽水吐溫(Tris-Buffered Saline Tween-20,TBST)洗滌緩沖液(含5%脫脂乳,pH值7.4)并在4℃下過(guò)夜封閉,加入稀釋度1∶300的兔抗鼠UCP2抗體(BOSTER,武漢),稀釋度1∶2000的β-肌動(dòng)蛋白,在37℃下孵育2h后,洗滌膜三次后,加入稀釋度1∶2000的辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Santa,美國(guó)),繼續(xù)37℃下孵育1h,滴加化學(xué)發(fā)光試劑,X光片盒中曝光。通過(guò)Quantity One軟件分析得出結(jié)果。以β-肌動(dòng)蛋白的百分比表示成骨細(xì)胞的UCP2蛋白表達(dá)。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示,對(duì)于依普黃酮組和對(duì)照組之間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為兩組間有顯著性差異。

    2.結(jié)果

    2.1 倒置顯微鏡下成骨細(xì)胞的形態(tài)觀察 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的形態(tài)如圖1 所示,多呈長(zhǎng)梭形、三角形或多角形等多種形態(tài),有多個(gè)長(zhǎng)或短突起,與相鄰的細(xì)胞連接;細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,居于細(xì)胞中間或略偏向一側(cè),可看到明顯的一個(gè)或兩個(gè)核仁;在細(xì)胞重疊生長(zhǎng)的區(qū)域,可見(jiàn)緊靠的多個(gè)細(xì)胞核。

    圖1 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞(×200)

    2.2 成骨細(xì)胞ATP 含量檢測(cè)的結(jié)果 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞ATP 含量的熒光檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示,依普黃酮組(15.3±1.31μmol/g)明顯高于對(duì)照組(9.9±0.78μmol/g),并且這種差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    圖2 成骨細(xì)胞ATP水平的檢測(cè)結(jié)果(*代表P<0.05)

    2.3 成骨細(xì)胞的ROS含量檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組成骨細(xì)胞ROS 含量的結(jié)果顯示(如圖3),依普黃酮組(276±20)明顯低于對(duì)照組(427±35),有高度顯著性差異(P<0.01)。

    圖3 成骨細(xì)胞ROS含量的檢測(cè)結(jié)果(*代表P<0.05)

    2.4 成骨細(xì)胞UCP2 的mRNA 基因表達(dá)水平圖4 顯示的是成骨細(xì)胞UCP2 的mRNA 基因表達(dá)情況,與對(duì)照組(0.68±0.05)相比,依普黃酮組(0.84±0.08)出現(xiàn)了顯著的升高,P<0.05。

    圖4 成骨細(xì)胞UCP2的mRNA的基因表達(dá)水平(*代表P<0.05)

    2.5 成骨細(xì)胞UCP2 的蛋白表達(dá)水平UCP2蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示,依普黃酮組較高(0.51±0.04),對(duì)照組較低(0.39±0.03),兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義(P<0.05),見(jiàn)圖5。

    圖5 成骨細(xì)胞UCP2蛋白水平表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果(*代表P<0.05)

    3.討論

    近年來(lái),人們?cè)絹?lái)越關(guān)注骨質(zhì)疏松癥對(duì)口腔醫(yī)學(xué)的影響,如種植體植入后的骨整合,拔牙后牙槽骨的骨吸收,或牙周炎的骨改變等[13-16]。依普黃酮作為一種有效的防治骨質(zhì)疏松的藥物,在多個(gè)國(guó)家得到了廣泛的應(yīng)用。其不但可以抑制骨吸收,并且具有雌激素和降鈣素的作用。依普黃酮可能在GPER1 的p38MAPK 信號(hào)通路途徑中發(fā)揮重要的作用[17]。因此,依普黃酮對(duì)頜骨以及口腔疾病的影響也越來(lái)越受到學(xué)者的關(guān)注,對(duì)于其相關(guān)的分子機(jī)制研究也成為熱點(diǎn)。有研究表明依普黃酮可以增加牙周膜干細(xì)胞的成骨分化,并且GPR30 介導(dǎo)的PI3K/Akt 通路在其中起著重要的作用[8]。p38MAPK 通路和PI3K/Akt 通路均能通過(guò)磷酸化某些因子調(diào)控著細(xì)胞的增殖和凋亡。而磷酸化的過(guò)程是在線粒體中完成的。在本研究中,通過(guò)體外培養(yǎng)骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨成骨細(xì)胞,研究依普黃酮對(duì)成骨細(xì)胞的線粒體相關(guān)細(xì)胞因子的影響,也為口腔醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步研究提供了一定的研究思路。

    線粒體是一種重要的細(xì)胞器,為細(xì)胞功能活動(dòng)提供能量,有“電力站”之稱,同時(shí),它也是有氧呼吸的重要場(chǎng)所,與ATP 和ROS 的生成直接相關(guān)。而UCP2 作為線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,使質(zhì)子通過(guò)直接滲漏回線粒體基質(zhì)的方式,部分解偶聯(lián)氧化磷酸化,使得ATP的產(chǎn)生出現(xiàn)減少的情況[18,19];同時(shí),UCP2 通過(guò)減少呼吸鏈電子漏的發(fā)生和降低線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度,能減少ROS 的產(chǎn)生。對(duì)于ATP 來(lái)說(shuō),Megha Rajendran 等認(rèn)為,ATP 不僅是細(xì)胞進(jìn)行各種功能活動(dòng)能量的直接來(lái)源,也是生物體內(nèi)外新陳代謝和信號(hào)傳導(dǎo)的中心分子[20]。Lukas Jaroslaw 等研究報(bào)道UCP2 通過(guò)調(diào)控ATP 的濃度起到調(diào)控細(xì)胞鈣的攝取[21];而鈣離子在細(xì)胞行使功能活動(dòng)時(shí)起到重要的作用。同時(shí),對(duì)于ROS 來(lái)說(shuō),ROS 是衰老、炎癥及某些疾病的發(fā)病機(jī)制之一,可以通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而起到調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞生死平衡的作用。已有多個(gè)研究表明,當(dāng)線粒體內(nèi)膜電勢(shì)升高時(shí),UCP2可抑制ROS 的產(chǎn)生[22,23]。而在口腔醫(yī)學(xué)研究中,也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境可以顯著地提高牙周膜干細(xì)胞的ROS表達(dá)水平,從而起到抑制細(xì)胞線粒體生成和抗氧化反應(yīng)[24]。Fatokun AA 等[25]的研究也表明,ROS 起到影響成骨樣細(xì)胞作用,從而推測(cè)其可能與骨質(zhì)疏松癥有一定得關(guān)系。所以說(shuō),線粒體相關(guān)因子UCP2、ATP和ROS三者既關(guān)系密切,又各自在細(xì)胞的各種功能活動(dòng)中起著重要的作用,從而為依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥頜骨成骨細(xì)胞影響的分子機(jī)制的探討,提供一種好的研究思路和途徑。

    已經(jīng)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),去勢(shì)后大鼠脂肪組織中UCP2的表達(dá)出現(xiàn)了降低[26]。并且我們前期的研究結(jié)果顯示,骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨成骨細(xì)胞表達(dá)UCP2 較低,而ROS 和ATP 較高[10]。在本實(shí)驗(yàn)中,研究發(fā)現(xiàn)依普黃酮能促進(jìn)UCP2 的表達(dá),降低ROS的表達(dá),部分糾正了骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的異常表達(dá),通過(guò)降低ROS對(duì)成骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能具有保護(hù)作用,也提示依普黃酮可能通過(guò)UCP2 和ROS 來(lái)調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的功能活動(dòng)。然而,本實(shí)驗(yàn)還表明,依普黃酮對(duì)成骨細(xì)胞的作用,除了ROS 的減少和UCP2 的增加,ATP 的產(chǎn)生也增加,這似乎是使得骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞本來(lái)就很高的ATP 的表達(dá)更高了,但是,其一方面表明ATP的產(chǎn)生可能不僅僅受UCP2的調(diào)控,其他基因或蛋白質(zhì)也可能對(duì)ATP 的產(chǎn)生起調(diào)控作用,另一個(gè)方面也說(shuō)明依普黃酮通過(guò)增加ATP 水平為成骨細(xì)胞的各種功能活動(dòng)提供足夠的能量支持,促進(jìn)骨生成,從而起到一定的防治骨質(zhì)疏松的作用。

    總之,依普黃酮可能起到調(diào)控骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的線粒體相關(guān)因子UCP2、ROS 和ATP等的作用,但是其作用機(jī)制的研究非常復(fù)雜,我們的研究結(jié)果只是提供了一定的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù),仍然需要進(jìn)一步開(kāi)展更多的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)探索。

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