膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)中獸藥非法添加化學(xué)藥品的應(yīng)用

趙興鑫　田梅　趙義良　蘇青　呂潔　趙永坡　張吉

摘要：為快速有效地鑒定出中獸藥中非法添加的化學(xué)藥物，該文選取健胃散、白頭翁散、銀翹解散和清瘟敗毒散4種常見(jiàn)的中獸藥散劑作為基質(zhì)，分別添加不同濃度的沙丁胺醇和克倫特羅2種“瘦肉精”藥物，及氯霉素和四環(huán)素2種抗生素藥物，建立膠體金快速檢測(cè)方法。結(jié)果表明，在健胃散、白頭翁散、銀翹解散中添加10 μg/kg沙丁胺醇對(duì)照品，各個(gè)加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性;在清瘟敗毒散中分別添加2、3、5 μg/kg克倫特羅對(duì)照品，各個(gè)加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，且有一定梯度;在健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散中添加10 μg/kg氯霉素對(duì)照品，各個(gè)加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性;在健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散中添加50 μg/kg四環(huán)素對(duì)照品，各個(gè)加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。

關(guān)鍵詞：中獸藥;瘦肉精;抗生素;快檢;膠體金

中圖分類號(hào)：S853? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ? ? doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.21.001

Detection of Illegally Added Chemicals in Chinese Veterinary Drugs Based on Colloidal Gold Immunochromatography

Abstract：In order to quickly and effectively identify the illegally added chemical drugs in Chinese veterinary drugs，four common Chinese veterinary drugs，Jianwei powder，Baitouweng powder，Yinqiao powder and Qingwen Paidu powder，were selected as the substrates，the colloidal gold method was established by adding different concentrations of salbutamol and Clenbuterol，chloramphenicol and tetracycline，respectively.The experimental results showed that 10 μg / kg salbutamol reference substance was added to Jianwei powder，Pulsatilla powder and yinqiao powder，and the test results of each spiked sample were positive;2，3 and 5 μg/kg clenbuterol control samples were added to Qingwen Baidu powder respectively，and the test results of each spiked sample were positive with a certain gradient;10 μg/ kg chloramphenicol reference substance was added to Jianwei powder，Pulsatilla powder and Yinqiao Jiedu powder，and the test results of each spiked sample were positive;50 μg/kg tetracycline reference substance was added to Jianwei powder，pulsatilla powder and Yinqiao Jiedu powder，and the test results of each spiked sample were positive.

Keywords：Chinese veterinary medicine，clenbuterol，antibiotics，rapid detection，colloidal gold

引言

隨著全社會(huì)對(duì)食品安全問(wèn)題的重視，在我國(guó)畜牧業(yè)領(lǐng)域進(jìn)一步提出新的發(fā)展要求，其中在獸醫(yī)臨床中減少使用或代替化學(xué)合成類抗生素等藥物成為最重要的措施[1]，而中獸藥因具有低毒副作用、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)會(huì)越來(lái)越被廣泛地應(yīng)用。

膠體金免疫層析法在具體檢驗(yàn)期間所用原理為競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析，檢驗(yàn)所用樣品中待測(cè)物在流動(dòng)時(shí)結(jié)合膠體金標(biāo)記特異性待測(cè)物單克隆抗體，對(duì)于抗體及硝酸纖維素膜檢測(cè)線上應(yīng)用的待測(cè)物-BSA偶聯(lián)物結(jié)合產(chǎn)生一定的抑制效果，從而造成檢測(cè)線顏色發(fā)生不同程度的深淺變化[2]。當(dāng)樣品中不含有待測(cè)物或濃度低于檢測(cè)限時(shí)，T線（測(cè)試線，testline）顯色強(qiáng)于C線（質(zhì)控線，controlline），或者顯色與C線顯色之間未見(jiàn)明顯差異，如果和檢測(cè)限進(jìn)行比較，樣品中的待測(cè)物濃度較高，則T線顯色會(huì)明顯弱于C線顯色，或者也表現(xiàn)為T線不顯色。

為了快速檢測(cè)出中獸藥中的違法添加物，擬通過(guò)膠體金免疫層析法，開展違法添加物的快速篩查檢測(cè)工作，通過(guò)與深圳市綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司聯(lián)合開展技術(shù)攻關(guān)，得到了適用于中獸藥中違法添加物快速篩查檢測(cè)的膠體金速測(cè)卡。

1 儀器與材料

沙丁胺醇、克倫特羅、氯霉素、四環(huán)素膠體金快速檢測(cè)卡（深圳市綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司），漩渦混合儀，離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)用樣本提取液（深圳市綠詩(shī)源生物技術(shù)有限公司），沙丁胺醇、克倫特羅、氯霉素、四環(huán)素對(duì)照品，健胃散、白頭翁散、銀翹解散和清瘟敗毒散。

2 方法

取樣品（1±0.01）g，放入50 mL離心管中，加入40 mL樣本提取液，漩渦混合2 min，室溫下4 000 r/min離心5 min。取上清液2～3滴加入檢測(cè)卡樣品孔中，計(jì)時(shí)5 min后，直接目測(cè)結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 基質(zhì)干擾考察

膠體金免疫層析法對(duì)樣本的處理是有一定要求的，由于免疫反應(yīng)是一種生物反應(yīng)，最終滴加入檢測(cè)卡孔中的液體pH要在一定范圍內(nèi)，通常為5～8，否則容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或無(wú)效的情況;而中獸藥散劑本身物質(zhì)成分復(fù)雜，又具有較深的顏色，易造成干擾。在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)針對(duì)樣本提取液（一定濃度的緩沖體系）和稀釋倍數(shù)做大量研究，最終確定該方法?？赏ㄟ^(guò)圖片清晰地看到健胃散、白頭翁散、銀翹解散和清瘟敗毒散在基質(zhì)狀態(tài)下試紙條顯示明顯的陰性，偶有淡黃色背景，但不影響結(jié)果判斷[3]。

3.2 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

健胃散、白頭翁散、銀翹解散，分別稱取1 g，定量加入0.01 mL沙丁胺醇（1 μg/mL）對(duì)照品，所添加對(duì)照品劑量與中藥散劑含量10 μg/kg相當(dāng)，按照應(yīng)用“2”方法處理分析，檢測(cè)所用工具為膠體金免疫層析檢測(cè)卡，分別記錄結(jié)果，見(jiàn)圖1，各個(gè)加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明方法準(zhǔn)確性良好。

分別稱取3份清瘟敗毒散各1 g，依次定量加入克倫特羅（0.1 μg/mL）對(duì)照品0.02、0.03、0.05 mL，相當(dāng)于中藥散劑含量為2、3、5 μg/kg，按“2”方法處理后，應(yīng)用膠體金免疫層析檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，分別記錄結(jié)果，見(jiàn)圖2，各個(gè)加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，且有一定梯度，表明方法準(zhǔn)確性良好。

健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散，分別稱取1 g，定量加入0.01 mL氯霉素（1 μg/mL）對(duì)照品，所添加對(duì)照品劑量相當(dāng)于中藥散劑含量10 μg/kg，所用處理方式同樣為“2”方法，然后借助于膠體金免疫層析檢測(cè)卡展開檢測(cè)，分別記錄結(jié)果，見(jiàn)圖3，各個(gè)加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明方法準(zhǔn)確性良好。

健胃散、白頭翁散、銀翹解毒散，分別稱取1 g，定量加入四環(huán)素（10 μg/mL）對(duì)照品，添加劑量為0.005 mL，與中藥散劑含量50 μg/kg相同，處理時(shí)應(yīng)用“2”方法，所用檢測(cè)工具為膠體金免疫層析檢測(cè)卡，分別記錄結(jié)果，見(jiàn)圖4，各個(gè)加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明方法準(zhǔn)確性良好[4]。

4 討論

健胃散、白頭翁散、銀翹解散和清瘟敗毒散4種中獸藥散劑在本實(shí)驗(yàn)方法下檢測(cè)未出現(xiàn)假陽(yáng)性或無(wú)效的情況，說(shuō)明該方法的提取溶劑和稀釋倍數(shù)適合，減少色素及其他雜質(zhì)的影響。在加入的藥物對(duì)照品的樣品中，均有檢出，呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)性結(jié)果，且檢測(cè)限均達(dá)到痕量級(jí)別，更進(jìn)一步確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

該方法的優(yōu)勢(shì)十分明顯，在具體應(yīng)用期間所得檢測(cè)項(xiàng)目靈敏度與其他檢測(cè)手段可媲美，在實(shí)際應(yīng)用期間可提前檢測(cè)大量樣本以及多個(gè)靶標(biāo)物質(zhì)，有利于進(jìn)行違法行為的初步判定。膠體金免疫層析法主要優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力，和傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，應(yīng)用期間對(duì)于儀器設(shè)備要求較少，且檢測(cè)費(fèi)用較低，所獲得的檢測(cè)結(jié)果直觀，適合基層條件下使用，具有廣闊的發(fā)展空間。

中獸藥散劑品類眾多，成分復(fù)雜，且在種植及炮制時(shí)有差異，而膠體金免疫技術(shù)易受樣本基質(zhì)干擾，如樣品本身色素較多、pH值過(guò)低或過(guò)高、相似結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)成分等因素，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或無(wú)效情況。為解決此類問(wèn)題，需要調(diào)配合適的提取溶劑和調(diào)整合適的稀釋倍數(shù)來(lái)降低基質(zhì)干擾。

5 結(jié)束語(yǔ)

膠體金快速檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)被廣泛使用在食源性動(dòng)物的快速篩查上，技術(shù)成熟，商業(yè)化生產(chǎn)企業(yè)眾多。隨著相關(guān)部門對(duì)獸藥處方外非法添加的監(jiān)管與打擊力度不斷加大，積極推進(jìn)快檢方法的應(yīng)用和適用范圍擴(kuò)展。對(duì)中獸藥非法添加化學(xué)藥物進(jìn)行快速有效地分析，提高各檢測(cè)機(jī)構(gòu)的篩查能力，膠體金免疫層析技術(shù)是一種凈化中獸藥市場(chǎng)的可靠手段。

參考文獻(xiàn)

[1] 李明.我國(guó)獸藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2018（19）：14-15.

[2] 李耀磊，劉麗娜，姚云，等.基于膠體金免疫層析技術(shù)對(duì)中藥材中黃曲霉毒素B_1的定量檢測(cè)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2019，54（17）：1 432-1 437.

[3] 周媛，貢玉清，邵德佳.有關(guān)中獸藥中非法添加化學(xué)藥物的探討[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2010，26（5）：36-37.

[4] 蔣海芬，韋勵(lì)平，韋俏娜.獸藥中非法添加物檢測(cè)新技術(shù)的應(yīng)用[J].廣西畜牧獸醫(yī)，2015，32（2）：109-110.

基金項(xiàng)目：石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201500122A）;石家莊市科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（208790026A）

作者簡(jiǎn)介：趙興鑫（1985-），男，漢族，山東泰安人，碩士研究生，高級(jí)畜牧師，從事畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量安全檢測(cè)方法的研究工作。