五子衍宗丸通過抑制GRP78 減輕EAE 小鼠持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

肖午帥樊慧杰李艷榮賈 璐孫夢瀛張 波尉杰忠肖保國施福東馬存根*柴 智*

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點實驗室/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西 晉中 030619；2.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西 晉中 030619；3.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009；4.復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025；5.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052）

多發(fā)性硬化是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，其特征是遍布中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性病變導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)功能障礙，脫髓鞘、軸突損傷和血腦屏障改變其病理學(xué)標(biāo)志［1]。其發(fā)病機制可能是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)原存的病變，伴有的不同程度的炎癥，導(dǎo)致髓磷脂慢性脫落，或是因外周T細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并與巨噬細胞和B 細胞一起攻擊髓磷脂，使髓鞘乃至軸突產(chǎn)生病變［2]。實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）是多發(fā)性硬化的成熟動物模型［3]。目前在用于治療多發(fā)性硬化的藥物中，部分能夠預(yù)防炎性組織損傷，但均無法直接促進修復(fù)，且有一定的毒副作用［4]。

基于中醫(yī)腎藏精生髓，上充于髓海之腦的理論，腎虧髓空被認為是多發(fā)性硬化的根本病機［5]。五子衍宗丸具有補腎填精充髓的功效?，F(xiàn)代研究表明，五子衍宗丸能夠提高大鼠機體免疫［6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［7-8]，五子衍宗丸能夠通過抑制炎性反應(yīng)發(fā)揮對多發(fā)性硬化的神經(jīng)保護效應(yīng)，且其有抗凋亡的作用。近來有研究［9]表明，二甲雙胍能夠下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達，這或是其能保護由魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病小鼠內(nèi)巴胺能神經(jīng)元的一個原因。二至丸通過下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CHOP 和半胱天冬氨酸蛋白酶12（Caspase-12）的蛋白表達，改善帕金森病小鼠的運動和學(xué)習(xí)記憶功能［10]。五子衍宗丸是否可以減輕EAE 小鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而發(fā)揮治療作用？基于此，本研究將探討五子衍宗丸對EAE 小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 8～10 周齡C57BL/6 雌性小鼠24 只，體質(zhì)量18～21 g，購于北京維通利華實驗動物公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006。獲山西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，實驗操作嚴格執(zhí)行國際動物實驗方針。動物于無菌動物房（溫度22～25 ℃，相對濕度40%～60%）進行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，而后開展實驗。

1.2 藥物 五子衍宗丸含菟絲子（炒）、枸杞子、五味子（蒸）、覆盆子、鹽車前子五種中藥，購于太原市同仁堂藥店（北京同仁堂股份有限公司，批號18035041，規(guī)格0.1 g/粒，成人用量口服，6 g/次，2 次/d）。將藥丸研磨至細粉后，以0.9%生理鹽水配制成0.32 g/mL 的五子衍宗丸藥液備用。

1.3 儀器電泳儀（美國 Bio-Rad 公司，型號PowerPacTM）；酶標(biāo)儀（德國Leica 公司，型號C-1150）；冷凍離心機（德國Eppendorf 公司，型號5840）；轉(zhuǎn)膜儀（型號PowerPacTM）、凝膠成像分析儀（型號HOOD-Ⅱ）（美國Bio-Rad 公司）；冰凍切片機（型號CM1950）、正置顯微鏡（型號DM4000B/DFC450C）（德國Leica 公司）。

1.4 試劑 小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白多肽35-55（MOG35-55）（上海強耀生物科技有限公司，批號9001）；結(jié)核分枝桿菌（美國Becton Dickinson 公司，批號231141）；百日咳毒素（美國Sigma 公司，批號231144）；完全弗氏佐劑（美國Alexis 公司，批號60301）；抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78蛋白抗體（批號GR3281962-1）、抗半胱天冬氨酸蛋白酶12蛋白抗體（批號GR3225341-3）、抗增強子結(jié)合蛋白同源蛋白蛋白抗體（批號GR3259414-5）均購自英國Abcam 公司。

1.5 模型制備 將MOG35-55溶解于0.9%NaCl 溶液，結(jié)核分枝桿菌于完全弗氏佐劑中溶解，后以針管混合器將二者以相同體積充分混合成油包水樣乳劑，待靜置后無分層方可使用。取該試劑（MOG35-55濃度為250 μg/只，結(jié)核分枝桿菌濃度為350 μg/只，0.1 mL/只）于小鼠背部脊椎兩側(cè)選取4 點進行皮下注射；免疫當(dāng)日和48 h 后，對小鼠按每只300 ng/次的規(guī)格腹腔注射百日咳毒素。待其尾部肌張力下降，視EAE 模型制成。

1.6 動物分組及給藥 根據(jù)其平均體質(zhì)量按照隨機數(shù)字表法將24 只小鼠均分為正常組、模型組、五子衍宗丸組。免疫后第3 天開始持續(xù)25 天灌胃，每天給正常組和模型組以50 mL/kg 的生理鹽水，五子衍宗丸組給予每天16 g/kg 的五子衍宗丸藥液，體積為每次0.5 mL/只［7]，每日2 次，早晚間隔12 h。

1.7 行為學(xué)觀察 從免疫當(dāng)天起，每日對各組小鼠進行臨床神經(jīng)功能評分。采納國際通用5 分制［3]：0 分，無癥狀；1 分，尾張力消失，跛行；2 分，后肢無力，翻其可復(fù)；3分，后肢完全癱瘓，觸其可動；4 分，后肢全癱和前肢部分癱瘓；5 分，瀕死或亡。癥狀介于兩者之間則以均值計。

1.8 采樣及檢測 藥物干預(yù)至第28 天，腹腔注射10%水合氯醛（8 mL/kg）麻醉，于每組中隨機取4 只以0.9%生理鹽水快速灌注，后以4%多聚甲醛緩慢灌流固定，提取脊髓，脫水包埋，再行液氮冷凍，制10 μm 厚的冰凍切片，4℃保存?zhèn)溆?；取各組另4 只以0.9% 生理鹽水進行心臟灌注，快速提取脊髓組織再低溫研磨，高速離心，勻漿后提蛋白，定量備用。

1.8.1 蘇木素-伊紅染色檢測脊髓組織炎性細胞浸潤程度 水中浸泡脊髓切片10 min，繼而室溫蘇木素染色12 min，流水速洗5 min，后于0.5%鹽酸酒精中分化13 s，流水速洗2 min，伊紅染色1～2 min，流水速浸6 min，再以梯度乙醇脫水，繼而以二甲苯透明，用中性樹膠進行封片，光鏡下采集圖片。

1.8.2 髓鞘染色檢測脊髓白質(zhì)脫髓程度 脊髓切片浸于95%乙醇中固定15 min，后浸于固藍置60 ℃烤箱中孵育20 h，繼而以95%乙醇溶液浸9 min，去離子水流洗5 min，0.05%碳酸鋰快速浸10 s，再以70% 乙醇分化，重復(fù)此兩步操作至能夠清晰辨別出灰質(zhì)，去離子水浸流6 min，以梯度乙醇脫水，再以二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下采集圖片。

1.8.3 Western blot 檢測GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表達 取組織蛋白，4 ℃條件下裂解組織，以BCA 法測定蛋白含量，再制蛋白上樣緩沖液。以10%凝膠電泳，后以半干式轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。5%脫脂牛奶搖床封閉1.5 h，洗滌后以TBST 分別稀釋GRP78（1∶100）、Caspase-12（1∶1 000）、CHOP（1∶200）和Tubulin（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育過夜，次日洗滌后加入相應(yīng)的HRP 耦聯(lián)二抗（1∶10 000），室溫進行2 h 孵育，TBST 漂洗，以ECL 試劑顯色曝光條帶，后計算灰度值并比較再統(tǒng)計。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用t 檢驗，若不符合正態(tài)分布或方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05 則認為其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五子衍宗丸對小鼠神經(jīng)功能的影響 如圖1 所示，模型組小鼠于免疫后第10 天開始發(fā)病，五子衍宗丸組小鼠于免疫后第14 天開始發(fā)病。模型組、五子衍宗丸組平均起病時間分別為（10.88±1.13）、（14.88±0.83）d，與模型組相比，五子衍宗丸組小鼠平均起病時間推遲（P＜0.01），平均最高神經(jīng)評分分別為（3.44±0.32）、（2.38±0.35）分，五子衍宗丸組小鼠平均最高神經(jīng)評分降低（P＜0.01）。

圖1 五子衍宗丸對小鼠神經(jīng)功能的影響（，n=6）

2.2 五子衍宗丸對小鼠脊髓影響炎性細胞浸潤的影響 如圖2 所示，正常組、模型組、五子衍宗丸組脊髓白質(zhì)區(qū)炎性細胞浸潤面積占整個脊髓面積的比值分別為（0.71±0.11）%、（3.07±0.39）%、（1.57±0.22）%。與正常組比較，模型組炎性細胞浸潤增加（P＜0.01）；與模型組相比，五子衍宗丸組炎性細胞浸潤減少（P＜0.01）。

圖2 五子衍宗丸對小鼠脊髓影響炎性細胞浸潤的影響（，n=4）

2.3 五子衍宗丸對小鼠脊髓髓鞘脫失的影響 如圖3 所示，正常組、模型組、五子衍宗丸組髓鞘脫失面積與脊髓白質(zhì)面積比值分別為（1.47±0.28）%、（9.43±2.47）%、（3.40±0.81）%。與正常組比較，模型組髓鞘脫失增加（P＜0.01）；與模型組相比，五子衍宗丸組髓鞘脫失減少（P＜0.05）。

圖3 五子衍宗丸對小鼠脊髓髓鞘脫失的影響（，n=4）

2.4 五子衍宗丸對小鼠脊髓GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表達的影響 如圖4 所示，與正常組比較，模型組脊髓組織GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表達均升高（P ＜0.01）；與模型組比較，五子衍宗丸組脊髓組織GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表達均降低（P＜0.05）。

圖4 五子衍宗丸對小鼠脊髓GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表達的影響（，n=4）

3 討論

多發(fā)性硬化是一種的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性變性疾病脫髓鞘疾?。?1]。中醫(yī)將腎虛視為多發(fā)性硬化的發(fā)病之本［12]。補腎方藥對于多發(fā)性硬化患者臨床癥狀的改善，及生活質(zhì)量的提高，都具有積極影響［13]。現(xiàn)代研究表明，五子衍宗丸組分中枸杞子具有一定的抗凋亡作用［14]，五味子有抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抗炎作用［15]，菟絲子具有抗炎活性［16]。本研究結(jié)果顯示，補腎經(jīng)方五子衍宗丸可改善EAE 小鼠神經(jīng)功能評分并可延緩起病時間。蘇木素-伊紅染色和髓鞘染色結(jié)果證實，五子衍宗丸能夠抑制脊髓白質(zhì)炎性細胞浸潤和髓鞘脫失。

在多發(fā)性硬化發(fā)作之前或期間，炎性介質(zhì)的刺激或因神經(jīng)細胞試圖再髓鞘時導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白超負載［17]，可能會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過未折疊蛋白反應(yīng)來恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)［18]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主調(diào)節(jié)器GRP78 與未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，同時與三個跨膜未折疊蛋白反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器解離，從而啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的三條分支通路即肌醇需要酶1、PKR 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和激活轉(zhuǎn)錄因子6［19]。再髓鞘化和軸突的修復(fù)、再生的一個信號便是適當(dāng)?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)［20]。持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能使未折疊蛋白反應(yīng)激活炎癥信號通路［21]甚至促進神經(jīng)毒性和凋亡程序［22]。Caspase-12 和CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的兩條主要的細胞凋亡途徑［23]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激期間，鈣穩(wěn)態(tài)被打破壞，可以特異性地激活Caspase-12，而后啟動相關(guān)級聯(lián)反應(yīng)［24]。未折疊蛋白反應(yīng)的三條通路均能作用于CHOP，肌醇需要酶1 能夠上調(diào)CHOP 轉(zhuǎn)錄因子表達［23]，PKR 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶能夠誘導(dǎo)ATF4 激活，而后激活CHOP，切割后的激活轉(zhuǎn)錄因子6 能夠調(diào)節(jié)CHOP 的表達［25]。未折疊蛋白反應(yīng)的三條通路的激活都會產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子分別為激活轉(zhuǎn)錄因子6a、剪切轉(zhuǎn)錄因子X 盒結(jié)合蛋白1 和激活轉(zhuǎn)錄因子4，均能激活GRP78 基因，從而提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常折疊蛋白質(zhì)的能力［17]。有研究發(fā)現(xiàn)，EAE 小鼠體內(nèi)GRP78、Caspase-12 和CHOP 蛋白表達水平升高［26]。另有研究發(fā)現(xiàn)，缺乏GRP78 基因表達的小鼠能夠?qū)е律偻荒z質(zhì)細胞丟失并加劇EAE 的發(fā)展［27]。在本實驗中，EAE 小鼠的GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表達水平同時升高，再結(jié)合其病理結(jié)果可知，EAE 小鼠此時GRP78 的高表達可被認為是持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物而非適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物，且可推測此時高表達狀態(tài)下的GRP78 發(fā)揮的保護作用遠不及由Caspase-12 和CHOP 產(chǎn)生的觸發(fā)凋亡加重炎癥的髓鞘脫失的作用，而這種持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激亦是由GRP78 啟動的。GRP78 對髓鞘細胞有保護作用，而由GRP78 啟始的持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的病理作用是高表達的GRP78 的保護作用所不能彌補的。五子衍宗丸能夠下調(diào)GRP78、Caspase-12 和CHOP 蛋白的表達，表明其可減輕持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕對髓鞘損害本身也是一種保護髓鞘的表現(xiàn)。

綜上，五子衍宗丸對EAE 小鼠具有一定的防治作用，這可能與通過抑制GRP78 的表達來下調(diào)持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的GRP78 可能是五子衍宗丸治療多發(fā)性硬化的一個潛在的新的治療靶點。這為今后深入探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路參與五子衍宗丸對EAE 小鼠的防治機制提供了研究基礎(chǔ)，也為臨床應(yīng)用五子衍宗丸治療多發(fā)性硬化提供了實驗基礎(chǔ)。