電刺激調(diào)控干細(xì)胞心肌向分化和心肌修復(fù)

高婭婭， 李沂蒙， 毛吉富， b， c， 王 璐， b， c

(東華大學(xué) a.紡織學(xué)院； b.紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； c.紡織行業(yè)生物醫(yī)用紡織材料與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201620)

心血管疾病是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要疾病之一，我國(guó)每年死于心肌梗死及其并發(fā)癥的人數(shù)已超過(guò)100萬(wàn)，且發(fā)病率逐年攀升[1]。在受到諸如心肌梗死等的嚴(yán)重?fù)p傷后，因心肌細(xì)胞的再生潛力有限，隨著時(shí)間流逝，纖維化瘢痕組織取代了存活心肌，并且左心室擴(kuò)張，最終導(dǎo)致心力衰竭。當(dāng)前治療末期心力衰竭的最新方法主要是應(yīng)用左心室輔助設(shè)備進(jìn)行全心臟移植[2-4]，但這些治療手段仍面臨侵入性手術(shù)、供體器官有限的現(xiàn)狀以及免疫排斥等問(wèn)題。因此，臨床上迫切需要一種新療法來(lái)治療心肌梗死導(dǎo)致的心力衰竭。

基于干細(xì)胞的心肌修復(fù)療法展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。由干細(xì)胞分化而來(lái)的心肌細(xì)胞，被視為治療心肌梗死最有希望的細(xì)胞來(lái)源。然而，由干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化形成的心肌細(xì)胞尚未完全成熟，且具有搏動(dòng)頻率變異性問(wèn)題，其被移植到受損心臟后存在心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，無(wú)法執(zhí)行正常心肌細(xì)胞的功能[5-6]。在心臟收縮過(guò)程中，起搏器細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)生電脈沖或動(dòng)作電位，從竇房結(jié)發(fā)出節(jié)律性電信號(hào)，通過(guò)細(xì)胞間隙連接傳播至心肌層細(xì)胞，再通過(guò)高導(dǎo)電性的浦肯野纖維傳導(dǎo)至心臟其他區(qū)域，最終實(shí)現(xiàn)整個(gè)心臟的節(jié)律性收縮[7]。在此過(guò)程中，電信號(hào)和間隙連接對(duì)心臟的同步搏動(dòng)至關(guān)重要。近些年，電刺激因其非藥物治療手段以及在疾病治療方面的安全、方便、經(jīng)濟(jì)特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，一定范圍的電刺激能夠促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化以及干細(xì)胞源心肌細(xì)胞的體外成熟。心肌梗死發(fā)生后，心臟功能逐步衰退，收縮期左心室內(nèi)部尺寸明顯擴(kuò)大，心室壁心肌組織完全被纖維化組織取代。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，體外經(jīng)電刺激培養(yǎng)成熟的心肌細(xì)胞能夠減少梗死區(qū)的梗死面積和纖維化組織，并促進(jìn)血管再生[8]。

本文介紹2種導(dǎo)電材料基電刺激平臺(tái)，聚焦2種常見(jiàn)的電刺激模型，對(duì)電刺激促進(jìn)干細(xì)胞心肌向分化及心肌細(xì)胞的成熟和功能化研究進(jìn)行總結(jié)。

1 導(dǎo)電材料基電刺激平臺(tái)

在心肌細(xì)胞電刺激系統(tǒng)中，大多數(shù)電刺激裝置通過(guò)插在培養(yǎng)液中的2個(gè)電極為細(xì)胞提供電場(chǎng)刺激。該類(lèi)電刺激裝置過(guò)于簡(jiǎn)單，無(wú)法有效地向心肌細(xì)胞傳導(dǎo)電信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，接種于導(dǎo)電微納復(fù)合支架上的心肌細(xì)胞對(duì)電刺激的響應(yīng)較高(見(jiàn)圖1)[9]，能夠有效傳導(dǎo)電信號(hào)，可促進(jìn)心肌細(xì)胞的同步搏動(dòng)功能。目前，用于工程化心肌組織體外構(gòu)建的導(dǎo)電生物材料主要包括導(dǎo)電水凝膠[10]和導(dǎo)電納米纖維支架[11]。

圖1 人間充質(zhì)干細(xì)胞電刺激生物反應(yīng)器示意圖[9]Fig.1 Schematic of the bioreactor for hMSCs electrical stimulation[9]

1.1 導(dǎo)電水凝膠

水凝膠能夠在水中溶脹、可保持大量水分而又不溶解于水，具有良好的生物相容性和可控的力學(xué)性能，由于存在大量的親水基團(tuán)，其含水率高達(dá)90%以上[12]。水凝膠因其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與體內(nèi)心肌細(xì)胞所處基質(zhì)微環(huán)境相似，被廣泛應(yīng)用于工程化心肌組織的體外構(gòu)建[12]。

Zhao等[13]將心肌細(xì)胞包埋在纖維蛋白水凝膠中，提高了心肌細(xì)胞的間隙連接蛋白表達(dá)及收縮力，改善了心肌組織的功能，但未能改善心肌細(xì)胞對(duì)電信號(hào)的傳導(dǎo)。近些年新型導(dǎo)電生物材料得到廣泛開(kāi)發(fā)，通常是將水凝膠與導(dǎo)電材料復(fù)合起來(lái)，以制備具有導(dǎo)電性能的水凝膠材料。常用的導(dǎo)電材料包括碳納米管(CNT)[14]、石墨烯[15]、導(dǎo)電聚吡咯(PPy)[16]、聚苯胺[17]、金納米顆粒[18]等。Shin等[14]將新生大鼠心肌細(xì)胞接種到摻有CNT的光交聯(lián)甲基丙烯酸明膠水凝膠上以設(shè)計(jì)功能性心肌補(bǔ)片，結(jié)果表明，所得心肌補(bǔ)片具有明顯改善的電生理和力學(xué)性能，可促進(jìn)心肌細(xì)胞的黏附和成熟、改善心肌細(xì)胞間的電耦合。但潛在的生物毒性限制了碳納米材料的進(jìn)一步應(yīng)用。導(dǎo)電聚合物因具有良好的生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。Wang等[16]用貽貝啟發(fā)性多巴胺交聯(lián)劑將PPy納米顆粒、明膠-甲基丙烯酸酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯整合成冷凍凝膠形態(tài)，并將心肌細(xì)胞種植在該導(dǎo)電水凝膠上，結(jié)果顯示導(dǎo)電水凝膠顯著增強(qiáng)了心肌細(xì)胞的附著、擴(kuò)散能力以及細(xì)胞活力。然而，導(dǎo)電聚合物不易降解的特性限制了其在組織工程中的應(yīng)用。Kashi等[19]用吡咯低聚物開(kāi)發(fā)了一種新型可注射的導(dǎo)電水凝膠，該水凝膠具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和生物可降解性，良好的生物降解性能有助于其在心肌組織工程中的應(yīng)用。目前，可注射水凝膠因其可負(fù)載藥物和細(xì)胞的能力而受到廣泛關(guān)注[20-22]。作為在梗死區(qū)輸送細(xì)胞和藥物的載體，水凝膠可保護(hù)細(xì)胞和藥物免受惡劣微環(huán)境的侵害，這對(duì)新血管形成和心肌再生至關(guān)重要。然而，通過(guò)化學(xué)凝膠法制備的可注射導(dǎo)電水凝膠體系中通常含有殘留的單體、引發(fā)劑或交聯(lián)劑，而部分殘留劑如戊二醛對(duì)細(xì)胞有毒[23]。物理交聯(lián)可注射水凝膠由于細(xì)胞毒性較小受到了廣泛的關(guān)注，因此物理交聯(lián)可注射水凝膠的開(kāi)發(fā)將是未來(lái)研究心肌修復(fù)生物材料的一個(gè)重要方向。

1.2 導(dǎo)電納米纖維支架

組織工程支架的關(guān)鍵作用在于引導(dǎo)細(xì)胞黏附、擴(kuò)散、增殖以及促進(jìn)組織修復(fù)[24]。納米纖維可以仿生細(xì)胞外基質(zhì)的納米絲狀結(jié)構(gòu)，平均直徑為50～500 nm[12]。作為電刺激平臺(tái)，導(dǎo)電納米纖維支架能夠與細(xì)胞產(chǎn)生較好的相互作用，且其較高的比表面積可為細(xì)胞培養(yǎng)提供充足的空間[12]?；谶@些特點(diǎn)，納米纖維支架在心肌組織工程再生領(lǐng)域顯示出極為廣闊的應(yīng)用前景。

天然材料如蛋白質(zhì)或多糖因易于被細(xì)胞識(shí)別而受到再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注，用于組織工程支架的天然材料主要包括纖維素[25]、膠原[26]、天然絲[27-28]等。Tsui等[27]開(kāi)發(fā)了由絲素蛋白-PPy導(dǎo)電底物制成的具有生物相容性的心臟支架，該底物具有納米脊和凹槽的圖案，可模擬天然心肌細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)人多能干細(xì)胞源心肌細(xì)胞的生物學(xué)特性。然而，天然生物材料在用作心肌組織工程支架時(shí)要經(jīng)歷繁瑣的純化技術(shù)，并且其被用作異種移植物或同種異體移植物時(shí)可能誘發(fā)免疫反應(yīng)[29]。這些局限性促使研究者轉(zhuǎn)而探索合成生物材料。心肌組織工程支架制備中應(yīng)用最多的合成材料是聚酯類(lèi)人工合成高分子，包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)[30]和聚己內(nèi)酯(PCL)[11]等。Song等[30]將PGA外科縫合線設(shè)計(jì)成彈簧狀線圈(見(jiàn)圖2(a))，通過(guò)多巴胺涂層(DOPA)增加PPy的黏附力；在體外接種心肌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞沿著彈簧線圈軌道生長(zhǎng)，呈細(xì)長(zhǎng)形且出現(xiàn)高度定向的肌節(jié)，并伴隨心臟特異性蛋白α-肌動(dòng)蛋白和連接蛋白CX43的高表達(dá)(見(jiàn)圖2(b))；將其注入發(fā)生心肌梗死的小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，縮短分?jǐn)?shù)和射血分?jǐn)?shù)增大，梗死面積減小。在心肌組織工程研究中，將工程化的心肌組織植入體內(nèi)后需對(duì)其性能進(jìn)行監(jiān)測(cè)。聚偏二氟乙烯(PVDF)因其優(yōu)異的壓電性能、柔韌性和生物相容性而被用于監(jiān)測(cè)工程心臟組織的收縮[31]。Nofar等[31]制備了一種基于PVDF的纖維狀支架(見(jiàn)圖2(c))，其具有生物支架和傳感器的雙重功能，可測(cè)量由心臟組織產(chǎn)生的收縮，并且能夠?qū)⒍嗄芨杉?xì)胞分化為心肌細(xì)胞，通過(guò)心臟特異性蛋白的高表達(dá)和心臟收縮功能的改善促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟。然而，納米纖維支架較弱的力學(xué)性能限制了其在心肌修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用。通過(guò)改性提高納米纖維支架的力學(xué)性能將是未來(lái)開(kāi)發(fā)納米纖維支架的一個(gè)主要研究方向。

2 電刺激模型

研究發(fā)現(xiàn)，外加電刺激可使心肌組織產(chǎn)生響應(yīng)并達(dá)到同步收縮，而電信號(hào)的這種興奮-收縮耦合對(duì)心臟的功能發(fā)育有著重要的促進(jìn)作用[32]。電刺激會(huì)影響心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的產(chǎn)生與持續(xù)時(shí)間以及心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率，可增大具有自發(fā)搏動(dòng)能力的細(xì)胞比例，從而促進(jìn)細(xì)胞的同步跳動(dòng)[33]。電刺激模型主要包括直流電刺激和脈沖電刺激。

2.1 直流電刺激

直流電療法是使用低電壓平穩(wěn)直流電通過(guò)人體一定部位治療疾病的方法，是最早應(yīng)用的電療法之一。直流電刺激具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和引導(dǎo)細(xì)胞趨向的作用。對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行直流電刺激，可改變興奮細(xì)胞對(duì)Na+或Ca2+的通透性，從而產(chǎn)生動(dòng)作電位，促使細(xì)胞內(nèi)部的Na+、 K+離子通道發(fā)生變化而引起內(nèi)部環(huán)境的改變，最終改變細(xì)胞的狀態(tài)[34-35]。

Thrivikraman等[36]將細(xì)胞接種在PANI-GNP導(dǎo)電膜上并以100 mV/cm的直流電和脈沖電刺激觸發(fā)人間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)源性/心肌源性分化。結(jié)果表明：施加直流電刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+通過(guò)L型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞，該過(guò)程與神經(jīng)元Ca2+內(nèi)流同時(shí)發(fā)生，大多數(shù)人間充質(zhì)干細(xì)胞獲得更長(zhǎng)的絲狀延伸，并趨向神經(jīng)元定向分化；施加脈沖電刺激時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出遲滯的快速鈣瞬變，類(lèi)似參與調(diào)節(jié)肌肉基因表達(dá)的Ca2+信號(hào)，大多數(shù)人間充質(zhì)干細(xì)胞更傾向于心肌向分化。在上述條件培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞中，鈣反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)差異說(shuō)明這些鈣信號(hào)在驅(qū)動(dòng)細(xì)胞選擇性分化中發(fā)揮的作用不同?，F(xiàn)有研究較多使用脈沖電刺激探究電刺激對(duì)干細(xì)胞心肌向分化及心肌細(xì)胞成熟的作用。

(a) DOPA涂層的PPy/PGA三維心肌補(bǔ)片制備[30]

(b) 將DOPA涂層的PPy/PGA彈簧注入心肌梗塞小鼠體內(nèi)[30]

(c) 具有生物支架和傳感器雙重功能的PVDF心肌補(bǔ)片制備[31]

2.2 脈沖電刺激

脈沖電刺激根據(jù)電流方向是否改變分為單相脈沖和雙相脈沖。研究[37]表明，不同方向脈沖對(duì)心肌細(xì)胞的成熟和功能化作用有所不同。鄭麗娜等[38]對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞施加5 d單相脈沖(電壓為10 V、頻率為0.5 Hz、脈寬為5 ms)，結(jié)果顯示，由電刺激組胚胎干細(xì)胞分化得到的心肌樣細(xì)胞搏動(dòng)更快、更趨于一致，由胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到的心肌細(xì)胞的心肌肌鈣蛋白T(cTnT)熒光染色陽(yáng)性率更高。但是連續(xù)的單相脈沖會(huì)引起電極的直流極化進(jìn)而產(chǎn)生電化學(xué)副作用，易損傷細(xì)胞并腐蝕電極，而使用雙相脈沖可以避免這些問(wèn)題。Richards等[39]用雙相脈沖(電場(chǎng)強(qiáng)度為2.5 V/cm、頻率為1 Hz、脈寬為5 ms)電刺激人多能干細(xì)胞(hPSCs)源心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，電刺激促進(jìn)了間隙連接蛋白的表達(dá)，增加了hPSCs的自發(fā)搏動(dòng)頻率。為比較單相和雙相電場(chǎng)刺激對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響，Chiu等[40]設(shè)計(jì)了一種生物反應(yīng)器，通過(guò)對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞分別施加雙相方波脈沖(電場(chǎng)強(qiáng)度為2.5 V/cm、頻率為1 Hz、脈寬為1 ms)以及具有相同總幅度和持續(xù)時(shí)間的單相方波脈沖(電場(chǎng)強(qiáng)度為5 V/cm、頻率為1 Hz、脈寬為2 ms)，結(jié)果表明，雙相脈沖刺激組的細(xì)胞密度與同步收縮率更高，CX43的表達(dá)水平更高，但是雙相脈沖中的次級(jí)脈沖超級(jí)化可能會(huì)干擾動(dòng)作電位的啟動(dòng)[41]。

此外，通過(guò)優(yōu)化脈沖電刺激參數(shù)也可獲得更成熟、活性更強(qiáng)的體外心肌細(xì)胞。Tandon等[42]對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞施加脈沖電刺激時(shí)，通過(guò)改變電極材料、刺激幅度和頻率來(lái)確定最適合心臟組織工程的電刺激參數(shù)。結(jié)果表明，脈沖電刺激參數(shù)為碳電極、振幅3 V/cm和頻率3 Hz時(shí)，工程心臟組織的密度最高、cTnT和CX43表達(dá)最多、收縮作用最強(qiáng)。現(xiàn)有研究雖然已經(jīng)探究了脈沖電刺激參數(shù)對(duì)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，但未考慮脈沖電刺激參數(shù)對(duì)心肌細(xì)胞同步收縮的作用。因此，未來(lái)可通過(guò)結(jié)合灌注策略與電刺激促進(jìn)心肌組織的同步收縮。

3 電刺激促進(jìn)干細(xì)胞心肌向分化

干細(xì)胞是一類(lèi)具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的未分化細(xì)胞，是形成哺乳類(lèi)動(dòng)物各組織器官的原始細(xì)胞[43]。由干細(xì)胞分化而來(lái)的心肌細(xì)胞被視為建立心臟藥理模型及進(jìn)行心肌細(xì)胞治療最有希望的細(xì)胞來(lái)源。常見(jiàn)的干細(xì)胞來(lái)源包括胚胎干細(xì)胞(ESCs)、多能干細(xì)胞(PSCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)等[13]。研究表明，在電刺激和分化因子共同作用下，干細(xì)胞具有向心肌細(xì)胞分化的潛能，主要表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化、心臟轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加及細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高[44-50]。

3.1 電刺激作用下細(xì)胞形態(tài)的變化

干細(xì)胞在形態(tài)上具有共性，通常呈圓形或橢圓形，體積較小，細(xì)胞核較大且多為常染色質(zhì)，具有較高的端粒酶活性。人類(lèi)成年心肌細(xì)胞具有獨(dú)特的各向異性棒狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)寬比為7∶1。在干細(xì)胞心肌向分化過(guò)程中，電刺激作用使得心肌細(xì)胞形態(tài)拉長(zhǎng)，細(xì)胞表面積和體積增大[44]，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的成熟度發(fā)生變化。成年心肌細(xì)胞具有排列整齊的肌節(jié)結(jié)構(gòu)、較高的肌原纖維密度以及成熟的線性Z盤(pán)結(jié)構(gòu)[45]。

Wang等[45]研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯微片能促進(jìn)hPSCs分化為功能性心肌細(xì)胞，具體表現(xiàn)為石墨烯底物可改善心肌細(xì)胞的表型，即出現(xiàn)較多棒狀細(xì)胞，其中雙核細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且具有更成熟的線性Z盤(pán)結(jié)構(gòu)，并且肌原纖維密度顯著增加。上述石墨烯導(dǎo)電底物通過(guò)內(nèi)源電信號(hào)的刺激促進(jìn)了干細(xì)胞的心肌向分化，而外源電信號(hào)的刺激能更好地實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。Eng等[46]連續(xù)7 d對(duì)ESCs來(lái)源的心肌細(xì)胞分別施加0.5、 1.0、 2.0 Hz的脈沖電刺激，結(jié)果顯示：在超微結(jié)構(gòu)水平上，未刺激細(xì)胞的肌節(jié)短而無(wú)序；2.0 Hz電刺激組中細(xì)胞的肌原纖維平行排列，呈非常發(fā)達(dá)的條紋超微結(jié)構(gòu)，并且具有連續(xù)的厚肌節(jié)亞基的重復(fù)序列?，F(xiàn)有研究多是針對(duì)單獨(dú)內(nèi)源或單獨(dú)外源電信號(hào)對(duì)細(xì)胞分化的影響，而未對(duì)兩者的耦合作用做深入研究，因此，內(nèi)、外源電信號(hào)聯(lián)合刺激將是未來(lái)促進(jìn)干細(xì)胞心肌向分化的一個(gè)主要研究方向。

3.2 電刺激促進(jìn)心臟轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子是能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，近年來(lái)轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、 GATA-4、 cTnT、 SERCA、Tbx5和Hand2等陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[47]。其中，轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4與心臟發(fā)育有著密切聯(lián)系。Nkx2.5參與心臟的成形，包括右側(cè)環(huán)化、心腔分化以及心臟間隔功能成熟，在心臟發(fā)育和保持出生后心臟穩(wěn)態(tài)，特別是在心臟功能成熟以及工作心肌和心臟傳導(dǎo)的功能維持等方面起到重要作用[48]。GATA-4的表達(dá)對(duì)內(nèi)胚層的分化和腹部形態(tài)的成形而言必不可少，GATA-4蛋白水平過(guò)低將導(dǎo)致心肌細(xì)胞復(fù)制減少、心肌發(fā)育不全和心內(nèi)膜墊缺損[49]。

研究表明，電刺激可促進(jìn)干細(xì)胞分化過(guò)程中心臟轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Chan等[51]使用八通道C-Pace刺激器(電場(chǎng)強(qiáng)度為6.6 V/cm，脈沖頻率為1 Hz、脈寬為2 ms)在施加與未施加電場(chǎng)刺激的情況下，對(duì)培養(yǎng)了4 d的ESCs來(lái)源的心肌細(xì)胞進(jìn)行分子分析和功能分析，定量聚合酶鏈反應(yīng)顯示電刺激組SERCA、NKX2.5和GATA-4的高表達(dá)促進(jìn)了ESCs向心肌細(xì)胞的分化。研究表明，對(duì)接種在導(dǎo)電材料上的干細(xì)胞施加電刺激能更好地促進(jìn)心臟轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Ahadian等[52]將碳納米管嵌入小鼠胚狀體并使用C-Pace EP慢性細(xì)胞刺激器(電場(chǎng)強(qiáng)度為3 V/cm，脈沖頻率為1 Hz、脈寬為10 ms)電刺激小鼠干細(xì)胞，結(jié)果表明，未施加電刺激時(shí)載有碳納米管的小鼠胚狀體中Nkx2.5、cTnT、Myh7和GATA-4的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，施加電刺激后進(jìn)一步增強(qiáng)了心臟轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。然而目前尚不明確電刺激促進(jìn)心臟轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，未來(lái)仍需進(jìn)一步探究電刺激作用下心臟轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平變化的機(jī)理。

3.3 電刺激促進(jìn)活性氧水平升高

干細(xì)胞對(duì)電刺激反應(yīng)的一個(gè)重要機(jī)制是產(chǎn)生活性氧(ROS)，主要由NADPH-氧化酶催化產(chǎn)生。生成的ROS可促進(jìn)參與分化的其他信號(hào)分子的表達(dá)[53]。研究表明，在電刺激作用下ROS的激活是促使干細(xì)胞增殖和分化的重要因素[54]。Wolf-Goldberg等[55]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在生理溶液中施加較高電場(chǎng)強(qiáng)度的刺激時(shí)，在陽(yáng)極-電解質(zhì)界面會(huì)產(chǎn)生ROS和其他自由基。由此可見(jiàn)，暴露于電場(chǎng)刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高有助于干細(xì)胞的分化。

4 電刺激促進(jìn)心肌細(xì)胞的成熟和功能化

由干細(xì)胞分化而來(lái)的心肌細(xì)胞尚未完全成熟，將其移植到心肌梗死大鼠心臟后很難實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌梗死區(qū)域的修復(fù)。研究表明，電刺激能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞的成熟和功能化，具體表現(xiàn)為電刺激對(duì)心肌細(xì)胞體外功能的改善以及對(duì)心肌梗死大鼠心臟功能的修復(fù)。

4.1 電刺激對(duì)心肌細(xì)胞體外功能的影響

4.1.1 電刺激對(duì)心肌蛋白表達(dá)的影響

研究表明，在導(dǎo)電基質(zhì)上施加電刺激能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞的功能化，即心肌細(xì)胞的成熟和同步收縮。同步收縮能力主要基于心臟特異性蛋白如α-肌動(dòng)蛋白和CX43的表達(dá)[16]。α-肌動(dòng)蛋白可參與心肌細(xì)胞的成熟和肌肉收縮的調(diào)節(jié)；CX43蛋白是一種間隙連接蛋白，主要負(fù)責(zé)心肌細(xì)胞的電收縮偶聯(lián)和同步收縮。間隙連接蛋白的正常表達(dá)對(duì)心臟的同步搏動(dòng)和泵血功能起著重要作用[15]。發(fā)生心肌梗死后，心臟纖維化和心肌細(xì)胞中間隙連接表達(dá)的缺失致使間隙連接重塑，很可能導(dǎo)致心律不齊。提高CX43蛋白表達(dá)可減輕心肌梗死后心律失常的可能。

Radisic等[56]使用脈沖電信號(hào)(矩形、電場(chǎng)強(qiáng)度為5 V/cm、頻率為1 Hz、脈寬為2 ms)連續(xù)5 d刺激新生大鼠心肌細(xì)胞，結(jié)果表明，細(xì)胞的α-肌動(dòng)蛋白和CX43水平升高，收縮力和線粒體含量增加。此外，細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境也是影響心肌細(xì)胞功能化的重要因素。在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，生物材料的表面特性尤為重要，如表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和表面化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞行為起著決定作用。Au等[57]結(jié)合形貌和電刺激，在微槽聚苯乙烯上培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞顯現(xiàn)出成熟的跡象，并且細(xì)胞形態(tài)拉長(zhǎng)，在細(xì)胞-細(xì)胞接觸區(qū)域處出現(xiàn)了間隙連接。為更好地模擬細(xì)胞內(nèi)的三維環(huán)境，Wang等[58]將心肌細(xì)胞培養(yǎng)在三維生物材料上，結(jié)果表明，即使不施加電刺激，三維培養(yǎng)系統(tǒng)也能促進(jìn)與心肌功能相關(guān)蛋白的表達(dá)，而電刺激可使這些結(jié)果得到進(jìn)一步改善。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)電刺激和細(xì)胞微環(huán)境聯(lián)合作用的研究較少且不夠深入，未來(lái)可深入探究?jī)烧呗?lián)合作用對(duì)細(xì)胞功能化的作用。

4.1.2 電刺激作用下Ca2+濃度的變化

在成熟的心臟組織中，電信號(hào)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)、外的離子交換激活，并通過(guò)間隙連接傳播[59]。作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的第二信使，Ca2+具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、參與細(xì)胞信號(hào)跨膜傳遞和介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)外界刺激的應(yīng)答等作用。在正常狀態(tài)下Ca2+主要存在于細(xì)胞外，而細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+濃度很低[60]。

心肌梗死模型中，鈣穩(wěn)態(tài)遭到嚴(yán)重破壞，鈣處理蛋白的改變及超微結(jié)構(gòu)的改變影響了鈣瞬變，繼而影響鈣信號(hào)和心臟收縮功能。在心肌梗死過(guò)程中，肌漿網(wǎng)釋放的鈣減少且不規(guī)律[59]。研究表明，適宜的電刺激可使細(xì)胞外的Ca2+內(nèi)流從而使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高，即在外加周期性電場(chǎng)作用下，細(xì)胞膜去極化從而激活電壓門(mén)控型Ca2+通道，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加又加速了細(xì)胞膜的復(fù)極化[37]。Holt等[61]對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞施加脈沖(電場(chǎng)強(qiáng)度為2 V/cm、頻率為1 Hz、脈寬為5 ms)刺激4 d，結(jié)果顯示，刺激組的鈣釋放率比未刺激組高25.4%；Song等[62]將心肌細(xì)胞接種在PPy修飾的殼聚糖多孔膜(SP)上，結(jié)果表明，在SP上生長(zhǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的跳動(dòng)幅度和相對(duì)有節(jié)奏的Ca2+波動(dòng)和更高的Ca2+振幅?？傮w而言，電信號(hào)、鈣瞬變和細(xì)胞反應(yīng)之間存在一定聯(lián)系，但目前尚不明確電刺激介導(dǎo)的Ca2+增加的調(diào)控機(jī)制，因此仍需探究電刺激作用下Ca2+濃度變化的機(jī)理。

4.2 電刺激對(duì)心肌梗死大鼠心臟功能的影響

心肌細(xì)胞在體外發(fā)育成熟后，還要通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)觀察其對(duì)梗死大鼠心臟功能的影響。發(fā)生心肌梗死后，心臟功能逐步惡化，平均縮短分?jǐn)?shù)和射血分?jǐn)?shù)明顯降低，收縮期左心室內(nèi)部尺寸明顯擴(kuò)大，梗死大鼠的心室壁心肌完全被纖維化組織取代。研究表明，將體外經(jīng)電刺激培養(yǎng)成熟的心肌細(xì)胞植入心肌梗死大鼠心臟可增加平均縮短分?jǐn)?shù)和射血分?jǐn)?shù)，收縮期左心室內(nèi)部尺寸明顯減小，纖維化區(qū)域減弱，并且可以促進(jìn)血管再生[63]。

Cui等[20]用戊二醛將PPy與殼聚糖復(fù)合起來(lái)制得可注射導(dǎo)電水凝膠，將其注入冷凍損傷小鼠體內(nèi)可促進(jìn)損傷區(qū)域電信號(hào)的傳導(dǎo)并縮短心室除極持續(xù)時(shí)間。雖然現(xiàn)有心肌補(bǔ)片可通過(guò)傳導(dǎo)外部電刺激在一定程度上恢復(fù)心肌梗死部位的電信號(hào)傳導(dǎo)[64]，但其只考慮了靜態(tài)時(shí)心肌補(bǔ)片的導(dǎo)電性能與心肌組織的匹配性，忽略了導(dǎo)電心肌補(bǔ)片因心臟搏動(dòng)發(fā)生變形后相應(yīng)地會(huì)發(fā)生電阻變化，這會(huì)影響電信號(hào)的傳輸與心肌收縮的一致性?，F(xiàn)有研究中制備導(dǎo)電心肌補(bǔ)片最常用的方法是在心肌補(bǔ)片材料表面沉積導(dǎo)電層，但是導(dǎo)電高聚物材料因拉伸變形較小難以與心肌補(bǔ)片基材的拉伸性能匹配，致使拉伸時(shí)導(dǎo)電心肌補(bǔ)片往往出現(xiàn)導(dǎo)電層破裂現(xiàn)象，導(dǎo)致電阻發(fā)生變化，從而影響外部電信號(hào)傳輸[65]。未來(lái)可通過(guò)預(yù)拉伸、卷積法等賦予導(dǎo)電心肌補(bǔ)片蠕蟲(chóng)狀結(jié)構(gòu)、螺旋結(jié)構(gòu)和蛇形結(jié)構(gòu)等，以使導(dǎo)電心肌補(bǔ)片具有應(yīng)變不敏感性，從而具備導(dǎo)電穩(wěn)定性，更好地傳導(dǎo)外部施加電信號(hào)并恢復(fù)心肌梗死部位電信號(hào)的傳導(dǎo)。

5 結(jié)論與展望

本文總結(jié)了導(dǎo)電材料基電刺激平臺(tái)以及電刺激在干細(xì)胞心肌向分化和心肌修復(fù)中的應(yīng)用。電刺激的非藥物治療手段、安全、經(jīng)濟(jì)等積極特性使得電療法治療心肌梗死得到廣泛的關(guān)注。體內(nèi)、外試驗(yàn)結(jié)果表明，在導(dǎo)電基質(zhì)上施加電刺激可以增強(qiáng)在支架上培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的分化和成熟，主要表現(xiàn)為電刺激作用下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化、心臟轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)、ROS激活、心肌特異性蛋白表達(dá)上調(diào)、細(xì)胞內(nèi)相對(duì)有節(jié)奏的Ca2+波動(dòng)和更高的Ca2+振幅以及心肌梗死小鼠體內(nèi)射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)的提高。

將形貌或3D微環(huán)境和電刺激相結(jié)合可顯著促進(jìn)干細(xì)胞源心肌細(xì)胞的成熟，然而目前對(duì)這種聯(lián)合刺激的研究尚成熟，未來(lái)可更深入地探究細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境和電刺激對(duì)細(xì)胞的聯(lián)合作用。這種聯(lián)合刺激比單純電刺激顯示出更有益的效果，但是在模擬的細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境和天然心肌細(xì)胞微環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞的功能仍有一定差距。心臟本身是處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的力-電微環(huán)境中，因此力學(xué)刺激也是影響細(xì)胞功能的重要因素之一，力-電耦聯(lián)合刺激將是未來(lái)治療心肌梗死的一個(gè)重要手段。