細菌超聲分散計數(shù)儀在結(jié)核分枝桿菌最小抑菌濃度檢測中的應(yīng)用

郁晨蕾，江 淵，李 靜，王莉莉，陳 煒，沈旭暉，張陽奕

（上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測實驗室，上海 200336）

耐藥結(jié)核?。╮esistant tuberculosis，R-TB）的防治是我國結(jié)核病防治工作中的難題之一，隨著GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)在疑似肺結(jié)核病患者檢測中的廣泛應(yīng)用，越來越多的利福平耐藥結(jié)核?。╮ifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB）患者被確診[1]。一線、二線抗結(jié)核藥物的體外藥物敏感性試驗在個體患者的治療和人群結(jié)核病的防控中都起著重要作用[2]。TREK Sensititre MYCOTB藥敏板（簡稱MYCOTB，美國賽默飛世爾公司）可測定12種一線、二線抗結(jié)核藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），相較于傳統(tǒng)固體比例法藥物敏感性試驗，有著耗時少、單次可檢測多種藥物、藥物敏感性試驗結(jié)果更精細等優(yōu)點[3-5]。因MYCOTB在需要判讀多個孔內(nèi)細菌的生長情況時對細菌的接種量有著極其嚴格的要求，使其在臨床應(yīng)用上存在雙人判讀結(jié)果不一致和重復(fù)試驗結(jié)果不一致的問題。

MYCOTB操作手冊建議采用玻璃珠振蕩研磨法對菌株進行研磨分散，用配套濁度儀定量，菌懸液需要多次稀釋定量以達到目標濃度。接種于藥敏板的菌液終濃度受人為因素影響較大，多次稀釋容易產(chǎn)生大量氣溶膠，存在實驗室生物安全隱患。細菌超聲分散計數(shù)儀利用超聲波分散原理，可以實現(xiàn)細菌分散與濁度檢測的同步，快速、簡單、安全[6]。本研究將細菌超聲分散計數(shù)儀應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）藥物敏感性試驗，對比2種菌懸液制備方法的效果，通過肉眼觀察、抗酸染色鏡檢、藥敏板中菌落形態(tài)和藥物敏感性試驗結(jié)果，評估細菌超聲分散計數(shù)儀在MTB MIC檢測中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

以上海市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病檢測實驗室收集保藏的23株耐多藥MTB臨床菌株（編號1～23），5株全敏感MTB臨床菌株（編號24～28）為研究對象，MTB標準菌株H37Rv（ATCC 27294）由中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實驗室提供。

1.2 主要儀器與試劑

BACspreader 1100細菌超聲分散計數(shù)儀（簡稱1100分散儀，廣東體必康生物科技有限公司）；Sensititre微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，包括Vortex-Genie2多功能漩渦混合器（Cole-Parmer）、手工比濁儀、AIM-自動菌液接種系統(tǒng)、Vizion-自動微生物藥敏分析系統(tǒng)、MTB藥敏板（MYCOTB，含12種不同濃度抗結(jié)核藥物）、振蕩管（含玻璃珠和含0.5% Tween-80的0.9%NaCl溶液）、0.5麥氏單位標準管、0.9%NaCl溶液。

1.3 制備菌懸液

1.3.1 玻璃珠震蕩法 采用接種環(huán)挑取改良羅氏培養(yǎng)基（瑞士羅氏公司）斜面適量菌落，放入振蕩管中，在漩渦混合器中振蕩30 s，在室溫條件下靜置15 min后，放入手工比濁儀器中，滴加0.9%NaCl溶液混合及定量，調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥氏濁度。

1.3.2 分散儀法 采用接種環(huán)挑取改良羅氏培養(yǎng)基斜面適量菌落，放入含2 mL無菌0.9%NaCl溶液的超聲分散專用試管中，將試管放入1100分散儀，超聲分散30 s（超聲分散5 s，暫停5 s，實際對細菌超聲分散15 s）。按照儀器顯示屏上顯示的數(shù)字，加入相應(yīng)體積的0.9%NaCl溶液，調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥氏濁度。

1.4 藥物敏感性試驗

取100 μL制備好的菌懸液，加入11 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基（美國BD公司）中混勻，采用AIM-自動菌液接種系統(tǒng)分裝至96孔MYCOTB中，每孔100 μL。完成后將MYCOTB貼上封膜，放置在37 ℃溫箱中孵育。培養(yǎng)10 d后，采用Vizion-自動微生物藥敏分析系統(tǒng)判讀結(jié)果，并拍照保存。每個藥敏板都由雙人判讀，以第1個人的判讀結(jié)果為標準，第2個人的判讀結(jié)果用于評估2個人判讀結(jié)果的一致性。

1.5 質(zhì)量控制

每批藥物敏感性試驗均以MTB標準菌株H37Rv（ATCC 27294）作為質(zhì)控菌株。玻璃珠震蕩研磨法中，每批試驗前均用配套的0.5麥氏單位標準管對所用的比濁儀進行校準；分散儀法中所用的1100分散儀使用前均進行濁度校正。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS15.0軟件和Excel 2007軟件進行數(shù)理整理和分析。對2種方法制備菌懸液的MIC藥物敏感性試驗結(jié)果進行一致性檢測（Kappa檢驗），以Kappa值≥0.75為2種方法一致性較好。

2 結(jié)果

2.1 分散效果

應(yīng)用玻璃珠震蕩研磨法和分散儀法制備28株MTB臨床菌株和MTB標準菌株H37Rv（ATCC 27294）0.5麥氏濁度的菌懸液。肉眼觀察結(jié)果顯示，分散儀法制備的菌懸液比玻璃珠振蕩研磨法更均勻，無明顯大的菌落顆粒（圖1）。取2種方法制備的0.5麥氏濁度的菌懸液各1滴，紫外照射固定2 h后抗酸染色，顯微鏡下觀察，鏡下可見分散儀法制備的菌懸液比玻璃珠振蕩研磨法分散更均勻，細菌成團較少（圖2）。

圖1 2種方法制備的菌懸液分散效果比較

2.2 藥敏板中菌落形態(tài)

根據(jù)MYCOTB說明書要求，經(jīng)過10 d 37℃溫箱培養(yǎng)后，將MYCOTB放入Vizion-自動微生物藥敏分析系統(tǒng)進行結(jié)果判讀。結(jié)果顯示，相較于玻璃珠振蕩研磨法，分散儀法制備的菌懸液細菌生長活力更好，孔中細菌生長面積更大，結(jié)果更易判讀（圖3）。

圖3 2種方法制備的菌懸液在MYCOTB中的菌落形態(tài)

2.3 藥物敏感性試驗結(jié)果

28株MTB臨床菌株和MTB標準菌株H37Rv（ATCC 27294）的MIC值結(jié)果和藥物敏感性試驗比對結(jié)果顯示，2種不同前處理方法制備的菌懸液對12種一線和二線抗結(jié)核藥物（鏈霉素、異煙肼、乙胺丁醇、利福平、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、利福布汀、對氨基水楊酸、乙硫異煙胺、環(huán)絲氨酸和卡那霉素）的符合率均為100%，Kappa值均為1.00，僅有8株菌株的乙胺丁醇、2株菌株的環(huán)絲氨酸和3株菌株的卡那霉素的MIC值存在1個梯度的量化誤差。由于這些量化誤差均不處于MTB對各藥物的耐藥濃度附近，故不影響結(jié)果的判讀。見表1、表2。

表1 玻璃珠振蕩法和分散儀法制備菌懸液進行藥物敏感性試驗的MIC值 μg/mL

續(xù)表1

表2 2種方法制備的菌懸液藥物敏感性試驗結(jié)果比較 株

3 討論

菌懸液的制備和定量是MTB藥物敏感性試驗，尤其在MIC藥物敏感性試驗這類定量試驗中的關(guān)鍵操作[6]。目前，我國大多數(shù)結(jié)核病實驗室主要采用研磨棒研磨和玻璃珠振蕩的方法進行菌落分散，通過標準麥氏比濁管或比濁儀進行定量，多次加入含0.5%Tween-80的0.9%NaCl溶液進行逐步稀釋比對，最終獲得目標濃度的菌懸液。上述2種方法在研磨、多次稀釋混合中均會產(chǎn)生大量氣溶膠，存在生物安全隱患。同時，由于是手工操作，細菌懸浮液的均勻度受細菌研磨時間等人為因素影響，樣本個體之間存在很大差異，這也是影響藥物敏感性試驗結(jié)果的最常見的人為因素[7]。細菌超聲分散計數(shù)儀通過超聲波在液體中的空化作用來分散菌落，分散、濁度檢測和稀釋體積計算的整個過程在一個封閉的空間中完成[8]，不需要移動液體，減少了污染，最大程度地確保了生物安全性，并大大提高了效率。

本研究通過肉眼觀察、抗酸染色鏡檢、藥敏板中菌落生長形態(tài)和藥物敏感性試驗結(jié)果比對，對玻璃珠振蕩研磨法和分散儀法制備的菌懸液的藥物敏感性試驗結(jié)果進行評估。結(jié)果顯示，相較于玻璃珠振蕩研磨法，分散儀法對MTB分散得更均勻，無明顯大的菌落顆粒，且抗酸染色鏡檢未見明顯菌體聚集現(xiàn)象。有多項研究將手工研磨處理的菌懸液和分散儀處理的菌懸液進行比較，結(jié)果均顯示分散儀對微生物菌落的分散效果更好[6-8]。本研究比較了玻璃珠振蕩研磨法和分散儀法對菌落的分散效果，結(jié)果仍是分散儀的分散效果更均勻，說明應(yīng)用超聲波在液體中的空化作用來分散菌株的效果要遠優(yōu)于手工和機械物理研磨。馮通明等[6]的研究結(jié)果也證實了只要分散時間不超過120 s，超聲并不會影響菌體的生長活性。

本研究中，將采用2種方法制備的菌懸液接種于MYCOTB 37 ℃培養(yǎng)10 d后，接種分散儀法制備的菌懸液的藥敏板孔內(nèi)菌落面積更大，更便于檢測人員通過Vizion-自動微生物藥敏分析系統(tǒng)判讀結(jié)果。由于藥物敏感性試驗是定量試驗，MYCOTB需要檢測人員在1個視野下觀測96孔板中各個孔內(nèi)菌落的生長情況，這給MIC藥物敏感性試驗結(jié)果的判讀帶來挑戰(zhàn)。有研究結(jié)果顯示，MYCOTB存在雙人判讀結(jié)果不一致的情況[2]，分散儀法能很好地解決這一問題。這可能是由于分散儀法制備的菌懸液分散均勻，且無大顆粒菌塊，使得96孔板中每個孔內(nèi)細菌的接種菌量相對穩(wěn)定、分散，使得相同培養(yǎng)時間內(nèi)接種分散儀法制備的菌懸液的藥敏板孔內(nèi)菌落面積更大，提高了雙人判讀的一致率。

以美國臨床實驗室標準化協(xié)會液體培養(yǎng)基中抗結(jié)核藥物耐藥臨界濃度為耐藥判斷依據(jù)[9]，本研究2種菌懸液制備方法得到的藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，12種抗結(jié)核藥物的耐藥性結(jié)果符合率為100%；但有8株菌株的乙胺丁醇、2株菌株的環(huán)絲氨酸和3株菌株的卡那霉素2種方法制備的菌懸液藥物敏感性試驗的MIC值存在1個梯度的量化誤差。后續(xù)我們對這些存在1個梯度誤差的樣本進行了重復(fù)性試驗，發(fā)現(xiàn)玻璃珠振蕩研磨法制備的菌懸液的MIC值存在前后2次結(jié)果不一致的情況，而分散儀法的重現(xiàn)性則非常好。提示接種菌量的差異可能導(dǎo)致MIC檢出結(jié)果出現(xiàn)上下1個濃度差異的結(jié)果。國外也有研究結(jié)果顯示，在MYCOTB 藥物敏感性試驗中，增加或減少接種濃度會極大降低部分藥物MIC值的重現(xiàn)性[10]。由于臨床上耐受乙胺丁醇、鏈霉素、阿米卡星和莫西沙星這類抗結(jié)核藥物的菌株的耐藥濃度常處于判定耐藥與否的臨界濃度附近[11-12]，導(dǎo)致藥物敏感性試驗結(jié)果中的梯度誤差會造成上述藥物藥物敏感性試驗結(jié)果的誤判，所以分散儀法可提高藥物敏感性試驗這類定量試驗中接種菌量的精確性，增加MIC值處于臨界濃度的臨床菌株藥物敏感性試驗結(jié)果的準確性。

綜上所述，細菌超聲分散計數(shù)儀可以提高MTB菌懸液制備的自動化程度，尤其在藥物敏感性試驗這類定量試驗中，可改善接種菌量的精確度和結(jié)果判讀的一致性，減少人為因素引起的定量誤差，有利于檢測的標準化和重現(xiàn)性。