反應(yīng)型HClO/ClO-熒光探針的研究進展

安寧，高云玲

（浙江工業(yè)大學化學工程學院，浙江杭州310014）

在生產(chǎn)生活中，HClO/ClO-廣泛應(yīng)用在漂白劑、洗滌劑及飲用水消毒等方面[1-2]。HClO/ClO-過量將會產(chǎn)生三鹵甲烷（THMs），對人類及動植物造成嚴重危害[3]。生物體中的HClO/ClO-主要由過氧化氫和氯離子在髓過氧化酶（MPO）催化下合成，具有強氧化性、濃度極低和存在時間極短等特點，在抵御病原體、激活轉(zhuǎn)錄因子和維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡等方面發(fā)揮重要作用[4]。當HClO/ClO-濃度異常時，HClO/ClO-通過誘導細胞凋亡溶酶體[5]從而導致組織損傷并進一步引發(fā)多種病變，如關(guān)節(jié)炎[6]、心血管疾病[7]、神經(jīng)元變性[8]、癌癥[9]和腎臟疾病[10]等。因此，急需開發(fā)可視化、實時靈敏的檢測手段，實現(xiàn)對HClO/ClO-的原位監(jiān)測和機理研究，進一步探索相關(guān)疾病及其在生產(chǎn)生活中的作用途徑。

目前，檢測HClO/ClO-的方法通常有電化學測試、色譜分析、比色分析、核磁共振和熒光探針技術(shù)等[11-16]。其中熒光探針技術(shù)憑借響應(yīng)迅速、操作簡單、無創(chuàng)檢測、靈敏度和選擇性高等優(yōu)點，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡和小動物成像儀等精密儀器，作為一種可視化及研究復雜生物環(huán)境的分析工具，在檢測HClO/ClO-方面獲得了廣泛應(yīng)用[17-25]。

1 反應(yīng)型HClO/ClO-熒光探針的設(shè)計策略及反應(yīng)機制

熒光探針是建立在光譜化學、光學波導等學科的基礎(chǔ)上，將分析對象的分子信號轉(zhuǎn)化為熒光信號（熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光激發(fā)與發(fā)射波長等），有效表達分子識別的一類化學響應(yīng)分子[26-29]。依據(jù)熒光探針對分析對象的識別方式不同，熒光探針可分為傳統(tǒng)型熒光探針和反應(yīng)型熒光探針。傳統(tǒng)型熒光探針常用于中性大分子及陰離子的檢測，與分析對象通過非共價的相互作用（氫鍵、靜電作用、配位作用、疏水作用和范德華力等）相結(jié)合，進而改變熒光探針的熒光信號。傳統(tǒng)型熒光探針的識別過程在光譜變化中常表現(xiàn)為on-off-on或off-on-off的可逆變化。與傳統(tǒng)型熒光探針相比，反應(yīng)型熒光探針憑借不可逆性、特異性和生物正交性等優(yōu)勢，提高了其對分析對象的選擇性和靈敏度，通過熒光探針和具有較強化學活性（親電性、親核性和催化活性等）的分析對象間發(fā)生特異性化學反應(yīng)，引起熒光探針結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導致化學鍵的斷裂或者形成，從而實現(xiàn)對分析對象的有效檢測，在臨床醫(yī)學和環(huán)境科學等領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景（圖1）。

圖1 傳統(tǒng)型熒光探針與反應(yīng)型熒光探針

在HClO/ClO-中含有正電荷的氯原子易與負電荷的反應(yīng)位點生成氯化物，氯化物會進一步發(fā)生水解、加成、消除或氧化等反應(yīng)，從而改變探針分子的光譜信號。基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer，ICT）[30]、熒 光 共 振 能 量 轉(zhuǎn) 移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）[31]、聚集誘導發(fā)光（aggregate induced emission，AIE）[32]、跨鍵能量轉(zhuǎn)移（through bond energy transfer，TBET）[33]和激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（excited state intramolecular proton transfer，ESIPT）[34]等識別機理，反應(yīng)型HClO/ClO-熒光探針結(jié)合反應(yīng)機制（碳碳雙鍵的反應(yīng)、硫族化合物的反應(yīng)、醛肟基團的反應(yīng)、腙/席夫堿的反應(yīng)、酰肼/磺酰肼的反應(yīng)、N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯的反應(yīng)和苯硼酸/硼酸酯的反應(yīng)），誘導熒光探針的共軛結(jié)構(gòu)及電子分布等發(fā)生變化，進而達到對HClO/ClO-的特異性檢測（表1和圖2）。

圖2 反應(yīng)型熒光探針利用HClO/ClO-引發(fā)的反應(yīng)（R為熒光團）

表1 反應(yīng)型HClO/ClO-熒光探針的比較

2 反應(yīng)型熒光探針在HClO/ClO-中的應(yīng)用

2.1 基于HClO/ClO-誘導碳碳雙鍵的反應(yīng)

在鄰位不飽和共軛體系中，飽和碳碳雙鍵作為識別基團，可以延長共軛結(jié)構(gòu)，使熒光發(fā)射波長紅移。在HClO/ClO-氧化作用下，雙鍵發(fā)生反應(yīng)形成醛基和環(huán)氧化合物等基團，改變了探針分子的結(jié)構(gòu)，導致熒光強度改變或發(fā)射波長的位移。

Liu等[35]設(shè)計合成了BODIPY基比率熒光次氯酸探針1（圖3）。該探針通過引入季銨基團，賦予了探針水溶性。在PBS緩沖體系（pH=7.4）中，HClO氧化碳碳雙鍵形成了雙醛BODIPY分子，導致熒光發(fā)射藍移62nm（629nm藍移至567nm），紅色的熒光變?yōu)殚偕?，檢測限為31.6nmol/L。同時，探針實現(xiàn)了在L929細胞中對次氯酸的可視化檢測。

圖3 探針1識別HClO的機理[35]

Wu等[36]基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程，設(shè)計合成了識別線粒體內(nèi)次氯酸根比率熒光探針2（圖4）。苯并噻唑陽離子基團既為探針提供了水溶性，又擔當著線粒體定位作用。探針2在410nm激發(fā)時，探針的非輻射能量由供體（香豆素基團）轉(zhuǎn)移至受體（苯并噻唑陽離子基團），呈現(xiàn)受體的橙色熒光（λex=580nm）；當加入次氯酸根，C==C雙鍵被氧化斷裂生成醛基，苯并噻唑部分脫落，熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程消失，表現(xiàn)為探針2與ClO-結(jié)合前后熒光量子產(chǎn)率分別為0.85和0.014，藍移的綠色熒光（λex=480nm）。該探針選擇性好，檢測限為41.8nmol/L，在RAW264.7細胞線粒體內(nèi)可實現(xiàn)對ClO-的成像，與商用Mito Tracker Deep Red的共定位系數(shù)達到0.91。Wang等[37]以吩噻嗪-香豆素為熒光基團，制備了具有線粒體靶向定位功能的比率次氯酸根熒光探針3（圖4）。在PBS（pH=7.4，10mmol/L，含1mmol/L聚乙二醇辛基苯基醚）中，隨著ClO-的加入，探針的熒光量子產(chǎn)率由0.233增加至0.392，熒光發(fā)射峰從629nm藍移至463nm，熒光顏色由紅色變?yōu)樗{色。探針3對ClO-具有Stokes位移大（209nm）、響應(yīng)迅速、檢測限低等優(yōu)點。此外，探針3和Mito Tracker Deep Red的共定位系數(shù)達到0.94，在RAW 264.7細胞線粒體內(nèi)實現(xiàn)了ClO-熒光成像。

圖4 探針2和3識別ClO-的機理[36-37]

Hu等[38]以苯并吲哚陽離子為線粒體定位基團，通過碳碳雙鍵連接芘熒光團，獲得了大Stokes位移（107nm）比色比率熒光探針4（圖5），實現(xiàn)了HeLa細胞線粒體內(nèi)ClO-的成像檢測。隨著烯烴雙鍵（C==C）氧化裂解為1-芘甲醛，探針525nm處吸收峰消失，溶液由紅色變?yōu)闊o色，紅光變?yōu)樗{光，熒光發(fā)射峰由632nm藍移至455nm。Zhang等[39]以吲哚陽離子為線粒體定位基團，合成了雙光子off-on型比色熒光探針5（圖5）。探針5對次氯酸根響應(yīng)迅速，Stokes位移大（150nm），選擇性好，靈敏度達到13.2nmol/L。在PBS體系（10mmol/L，pH=7.4）中，隨著次氯酸根的加入，紅色探針溶液不斷變淡至無色，綠色熒光強度增加16.3倍（λex=365nm，λem=514nm）。探針5應(yīng)用在HeLa細胞線粒體ClO-雙光子熒光成像。

圖5 探針4和5識別ClO-的機理[38-39]

Yan等[40]基于環(huán)氧化反應(yīng)，合成了大Stokes位移（190nm）比率熒光探針6（圖6），用于實時檢測RAW264.7細胞產(chǎn)生的ClO-。探針的烯烴雙鍵受到Cl+攻擊，形成的碳正離子與電子供體（酚羥基）發(fā)生反應(yīng)，生成環(huán)氧化合物。當加入7倍濃度的ClO-，探針510nm處吸收峰消失，610nm處熒光藍移至478nm，紅色熒光變?yōu)樗{光。共定位實驗表明二乙胺和酚羥基形成的p-π共軛效應(yīng)，抵消吡啶鹽的正電荷，使探針6對溶酶體和脂滴具有較高的靶向性，而對線粒體的靶向性較差。Yang等[41]報道了一種基于七甲川菁染料的近紅外比色熒光探針7（圖6），實現(xiàn)了在自來水中檢測HClO。隨著探針與HClO發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)，探針在630nm處吸收峰消失，藍色溶液變?yōu)榉奂t色。Li等[42]基于丙二腈對ClO-的特異性識別，獲得了雙光子比率次氯酸根熒光探針8（圖6）。隨著ClO-濃度的增加，探針583nm熒光藍移至499nm，并應(yīng)用在活細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）中次氯酸鹽的特異性成像及“AND型”分子邏輯門。

圖6 探針6～8識別HClO/ClO-的機理[40-42]

Gao等[43]以碳碳雙鍵為識別基團，嗎啉基團為溶酶體定位基團，合成了水溶性比色淬滅型熒光探針9（圖7），應(yīng)用在HeLa細胞溶酶體內(nèi)ClO-的熒光成像。次氯酸鈉中的Cl+進攻碳碳雙鍵，導致吡咯和苯并噻唑具有推拉作用的共軛體系遭到破壞，引起綠色熒光消失，熒光量子產(chǎn)率由0.28降低至0.05，顏色由黃色變?yōu)闊o色（λex=465nm，λem=520nm）。

圖7 探針9識別ClO-的機理[43]

2.2 基于HClO/ClO-誘導硫族化合物（S、Se和Te）的反應(yīng)

含硫族化合物（S、Se和Te）的熒光探針易被HClO/ClO-氧化生成相應(yīng)的氧化物，引起熒光或紫外可見光譜信號的變化?；谂まD(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移、聚集誘導發(fā)光、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移和光致電子轉(zhuǎn)移等識別機理，含硫族元素的熒光探針廣泛應(yīng)用于檢測次氯酸鹽。

Vedamalai等[44]基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，合成了turn-on型近紅外比色熒光探針10（圖8），應(yīng)用在RAW264.7細胞ClO-的熒光成像。ClO-通過氧化硫原子強化吩噻嗪基團與BODIPY形成具有推拉作用的共軛體系，使熒光量子產(chǎn)率由0.003增強至0.216，探針634nm處吸收峰藍移至587nm，藍色溶液變?yōu)樽仙l(fā)出紅色熒光。Wang等[45]結(jié)合扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，制備了吩噻嗪-BODIPY基近紅外比色比率熒光探針11（圖8），應(yīng)用在HepG2細胞實現(xiàn)雙通道ClO-熒光成像。在乙腈/PBS體系中，吩噻嗪基團與共軛平面發(fā)生扭轉(zhuǎn)，抑制探針熒光。隨著硫原子在吩噻嗪基團中氧化為亞砜結(jié)構(gòu)，熒光量子產(chǎn)率由0.01增加至0.28，藍色溶液變?yōu)樽仙?，探針發(fā)出紅光并對ClO-具有優(yōu)異的紫外吸收（A578/A640）和熒光吸收（I599/I660）。此外，探針11的響應(yīng)速度（10s）遠快于探針10，而探針10的檢測限（4.1nmol/L）低于探針11。

圖8 探針10和11識別ClO-的機理[44-45]

Song等[46]報道了大Stokes位移（168nm）雙功能吩噻嗪基比色熒光探針12（圖9）。硫原子被ClO-氧化為亞砜結(jié)構(gòu)，淡黃色探針溶液逐漸變淡至無色，同時黃綠色熒光變?yōu)榍嗌?，熒光量子產(chǎn)率由0.051增加至0.074。在水相/丙酮中，隨著水相質(zhì)量分數(shù)（0～25%）增加，吸電子基團（醛基）繞單鍵扭轉(zhuǎn)，引發(fā)扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，抑制探針熒光。探針12成功應(yīng)用在PC12細胞中實現(xiàn)ClO-熒光成像和商業(yè)產(chǎn)品中檢測水含量。

圖9 探針12識別ClO-的機理[46]

Jin等[47]以硫醚基團為識別基團，獲得了BODIPY基水溶性熒光探針13（圖10），并在HeLa細胞中實現(xiàn)了次氯酸的熒光成像。2-甲基吡啶鹽有效提高了探針的水溶性。探針的甲基巰基苯氧基作為硼原子上的反應(yīng)中心，取代氟原子，引發(fā)光誘導電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)，進而淬滅探針熒光。向PBS緩沖溶液（pH=7.4）中加入次氯酸，硫醚基團被氧化形成亞砜結(jié)構(gòu)，阻斷了光誘導電子轉(zhuǎn)移過程，探針524nm處吸收峰紅移至537nm，熒光發(fā)射波長由545nm紅移至562nm，熒光量子產(chǎn)率由0.0013增強至0.22，發(fā)出綠色熒光。

圖10 探針13識別HClO的機理[47]

Choi等[48]基于硒化物易被次氯酸鹽氧化為硒氧化物[49-51]，制備了硒醚修飾的熒光素基turn-on型比色熒光探針14（圖11），用于測定自來水中次氯酸鹽。硒化物到熒光素母體的光致電子轉(zhuǎn)移抑制探針熒光。隨著探針被ClO-氧化為硒氧化物，光致電子轉(zhuǎn)移過程消失，表現(xiàn)為粉紅色探針溶液變成淺黃色并發(fā)出綠色熒光（λex=500nm，λem=519nm）。

圖11 探針14識別ClO-的機理[48]

Shi等[52]依據(jù)碲化物易被次氯酸根氧化為碲氧化物，合成了BODIPY基off-on型熒光探針15（圖12），通過共聚焦熒光顯微鏡對RAW 264.7細胞中的次氯酸根進行熒光成像。碲原子具有孤對電子并存在由二苯基碲化物到BODIPY染料的光致電子轉(zhuǎn)移，導致熒光淬滅。當碲原子被ClO-氧化，探針中止光致電子轉(zhuǎn)移過程，熒光量子產(chǎn)率由0.02增強至0.32并發(fā)出綠色熒光（λex=470nm，λem=515nm）。

圖12 探針15識別ClO-的機理[52]

2.3 基于HClO/ClO-誘導醛肟基團的反應(yīng)

醛肟基團是醛基的保護基團，可以作為HClO/ClO-的識別基團?；谔结樈Y(jié)構(gòu)和HClO/ClO-用量不同，HClO/ClO-可以將醛肟基團氧化為相應(yīng)的醛、羧酸或腈氧化物。

Gao等[53]結(jié)合醛肟基團合成了aza-BODIPY基近紅外次氯酸根熒光探針16（圖13），實現(xiàn)了RAW264.7細胞內(nèi)HClO的熒光成像。探針16本身是無熒光的，經(jīng)HClO氧化為腈氧化物，引起探針的熒光發(fā)射光譜峰位由660nm紅移至667nm，熒光量子產(chǎn)率由0.0012增加至0.0094，發(fā)出強烈的紅色熒光信號。Xu等[54]引入醛肟基團，以吡啶三苯胺和BODIPY為熒光團，制備了比色次氯酸根熒光探針17（圖13）。醛肟基團被HClO氧化為醛基，紫色探針溶液變?yōu)榫G色，熒光量子產(chǎn)率由0.02增加至0.43，熒光強度增加20倍并發(fā)出黃色熒光（λex=450nm，λem=520nm）。此外，該探針成功應(yīng)用在自來水中檢測次氯酸。

圖13 探針16和17識別HClO的機理[53-54]

Hu等[55]設(shè)計合成了香豆素基比色熒光探針18（圖14），應(yīng)用在A549細胞中成像ClO-。隨著次氯酸根將醛肟基團氧化為腈氧化物，探針的熒光發(fā)射波長由506nm藍移至465nm，綠光變?yōu)樗{光，黃色溶液變成無色。Han等[56]報道了高靈敏度（8.3nmol/L）香豆素基水溶性熒光探針19（圖14）用于檢測RAW264.7細胞和水溶液中的ClO-。醛肟基團被次氯酸根氧化為醛基，熒光量子產(chǎn)率由0.07增至0.55，探針發(fā)出藍色熒光（λex=358nm，λem=460nm）。

圖14 探針18和19識別ClO-的機理[55-56]

Li等[57]合成了兩種檢測線粒體內(nèi)ClO-的咔唑基雙光子熒光探針20和21（圖15）。吡啶陽離子基團既發(fā)揮線粒體定位功能，又增加探針的水溶性。隨著醛肟基團變?yōu)殡嫜趸铮结?0的熒光強度增加14.1倍并發(fā)出黃色熒光（λex=422nm，λem=546nm）。探針20對次氯酸根具有Stokes位移大（130nm）、響應(yīng)迅速、選擇性好的優(yōu)勢。同時，探針20應(yīng)用在CHO細胞線粒體內(nèi)ClO-雙光子熒光成像，與線粒體染料（mitotracker red FM）的共定位系數(shù)為0.9。Guo等[58]獲得了萘二甲酰亞胺基熒光探針22（圖15），應(yīng)用在小鼠單核巨噬細胞中成像內(nèi)源性ClO-。探針22對ClO-的Stokes位移大（75nm），選擇性好。探針與ClO-反應(yīng)后，探針吸收峰從465nm藍移至435nm，熒光量子產(chǎn)率由0.006增加至0.389，無色熒光變?yōu)榫G光（λex=370nm，λem=510nm）。另外，探針22的響應(yīng)速度（3s）遠快于探針20及21，探針22的檢測限（2.88nmol/L）也低于探針20及21。探針20及21應(yīng)用在線粒體內(nèi)檢測ClO-，而探針22無法實現(xiàn)在細胞器中檢測ClO-。

圖15 探針20～22識別ClO-的機理[57-58]

2.4 基于HClO/ClO-誘導腙/席夫堿的反應(yīng)

腙基易被ClO-氧化，因此含有腙基修飾的熒光探針可用于識別次氯酸根。二氨基馬來腈（DAMN）作為ClO-特異性反應(yīng)官能團，當加入次氯酸根，DAMN部分脫落，改變探針的共軛體系，從而引起光譜性質(zhì)改變[59-64]。

Li等[65]基于C==N異構(gòu)化抑制探針熒光，制備了BODIPY基比色次氯酸根熒光探針23（圖16）。ClO-氧化2,4-二硝基苯基腙形成單醛BODIPY分子，導致探針吸收峰由543nm藍移至505nm，熒光量子產(chǎn)率由0.059增強至0.56，粉紅色溶液變?yōu)槌壬l(fā)出綠色熒光（λex=470nm，λem=515nm）。此外，探針23應(yīng)用在HeLa細胞中ClO-的熒光成像和自來水中檢測ClO-。類似地，Tang等[66]以2,4-二硝基苯基腙為識別基團，合成了turn-on型熒光探針24（圖16），應(yīng)用在RAMOS細胞中ClO-的檢測。當加入10倍濃度的次氯酸鈉，探針的C==N鍵氧化為醛基，氰聯(lián)苯熒光團釋放出來，無色熒光變?yōu)榫G光（λex=420nm，λem=528nm）。

圖16 探針23和24識別ClO-的機理[65-66]

Zhao等[67]以菲并咪唑為熒光團，合成了高靈敏度（14nmol/L）熒光探針25（圖17），實現(xiàn)了HeLa細胞外源性ClO-的熒光成像。ClO-氧化C==N鍵為醛基，導致DAMN基團脫落，探針發(fā)出藍光（λex=340nm，λem=410nm）。Tang等[68]制備了比率次氯酸根熒光探針26（圖17）。向HEPES（50mmol/L，pH=7.4）中加入10倍濃度的次氯酸鈉，熒光發(fā)射波長藍移107nm（由607nm藍移至500nm），熒光量子產(chǎn)率由0.166增加至0.186，熒光顏色由紅色變?yōu)榫G色。探針26在RAMOS細胞內(nèi)對ClO-實現(xiàn)了熒光成像以及在水體中檢測ClO-。Li等[69]以DAMN為識別基團，以萘酰亞胺衍生物為熒光團，獲得了次氯酸根熒光探針27（圖17）。DAMN基團引發(fā)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，抑制探針熒光。當加入次氯酸鈉，隨著DAMN基團離去，探針的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程消失，發(fā)出藍色熒光（λex=365nm，λem=440nm）。此外，探針27實現(xiàn)了在RAW 264.7細胞中成像ClO-。

圖17 探針25～27的分子結(jié)構(gòu)[67-69]

2.5 基于HClO/ClO-誘導酰肼/磺酰肼的反應(yīng)

類似于硫族化合物，酰肼/磺酰肼中的氮原子發(fā)揮著活性中心的作用。酰肼/磺酰肼與HClO/ClO-反應(yīng)形成醛基和羧酸等基團，引起探針結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，誘導熒光信號改變。

Gao等[70]以苯磺酰肼為識別基團，合成了aza-BODIPY基近紅外熒光探針28（圖18），實現(xiàn)了小鼠單核巨噬細胞中進行內(nèi)源性和外源性次氯酸熒光成像。當C==N雙鍵被次氯酸氧化斷裂為醛基，隨著苯磺酰肼基團脫落，探針的熒光量子產(chǎn)率由0.0045增強至0.073，648nm處熒光增強且發(fā)出紅色熒光。

圖18 探針28識別HClO的機理[70]

He等[71]以2-羥基苯甲酰肼為識別基團，制備了基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的比色比率香豆素基熒光探針29（圖19），應(yīng)用在MRC-5細胞和斑馬魚細胞中對ClO-的可視化檢測。香豆素熒光團通過π鍵連接2-羥基苯甲酰肼，形成推拉作用的共軛體系。當ClO-破壞共軛體系，隨著2-羥基苯甲酰肼脫落，探針532nm熒光藍移至470nm，綠光變?yōu)樗{光，顏色也由黃色變?yōu)闊o色。Tang等[72]以喹唑啉酮衍生物為熒光團，獲得了檢測RAMOS細胞中ClO-的高靈敏度（11.4nmol/L）比色熒光探針30（圖19）。向乙醇/PBS體系中加入3倍濃度的ClO-，熒光發(fā)射波長由560nm藍移至520nm，溶液顏色由無色變?yōu)辄S色，粉色熒光變?yōu)樗{光。Cho等[73]以4-甲基苯磺酰肼為識別基團，合成了熒光探針31（圖19），應(yīng)用在檢測自來水中的次氯酸根。探針與次氯酸根反應(yīng)，誘導酰肼基團氧化水解，釋放2-乙?；?6-甲氧基萘熒光團，綠色熒光強度增加76倍（λex=310nm，λem=443nm），檢測限為20nmol/L。

圖19 探針29～31的分子結(jié)構(gòu)[71-73]

Liu等[74]通過碳氮雙鍵連接銥配合物，合成了turn-on型熒光探針32（圖20），應(yīng)用在HeLa細胞中檢測次氯酸鹽。該探針通過引入銥配合物[75-82]，賦予探針良好的光物理性能。Ir(Ш)中心向4-甲基苯磺酰肼存在的光誘導電子轉(zhuǎn)移（PET）抑制探針熒光。次氯酸根引發(fā)氧化反應(yīng)，使4-甲基苯磺酰肼脫落，誘導探針發(fā)出黃色熒光（λex=360nm，λem=574nm），熒光量子產(chǎn)率由0.05增至0.19。Yi等[83]利用異煙肼修飾銥配合物，獲得了檢測線粒體內(nèi)次氯酸根的探針33（圖20）。當加入30倍濃度的次氯酸鈉，隨著異煙肼基團氧化為羧酸，探針592nm處熒光增加100倍，發(fā)出橙色熒光。探針33在4T1細胞線粒體內(nèi)對ClO-進行熒光成像，與商用線粒體染料（MTG）共定位系數(shù)為0.83。另外，探針32對ClO-的響應(yīng)速度（15s）快于探針33，探針33的檢測限（20.5nmol/L）低于探針32。

圖20 探針32和33識別ClO-的機理[74,83]

2.6 基于HClO/ClO-誘導N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯的反應(yīng)

作為HClO/ClO-識別受體的N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯（DMTC）可經(jīng)過反應(yīng)生成酚羥基[84]。受到這種反應(yīng)的啟發(fā)，實現(xiàn)對HClO/ClO-的高特異性和超靈敏度檢測。

Liu等[85]以N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯（DMTC）為識別基團，獲得了大Stokes位移（140nm）近紅外熒光探針34（圖21），實現(xiàn)在RAW264.7細胞中ClO-的可視化檢測。探針與次氯酸鈉反應(yīng)后，DMTC與ClO-反應(yīng)生成氧負離子。由于酚羥基是一個強烈的給電子體，使分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移增強，探針吸收波長紅移（463nm紅移至555nm），發(fā)出紅色熒光（λex=545nm，λem=685nm）。

圖21 探針34識別ClO-的機理[85]

Shi等[86]合成了識別溶酶體內(nèi)次氯酸的香豆素基熒光探針35（圖22）。嗎啉基團既是溶酶體定位基團，又是氫離子結(jié)合位點。探針35對HClO靈敏度高（24.3nmol/L）、選擇性好、響應(yīng)迅速（＜5s）。隨著次氯酸的加入，N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯經(jīng)裂解生成酚羥基，熒光量子產(chǎn)率由0.001增至0.22。在酸性條件下，由于酚羥基和嗎啉基團的質(zhì)子化，探針發(fā)出藍色熒光，吸收波長由345nm紅移至405nm。探針35與LysoTracker Deep Red的共定位系數(shù)為0.914，在HeLa細胞溶酶體內(nèi)實現(xiàn)HClO熒光成像。Liu等[87]設(shè)計合成了大Stokes位移（約115nm）次氯酸熒光探針36（圖22）。當次氯酸存在時，隨著N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯脫落，探針熒光強度增加227倍，熒光量子產(chǎn)率由0.028增至0.371，發(fā)出藍色熒光（λex=400nm，λem=505nm）。該探針靈敏度高（3.3nmol/L）、響應(yīng)迅速（＜5s）、水溶性好，在RAW264.7細胞和斑馬魚細胞中成像HClO。Liu等[88]以N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯為識別基團，獲得了雙光子近紅外次氯酸熒光探針37（圖22），應(yīng)用到發(fā)炎小鼠細胞中HClO的雙光子熒光成像。探針與次氯酸反應(yīng)后，探針溶液發(fā)出紅色熒光（λex=550nm，λem=603nm）。此外，探針37的檢測限（0.9nmol/L）遠低于探針35和36，但探針37的響應(yīng)速度（60s）慢于探針35及36。

圖22 探針35～37的分子結(jié)構(gòu)[86-88]

Du等[89]以香豆素和萘二甲酰亞胺為熒光團，以N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯和硼酸酯為識別基團，首次設(shè)計合成了雙位點識別ClO-和H2O2熒光探針38（圖23）。N,N-二甲基硫代氨基甲酸酯為ClO-識別基團，硼酸酯為H2O2識別。探針38對3種反應(yīng)（ClO-、H2O2和ClO-+H2O2）具有較高的靈敏度（ClO-：LOD=28.2nmol/L；H2O2：LOD=64.6nmol/L）和選擇性，可應(yīng)用于HeLa細胞中ClO-和H2O2的檢測。

圖23 探針38識別ClO-/H2O2的機理[89]

2.7 基于HClO/ClO-誘導苯硼酸/硼酸酯的反應(yīng)

基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，次氯酸根和苯硼酸/硼酸酯反應(yīng)形成供電子性能較強的酚羥基，誘導HOMO-LUMO能級差改變，導致探針的光物理性質(zhì)發(fā)生變化。

Wang等[90]以苯硼酸為識別基團，合成了水溶性比色熒光探針39（圖24），應(yīng)用在試紙中檢測次氯酸根。隨著次氯酸根的加入，探針39的吸電子基團（—BOH2）反應(yīng)生成給電子基團（—OH），探針的供電子能力增強，導致吸收光譜和發(fā)射光譜紅移，淺綠色溶液變成橙色。雙氰基異佛爾酮（DSP）衍生物具備發(fā)射波長長[91]、Stokes位移大等優(yōu)點?；诖?，Lan等[92]以雙氰基異佛爾酮衍生物為熒光團，合成了大Stokes位移（160nm）近紅外比率熒光探針40（圖24），實現(xiàn)了斑馬魚細胞內(nèi)對ClO-的可視化檢測。隨著苯硼酸反應(yīng)轉(zhuǎn)化為酚羥基，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移增強，探針422nm吸收峰紅移至490nm，熒光量子產(chǎn)率由0.019增加至0.066，黃色溶液變?yōu)榧t色，熒光發(fā)射波長紅移70nm（由582nm紅移至652nm）并發(fā)出紅色熒光。

圖24 探針39和40識別ClO-的機理[90,92]

Shu等[93]以硼酸酯為識別基團，設(shè)計合成了近紅外比色熒光探針41（圖25），應(yīng)用在RAW264.7細胞中對ClO-進行識別成像。在PBS中，隨著次氯酸根將硼酸酯轉(zhuǎn)化為酚羥基，探針吸收峰紅移54nm（406nm紅移至460nm），淡黃色溶液變成紅色，發(fā)出紅色熒光（λex=560nm，λem=610nm）。

圖25 探針41識別ClO-的機理[93]

3 結(jié)語

近年來，反應(yīng)型熒光探針在檢測HClO/ClO-方面取得了重要進展，但設(shè)計和應(yīng)用仍面臨巨大挑戰(zhàn)。例如，大多數(shù)反應(yīng)型熒光探針對細胞內(nèi)HClO/ClO-的檢測是PMA（佛波酯）和LPS（酯多糖）長時間誘導下實現(xiàn)的，并且僅有少量反應(yīng)型熒光探針實現(xiàn)在細胞器中靶向檢測HClO/ClO-，此外用于活體檢測HClO/ClO-的反應(yīng)型熒光探針實例仍然較少。反應(yīng)型HClO/ClO-熒光探針將朝著以下幾個方面發(fā)展：①設(shè)計對HClO/ClO-具有優(yōu)異選擇性和靈敏度的識別基團，同時通過結(jié)構(gòu)修飾改善反應(yīng)型HClO/ClO-熒光探針的水溶性；②拓展反應(yīng)型HClO/ClO-熒光探針的激發(fā)發(fā)射波長到近紅外區(qū)，以降低或消除背景熒光的影響；③研究turn-on型、turn-off型和比率型HClO/ClO-熒光探針的激活性響應(yīng)，并且探索HClO/ClO-在生理條件下的氧化還原機理。

隨著對反應(yīng)型HClO/ClO-熒光探針研究的不斷深入，反應(yīng)型HClO/ClO-熒光探針有望在環(huán)境科學、生物成像以及疾病診斷等領(lǐng)域得到進一步應(yīng)用與發(fā)展。